Tài liệu Nghiên cứu phân lập, xây dựng quy trình định lượng flavonoid trong nguyên liệu, cao chiết an xoa (helicteres hirsuta lour.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- BỘ Y TẾ TRẦN NGỌC ĐAN THANH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TRONG NGUYÊN LIỆU, CAO CHIẾT AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- BỘ Y TẾ TRẦN NGỌC ĐAN THANH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TRONG NGUYÊN LIỆU, CAO CHIẾT AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS Ngô Thị Thanh Diệp PGS. TS Trần Anh Vũ Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2018 Luận văn Thạc sĩ Dược học. Khóa 2016 – 2018 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TRONG NGUYÊN LIỆU, CAO CHIẾT AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) Học viên: Trần Ngọc Đan Thanh Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Ngô Thị Thanh Diệp PGS. TS Trần Anh Vũ Mở đầu Gần đây theo kinh nghiệm dân gian, người dân sử dụng cây An xoa trong điều trị bệnh gan, chống tiêu chảy, diệt khuẩn, trị rắn cắn, một số trường hợp ung thư gan và bước đầu có tác dụng khả quan. Vì thế với mong muốn tạo cơ sở khoa học về cây An xoa để cho ra sản phẩm chất lượng nên, đề tài “Nghiên cứu phân lập, xây dựng quy trình định lượng flavonoid trong nguyên liệu, cao chiết An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)” với các mục tiêu cụ thể như sau: chiết xuất, phân lập được chất đánh dấu flavonoid từ cao cồn chiết từ phần thân trên mặt đất cây An xoa. Xây dựng qui trình định lượng flavonoid trong nguyên liệu và cao An xoa. Điều chế cao An xoa có hàm lượng flavonoid cao. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Toàn cây trên mặt đất của cây An xoa Helicteres hirsuta Lour. , được thu hái tại Bình Phước vào tháng 03/2017. Phương pháp nghiên cứu Cao toàn phần An xoa tiến hành lắc chiết lần lượt với các dung môi như n-hexan, cloroform, ethyl acetat thu cao ethyl acetat. Sử dụng các kỹ thuật sắc ký để phân lập các chất đánh dấu từ cao ethyl acetat. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng chất đánh dấu trong dược liệu và trong cao An xoa bằng phương pháp HPLC. Khảo sát tối ưu hóa quy trình điều chế cao An xoa có hàm lượng chất đánh dấu tốt nhất. Tiến hành điều chế cao để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao An xoa. Kết quả và bàn luận Kết quả phân lập thu được 7,4’-di-O-methylisoscutellarein với độ tinh khiết HPLC 98,66 % và tilirosid với độ tinh khiết HPLC 99,82 %. Đã xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tilirosid trong An xoa bằng phương pháp HPLC với cột sắc ký Zorbax Eclipse XDB-C18 (5 µm, 250 mm x 4,6 mm), thể tích tiêm mẫu 10 µl, nhiệt độ cột 30 oC, tốc độ dòng 1 ml/phút, pha động ACN - nước (27 : 73) với mẫu dược liệu và ACN - nước (24 : 76) với mẫu cao An xoa, bước sóng phát hiện 314 nm. Đã khảo sát được điều kiện tối ưu điều chế cao An xoa có hàm lượng tilirosid cao từ dược liệu bằng phương pháp ngấm kiệt bằng ethanol 70 % với tỉ lệ dịch chiết : dược liệu là 6,5 : 1, dịch chiết được cô đến cao đặc bằng tủ sấy ở 60 oC trong khoảng 4 - 6h đến khi đạt độ ẩm quy định. Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở để đánh giá chất lượng dược liệu và cao An xoa. Kết luận Qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài đã đạt được các mục tiêu đề ra. Với những kết quả đạt được là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của cây An xoa sau này. Master’s thesis of Pharmacy. Academic course 2016-2018 STUDY ON ISOLATION, QUANTITATIVE DETERMINATION OF FLAVONOID IN PLANT AND EXTRACT FROM Helicteres hirsuta Lour. Tran Ngoc Dan Thanh Supervisor: Associate Professor. Ngo Thi Thanh Diep Associate Professor. Tran Anh Vu Introduction Recently, in Viet Nam folk medicine, people used Helicteres hirsuta Lour. in treatment liver disease, diarrhea, antibacterial, snakebite treatment, some cases of liver cancer. Therefore, to create a science basis about Helicteres hirsuta to make quality products, the topic of “Study on isolation, quantitative determination of makers in dry raw plant and extract from Helicteres hirsuta Lour.” was conducted with objectives such as: extraction, isolation of flavonoid makers from Helicteres hirsuta; quantitative determination of isolated makers in dry plant and herbal extract; preparation Helicteres hirsuta extract had high flavonoid concentration. Materials and Methods Materials: Dried aerial part of Helicteres hirsuta were collected in Binh Phuoc province, Viet Nam in March 2018, removed physical impurities, grinded to the partical size 2 mm. Methods: Helicteres hirsuta ethanol extract was distributed extracting liquid-liquid with increasing polarization solvents such as n-hexan, cloroform, ethyl acetat respectively. Using the chromatography techniques to isolate makers from ethyl acetat extract. Base on the isolated makers, determinate quantitative of its by HPLC method in dry raw plant and extract from Helicteres hirsuta Lour. and optimization the extracting process of Helicteres hirsuta to have extract with high maker’s concentration and establishment of standards for this. Result and discussion Isolated 39 mg 7,4’-di-O-methylisoscutellarein with 98,66 % purity by HPLC method and 43 mg tilirosid with 99,82 % purity by HPLC method. Method for the quantification tilirosid was determinated and validated by HPLC method with column chromatography Zorbax Eclipse XDB-C18 (5 µm, 250 mm x 4,6 mm), the sample injection volume 10 µl, the temperature column 30 oC, flow rate 1 ml/min, mobile phase ACN - water (27 : 73) for dried plant and ACN - nước (24 : 76) for extract, detection wavelength 314 nm. The preparative process of Helicteres hirsuta extract was optimized with high tilirosid concentration from dry plant by percolation method with ethanol 70 %, ratio liquid extract:dry plant was 6 : 1, liquid extract was dried by universal oven at 60 oC for 4 - 6h. Obtained extract was established of standards. Conclusion Through the process of research, this research has achieved objectives. These results are the allowed for further research on the chemical components as well as its pharmacological effects in the future. i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. TP. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 09 năm 2018 Tác giả luận văn Trần Ngọc Đan Thanh ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với PGS.TS. Ngô Thị Thanh Diệp PGS.TS. Trần Anh Vũ, những người Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn. Tôi xin trân trọng gửi đến lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Khoa Dược, bộ môn Kiểm nghiệm, bộ môn Dược liệu đã hết lòng tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................... ii MỤC LỤC ............................................................................................ iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ .................................................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................... x ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................ 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................. 3 1.1 Dược liệu An xoa .................................................................................. 3 1.1.1 Giới thiệu chung ...................................................................... 3 1.1.2 Thành phần hóa học cây An xoa .............................................. 4 1.1.3 Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý .................................... 6 1.2 Chiết xuất - phân lập ........................................................................... 10 1.2.1 Một số phương pháp chung về chiết xuất dược liệu................ 10 1.2.2 Một số công trình nghiên cứu chiết xuất phân lập tilirosid từ các loài của cây An xoa .................................................................. 11 1.3 Một số nghiên cứu về xây dựng quy trình định lượng tilirosid trong dược liệu ..................................................................................................... 13 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 18 2.1.1 Nguyên vật liệu .............................................................................. 18 2.1.2 Dung môi, hóa chất, tá dược .......................................................... 18 2.1.3 Trang thiết bị .................................................................................. 18 2.1.4 Nơi thực hiện .................................................................................. 19 2.1.5 Xử lý số liệu ................................................................................... 19 iv 2.2 Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 20 2.2.1 Chiết xuất phân lập chất đánh dấu trong dược liệu An xoa ........... 20 2.2.2 Xây dựng quy trình định lượng chất đánh dấu trong dược liệu, cao chiết An xoa ............................................................................................ 23 2.2.3 Điều chế cao An xoa ...................................................................... 30 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................... 36 3.1 Chiết xuất phân lập chất đánh dấu trong dược liệu An xoa .................. 36 3.1.1 Chiết xuất dược liệu An xoa .......................................................... 36 3.1.2 Phân lập và tinh chế chất đánh dấu ................................................ 36 3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học của LD1 ............................................... 45 3.1.4 Xác định cấu trúc hóa học của LD2 ............................................... 51 3.2 Xây dựng quy trình định lượng tilirosid trong dược liệu, cao chiết An xoa...... 57 3.2.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tilirosid trong dược liệu An xoa .............................................................................................. 57 3.2.2 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tilirosid trong cao chiết An xoa ............................................................................................ 68 3.3 Điều chế cao An xoa ............................................................................. 75 3.3.1 Xây dựng một số tiêu chuẩn dược liệu An xoa ............................. 75 3.3.2 Các thí nghiệm thăm dò ................................................................. 77 3.3.3 Tìm điều kiện phù hợp để điều chế dịch chiết An xoa .................. 78 3.3.4 Điều chế cao đặc An xoa ............................................................... 81 3.3.5 Xây dựng tiêu chuẩn cao An xoa ................................................... 82 CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN .............................................................................. 85 4.1 Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế chất đánh dấu ..................... 85 4.2 Xây dựng và thẩm định tilirosid trong dược liệu và cao An xoa.......... 85 4.3 Điều chế cao An xoa ............................................................................. 86 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 88 v TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 90 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên Nghĩa Tiếng Việt BĐM DĐVN D DMSO Bình định mức Dược điển Việt Nam Đỉnh đôi trong NMR DEPT DPPH GPT GOT HPLC IC IR J MeOH MS NMR PDA Ppm RSD SKC SKLM SKĐ S TCCS UV VS Dược điển Việt Nam Doublet Dimethyl sulfoxid Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Glutamat pyruvat transaminase Glutamat Oxaloacetat Transaminase High-performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography Nồng độ tối thiểu gây ức Inhibitory Concentration chế Infrared Hồng ngoại Hằng số ghép trong NMR Methanol Mass Spectroscopy Khối phổ Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân Photodiode array Dãy quang điện Parts per million Phần triệu Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng Sắc ký đồ Sắc ký đồ Singlet Đỉnh đơn trong NMR Tiêu chuẩn cơ sở Tiêu chuẩn cơ sở Ultraviolet Tử ngoại Vanillin sulfuric vii DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ Trang Bảng 1.1 Một số hợp chất có trong cây An xoa ................................................ 5 Bảng 1.2 Hoạt tính gây độc tế bào ED50 (µg/ml) của các hợp chất trong cây An xoa ....... 7 Bảng 1.3 Hàm lượng tilirosid trong một số loài thực vật được xác định bằng HPLC .....16 Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong chiết xuất và kiểm nghiệm .............................18 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong chiết xuất và kiểm nghiệm ................................19 Bảng 2.3 Các dung dịch chuẩn dùng thẩm định tính tuyến tính của quy trình định lượng chất đánh dấu trong dược liệu An xoa ......................................................................................27 Bảng 2.4 Các dung dịch chuẩn dùng thẩm định tính tuyến tính của quy trình định lượng chất đánh dấu trong cao An xoa............................................................... 272 Bảng 2.5 Kế hoạch thử nghiệm ..........................................................................................31 Bảng 2.6 Tiêu chuẩn chất lượng cao An xoa ................................................................34 Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất cao ethyl acetat từ cây An xoa..............................36 Bảng 3.1 Kết quả thu các phân đoạn từ cao ethyl acetat qua sắc ký cột............38 Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết LD1 bằng HPLC .....................................41 Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết LD2 bằng HPLC .....................................44 Bảng 3.4 So sánh dữ liệu phổ 1H (500 MHz, DMSO) và 13C NMR (125 MHz, DMSO) của LD1 với tilirosid ................................................................................49 Bảng 3.5 So sánh dữ liệu phổ 1H (500 MHz, DMSO) và 13C NMR (125 MHz, DMSO) của LD2 với 7,4’-di-O-methylisoscutellarein hay 5,8- dihydroxy-7,4’-dimethoxy-flavon .....................................................................................55 Bảng 3.6 Diện tích pic tilirosid trong dược liệu An xoa được chiết bằng methanol 45 %, 70 %, 100 % ..............................................................................................58 Bảng 3.7 Diện tích pic tilirosid trong dược liệu An xoa được chiết ở các nhiệt độ 30 oC, 45 oC, 60 oC ...........................................................................................................59 viii Bảng 3.8 Diện tích pic tilirosid trong dược liệu An xoa được chiết ở các khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút và 40 phút ............................................59 Bảng 3.9 Diện tích pic tilirosid trong các dịch chiết..................................................60 Bảng 3.10 Kết quả sắc ký của dung dịch chuẩn với 6 lần tiêm mẫu ...................61 Bảng 3.11 Kết quả sắc ký của dung dịch thử với 6 lần tiêm mẫu ........................62 Bảng 3.12 Kết quả tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chất đánh dấu tilirosid ......................................................................................................................64 Bảng 3.13 Kết quả sắc ký thẩm định độ lặp lại của phương pháp .......................65 Bảng 3.14 Kết quả sắc ký thẩm định độ chính xác trung gian của phương pháp ................................................................................................................................................66 Bảng 3.15 Kết quả sắc ký thẩm định độ đúng của phương pháp ..........................67 Bảng 3.16 Kết quả sắc ký của dung dịch chuẩn với 6 lần tiêm mẫu ...................68 Bảng 3.17 Kết quả sắc ký của dung dịch thử với 6 lần tiêm mẫu ........................69 Bảng 3.18 Kết quả tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chất đánh dấu tilirosid ......................................................................................................................72 Bảng 3.19 Kết quả sắc ký thẩm định độ lặp lại của phương pháp .......................73 Bảng 3.20 Kết quả sắc ký thẩm định độ chính xác trung gian của phương pháp ................................................................................................................................................74 Bảng 3.21 Kết quả sắc ký thẩm định độ đúng của phương pháp ..........................74 Bảng 3.22 Kết quả kiểm tra độ ẩm, tạp chất và tro toàn phần dược liệu ...........75 Bảng 3.23 Kết quả định lượng tilirosid trong dược liệu An xoa...........................76 Bảng 3.24 Một số chỉ tiêu của dược liệu An xoa ........................................................77 Bảng 3.25 Kết quả thăm dò phương pháp chiết...........................................................77 Bảng 3.26 Kết quả thăm dò nồng độ dung môi chiết ................................................78 Bảng 3.27 Kết quả thăm dò tỉ lệ dịch chiết : dược liệu.............................................78 Bảng 3.28 Các yếu tố khảo sát và khoảng thay đổi....................................................79 Bảng 3.29 Bảng ma trận bố trí thí nghiệm và kết quả ...............................................79 ix Bảng 3.30 Các thí nghiệm ở mức cơ bản........................................................................80 Bảng 3.31 Kết quả tối ưu theo phương pháp Box-Wilson ......................................80 Bảng 3.32 Kết quả thăm dò nhiệt độ làm khô dịch chiết bằng tủ sấy .................81 Bảng 3.33 Kết quả mất khối lượng do làm khô của cao ..........................................82 Bảng 3.34 Kết quả định lượng tilirosid trong cao An xoa.......................................83 Bảng 3.35 Tiêu chuẩn cơ sở cho cao An xoa................................................................83 x DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Thân, lá và hoa cây An xoa ................................................................ 3 Hình 1.2 Các hợp chất lignan phân lập từ cây An xoa..............................................12 Hình 1.3 Sắc ký đồ tách tilirosid bằng phương pháp RP - HPLC ........................14 Hình 1.4 Sắc ký đồ mẫu thử ở bước sóng 254 nm (1. caffein, 2. acid pcoumaric, 3. acid ferulic, 4. hyperosid, 5. tilirosid, 6. isoquercitrin) ..................15 Hình 1.5 Sắc ký đồ mẫu thử Latham (Rubus idaeus) (1. caffein, 2. acid pcoumaric, 3. acid ferulic, 4. hyperosid, 5. tilirosid, 6. isoquercitrin) ..................15 Hình 3.1 Kết quả sắc ký đồ với hệ cloroform - methanol - acid acetic (9 : 1 : 0,1).....37 Hình 3.2 Sắc ký đồ SKLM các phân đoạn từ cao ethyl acetat qua sắc ký cột ........38 Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC điều chế phân đoạn IV ..............................................................39 Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC phân đoạn IV.1 (hoạt chất LD1) ..................................40 Hình 3.5 Phổ 3D của hoạt chất LD1.................................................................................41 Hình 3.6 Phổ UV của hoạt chất LD1 ...............................................................................41 Hình 3.7 Sắc ký đồ SKLM hoạt chất LD2 .....................................................................42 Hình 3.8 Sắc ký đồ HPLC hoạt chất LD2 .............................................................................43 Hình 3.9 Phổ 3D của hoạt chất LD2.................................................................................44 Hình 3.10 Phổ UV-Vis của hoạt chất LD2 ....................................................................44 Hình 3.11 Phổ MS của LD1.................................................................................................45 Hình 3.12 Phổ IR của LD1 ...................................................................................................45 Hình 3.13 Phổ 1H (500 MHz, DMSO) của LD1..........................................................47 Hình 3.14 Phổ 13C NMR (125 MHz, DMSO) của LD1 ...........................................48 Hình 3.15 Cấu trúc hóa học của tilirosid (LD1) ..........................................................51 Hình 3.16 Phổ MS của LD2.................................................................................................51 Hình 3.17 Phổ IR của LD2 ...................................................................................................52 Hình 3.18 Phổ 1H (500 MHz, DMSO) của LD2..........................................................53 xi Hình 3.19 Phổ 13C NMR (125 MHz, DMSO) của LD2 ...........................................54 Hình 3.20 Cấu trúc hóa học của 7,4’-di-O-methylisoscutellarein hay 5,8dihydroxy-7,4’-dimethoxy-flavone (LD2) .....................................................................56 Hình 3.21 Phổ UV-Vis của tilirosid .................................................................................57 Hình 3.22 Sắc ký đồ mẫu thử với hệ pha động ACN - acid acetic 0,2 % (25 : 75) ..........57 Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu thử với hệ pha động ACN - nước (27 : 73) ...............58 Hình 3.24 Sắc ký đồ đại diện của dung dịch chuẩn 20 µg/ml................................61 Hình 3.25 Sắc ký đồ đại diện của dung dịch thử .........................................................62 Hình 3.26 Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu trẻn mẫu thử dược liệu ...............63 Hình 3.27 Phổ UV của tilirosid trong dung dịch chuẩn ...........................................63 Hình 3.28 Phổ UV của tilirosid trong dung dịch thử .................................................63 Hình 3.29 Đường tuyến tính của chất đánh dấu tilirosid .........................................64 Hình 3.30 Sắc ký đồ đại diện của dung dịch chuẩn 34 µg/ml................................68 Hình 3.31 Sắc ký đồ đại diện của dung dịch thử........................................................69 Hình 3.32 Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu trẻn mẫu thử cao ...........................70 Hình 3.33 Phổ UV của tilirosid trong dung dịch chuẩn ...........................................70 Hình 3.34 Phổ UV của tilirosid trong dung dịch thử .................................................71 Hình 3.35 Đường tuyến tính của chất đánh dấu tilirosid .........................................72 Hình 3.36 Sắc ký đồ của chất đánh dấu tilirosid phân lập được ...........................76 Hình 3.37 Sắc ký đồ của tilirosid trong nguyên liệu An xoa..................................76 Hình 3.38 Sắc ký đồ của chất đánh dấu tilirosid phân lập được ...........................82 Hình 3.39 Sắc ký đồ của tilirosid trong cao An xoa ..................................................83 1 Luận văn thạc sỹ dược học Trần Ngọc Đan Thanh ĐẶT VẤN ĐỀ Phát triển thuốc có nguồn gốc tự nhiên đang là xu thế của thế giới và cả ở Việt Nam. Các loài thuốc có nguồn gốc tự nhiên thường ít gây tác hại, phù hợp với sinh lý của cơ thể nên được sử dụng ngày càng rộng rãi hơn. Do vậy, nghiên cứu và đưa vào sử dụng những cây thuốc mới là một công việc rất quan trọng và thiết thực. Gần đây theo kinh nghiệm dân gian, người dân sử dụng cây An xoa trong điều trị bệnh gan, chống tiêu chảy, diệt khuẩn, trị rắn cắn, một số trường hợp ung thư gan và bước đầu có tác dụng khả quan. Một số doanh nghiệp trong nước đã đầu tư trồng với số lượng lớn để cung cấp cho thị trường như: Công ty thảo dược Tấn Phát, Công ty cổ phần trà thảo dược Đức Thịnh-cây thuốc nam… Hiện nay, một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đã nghiên cứu về cây An xoa đã được công bố. Vào năm 2006, Young - Won Chin và các cộng sự đã tiến hành phân lập được 6 lignan trong cây An xoa và đã được chứng minh tác dụng chống lại một số tế bào ung thư trên người, mở ra triển vọng về một cây thuốc mới [18]. Theo kết quả nghiên cứu của Võ Sỹ Nhật đã phân lập được tilirosid, tuy nhiên ở lượng nhỏ [3]. Năm 2005, Yeria Koteswara RAO và cộng sự đã chứng minh tác dụng sinh học của tilirosid có khả năng ức chế mạnh mẽ GPT và GOT do đó có tác dụng bảo vệ tế bào gan. Hợp chất này còn có khả năng chống oxy hóa và kháng viêm đã được thử nghiệm in vitro và in vivo cho kết quả tốt [13]. Vì thế với mong muốn tạo cơ sở khoa học về cây An xoa để cho ra sản phẩm chất lượng, đề tài “Nghiên cứu phân lập, xây dựng quy trình định lượng flavonoid trong nguyên liệu, cao chiết An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau: - Chiết xuất, phân lập được chất đánh dấu flavonoid từ cao cồn chiết từ phần thân trên mặt đất cây An xoa. 2 Luận văn thạc sỹ dược học Trần Ngọc Đan Thanh - Xây dựng qui trình định lượng flavonoid trong nguyên liệu và cao An xoa. - Điều chế cao An xoa có hàm lượng flavonoid cao. 3 Luận văn thạc sỹ dược học Trần Ngọc Đan Thanh CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dược liệu An xoa 1.1.1 Giới thiệu chung - Tên khoa học: Helicteres hirsuta Lour. - Tên Việt Nam: dó lông, tổ kén cái, tổ kén lông, thâu kén long [20]. - Theo hệ thống phân loại của Armen Takhtajan (1997), cây An xoa thuộc họ cẩm quỳ Malvaceae, chi Helicteres và loài Helicteres hirsuta Lour. thuộc ngành ngọc lan (Magnoliophyta), lớp ngọc lan (Magnoliopsida), bộ cẩm quỳ (Malvales), họ cẩm quỳ (Malvaceae) [2], [20], [21]. Hình 1.1 Thân, lá và hoa cây An xoa - Phân bố: cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) thường gặp ở những khu rừng, bụi rậm. Loài này phân bố chủ yếu ở Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam) và nhiều nước Nam Á: Việt Nam, Campuchia, Ấn Độ, Lào, Malaysia, Philippin, Thái Lan. Ở nước ta, cây mọc rất phổ biến ở nhiều nơi: Bình Phước, Lâm Đồng, Tây Nguyên, Đà Nẵng và ở các tỉnh miền núi phía bắc. Đặc biệt trồng nhiều ở Bình Phước. Ra hoa kết quả từ tháng 7 đến tháng 11 [21]. 4 Luận văn thạc sỹ dược học Trần Ngọc Đan Thanh - Đặc điểm thực vật: An xoa là loài cây bụi cao 1 - 3 m, nhánh hình trụ, có lông, lá hình trái xoan dài 5 - 17 cm, rộng 2,5 - 7,5 cm, gốc cụt hay hình tim, đầu thon thành mũi nhọn, mép có răng không đều, mặt dưới màu trắng, cả hai mặt phủ đầy lông, cuống lá dài 0,8 - 4 cm, có lông, dễ rụng. Cụm hoa là những bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá. 1.1.2 Thành phần hóa học cây An xoa * Các nghiên cứu thế giới Theo nghiên cứu của Chen JC về chi Helicteres thì thành phần hóa học của các loài trong chi này khá phong phú, trong đó đặc biệt chú ý là nhóm các chất flavonoid và quinon [8]. Năm 2006, một nghiên cứu của bộ môn Hóa dược và Dược liệu – khoa Dược, Đại học Ohio, Hoa Kỳ, cành của cây An xoa xuất xứ Indonesia có chứa các lignan: [±]-pinoresinol, [±]-medioresinol, [±]-syringaresinol, [-]- boehmenan, [-]-boehmenan H và [±]-trans-dihydrodiconiferylalcolhol [18]. Năm 2017, X. Gao và công sự đã phân lập 4,4’-sulfinylbis(2-(tert-butyl)-5methylphenol) và 2 dẫn chất nhóm flavon từ cao chiết methanol 7,4’-di-Omethylisoscutellarein và 7-O-methylisoscutellarein [17]. * Các nghiên cứu tại Việt Nam Năm 2016, Đồng Quỳnh Như và cộng sự nghiên cứu tiến hành phân lập trên cao phân đoạn diethyl ether, ethyl acetat và n-butanol đã thu được 5 chất tinh khiết từ cao DE (stigmasterol và acid 3-O-acetyl betulinic), 1 chất tinh khiết từ cao ethyl acetat (5,8-dihydro-7,4’-dimetoxyflavon), 2 chất tinh khiết từ cao n-butanol (3,5-dihydroxy-7,4’-dimethoxyflavon và sorbifolin). Trong đó 5,8-dihydro-7,4’-dimetoxyflavon được đánh giá là có hoạt tính chống oxy hóa khá cao với giá trị IC50 xác định được là 27 µg/mL [4]. Năm 2016, Võ Sỹ Nhật bằng các phương pháp sắc ký đã phân lập được từ phần thân trên mặt đất của cây An xoa một flavonoid glycosid và xác định 5 Luận văn thạc sỹ dược học Trần Ngọc Đan Thanh được cấu trúc của hợp chất này là tilirosid (Kaempferol 3-O-β-D(6’’-E-pcoumaroyl)-glucopyranosid) [3]. Năm 2016, Nguyễn Hữu Duyên nghiên cứu trên cây An xoa cũng đã phân lập được các hợp chất: stigmasterol, acid betulinic, apigenin, tilirosid, 7,4 ’-diO-methyl-8-O-sulphate isoscutellarein từ cao chiết với dicloromethan [1]. Bảng 1.1 Một số hợp chất có trong cây An xoa [1] STT Hoạt chất 1 Tilirosid 2 Stigmasterol Công thức cấu tạo