Tài liệu Nghiên cứu phân lập và giám định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn streptococcus suis gây viêm phổi lợn tại thái nguyên

1 TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA NÔNG - LÂM - NGƢ NGUYỄN LAN HƢƠNG TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HOÁ CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY VIÊM PHỔI LỢN TẠI THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Ngành: Thú Y Phú Thọ, 2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA NÔNG - LÂM - NGƢ NGUYỄN LAN HƢƠNG TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HOÁ CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY VIÊM PHỔI LỢN TẠI THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Ngành: Thú Y NGƢỜI HƢỚNG DẪN: PGS. TS. CAO VĂN Ths: PHAN THỊ PHƢƠNG THANH Phú Thọ, 2018 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trƣờng đến nay, em đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy cô ở khoa Nông - Lâm - Ngƣ Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với công ty CP thuốc thú y Marphavet đã tạo điều kiện cho em để em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo thực tập này. Và em xin chân thành cám ơn thầy PGS.TS Cao Văn đã nhiệt tình hƣớng dẫn hƣớng dẫn em hoàn thành tốt khóa thực tập. Trong quá trình thực tập, do trình độ lý luận cũng nhƣ kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp Thầy, Cô để em học thêm đƣợc nhiều kinh nghiệm. Em xin chân thành cảm ơn! Phú Thọ, ngày 10, tháng 05, năm 2018 Sinh viên thực hiện Nguyễn Lan Hƣơng ii DANH MỤC VIẾT TẮT S. suis Streptococus suis Cs Cộng sự CP Cổ phần VP Voges Proskauer HIP Thuỷ phân Hippuric acid ESC Esculin PYRA Pyrrolidonyl Arylamidase GAL Galactosidase GUR Glucuronidase GAL Galactosidase PAL Alkaline Phosphatase LAP Leucine Amino Peptidase ADH Arginine Dihydrolase RIB Ribose ARA Arabinose MAN Mannitol SOR Sorbitol LAC Lactose TRE Trehalose INU Inulin RAF Raffinose AMD Amidon GLYG Glycogen TT Thể trọng CPS Capsule polysaccharide Bp Base pair PCR Polymerase Chain Reaction iii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1. Trình tự Nucleotide của CPS 21 2 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR (từ khuẩn lạc) 22 3 Bảng 2.5. Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh (NCCLS - 2002) [29] 24 4 Bảng 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Streptococcus suis 27 5 Bảng 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của những chủng phân lập đƣợc 28 6 Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra đặc tính nuôi cấy vi khuẩn S.suis 30 7 Bảng 4.4. Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập đƣợc bằng hệ thống API 20 Strep 32 8 Bảng 4.5. Kết quả PCR 34 11 Bảng 4.6. Kết quả xác định đƣợc triệu chứng điển hình của lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra Bảng 4.7. Kết quả xác định đƣợc bệnh tích điển hình của lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra Bảng 4.8. Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn 12 Bảng 4.9. Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị 9 10 iv 35 36 38 39 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 3.1. Cách tiến hành nhuộm Gram 19 2 Hình 3.2 . Hệ thống API 20 Strep 21 3 Hình ảnh 4.1. Đĩa nuôi cấy vi khuẩn sau 12 giờ trên môi trƣờng 29 4 Hình ảnh 4.2. Hình thái vi khuẩn S. suis 29 v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii DANH MỤC VIẾT TẮT ..................................................................................... iii MỤC LỤC ............................................................................................................ iv DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vi DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn........................................................................ 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học......................................................................................... 2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................... 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3 2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus suis .................................................... 3 2.1.1. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm nuôi cấy ....................................................................................... 3 2.1.3. Đặc tính sinh hóa ......................................................................................... 4 2.1.4. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn ................................................................. 5 2.2. Bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra ......................... 7 2.2.1. Đặc điểm bệnh............................................................................................. 7 2.2.2.Triệu chứng và bệnh tích.............................................................................. 7 2.2.3. Các biện pháp phòng bệnh .......................................................................... 9 2.2.4. Điều trị bệnh .............................................................................................. 11 2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc .................................................. 11 2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .............................................................. 11 2.3.2. Tài liệu nghiên cứu ngoài nƣớc................................................................. 12 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 15 3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ................................................................ 15 3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................ 15 vi 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................... 15 3.1.2.1. Thời gian nghiên cứu ............................................................................. 15 3.1.2.2. Địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 15 3.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 15 3.3. Nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu.......................................................... 15 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 16 3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu ................................................................................ 16 3.4.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn ................................................................ 16 3.4.3. Phƣơng pháp nuôi cấy ............................................................................... 17 3.4.4. Phƣơng pháp giám định đặc tính sinh hóa ................................................ 20 3.4.5. Phƣơng pháp xác định Streptococcus suis bằng kỹ thuật PCR................. 21 3.4.6. Phƣơng pháp xác định triệu chứng, bệnh tích điển hình của lợn mắc bệnh viêm phổi ............................................................................................................. 23 3.4.7. Phƣơng pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn S.suis phân lập đƣợc .................................................................. 24 3.4.7. Phƣơng pháp thử phác đồ điều trị ............................................................. 25 3.5. Phƣơng pháp phân tích số liệu .................................................................... 26 Chƣơng 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 27 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Streptococcus suis ............................................. 27 4.2. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn ............................................................................ 28 4.2.1. Kết quả xác định số loại khuẩn lạc từ mẫu bệh phẩm .............................. 28 4.2.2. Kết quả kiểm tra đặc tính nuôi cấy vi khuẩn Streptococcus suis .............. 30 4.3. Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập đƣợc bằng hệ thống API 20 Strep ............................................. 31 4.4. Kết quả thử phản ứng PCR .......................................................................... 33 4.5. Kết quả xác định đƣợc triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh viêm phổi do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra tại thực địa ............................................. 34 4.6. Kết quả thử kháng sinh đồ............................................................................ 37 4.7. Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra .................................................................................... 39 vii Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 41 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 41 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 42 viii Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Ngành chăn nuôi 6 tháng đầu năm 2017 gặp khó khăn trong khâu tiêu thụ, đặc biệt là chăn nuôi lợn, nguyên nhân do những năm trƣớc tình hình chăn nuôi thuận lợi, giá cả ổn định nên ngƣời dân đầu tƣ mở rộng đàn, dẫn đến tình trạng cung vƣợt cầu khiến cho giá lợn giảm sâu, ngƣời chăn nuôi chịu thua lỗ nặng. Tổng số đàn lợn cả nƣớc ƣớc tính đến tháng 1/10/2017 là 24,7 triệu con giảm 5,7% so với cùng kỳ năm 2016. Sản lƣợng thịt lợn hơi xuất chuồng 6 tháng ƣớc đạt 2.202 nghìn tấn, tăng 2,7% so với cùng kỳ năm trƣớc theo Thống kê chăn nuôi [17]. Mặt khác khi mức sống của ngƣời dân tăng lên thì nhu cầu về sử dụng thực phẩm sạch đang là vấn đề mà xã hội quan tâm, do đó mà ngành chăn nuôi nói chung và nhất là chăn nuôi lợn nói riêng phải tạo ra số lƣợng cũng nhƣ phải đảm về chất lƣợng sản phẩm. Việc này đòi hỏi công tác thú y phải chú trọng hơn nữa để chúng ta có những biện pháp hợp lý đáp ứng với nhu cầu của xã hội. Dù không phải là bệnh truyền nhiễm nhƣng Bệnh viêm phổi lợn là một bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn, bệnh tồn tại rất lâu trong cơ thể lợn cũng nhƣ ngoài môi trƣờng làm công tác phòng bệnh rất khó khăn, khi bị mắc bệnh, chi phí điều trị lớn, thời gian và liệu trình điều trị kéo dài. Mặt khác một thực tế đặt ra là: bệnh mang tính chất mãn tính nên ngƣời chăn nuôi khó nhận định rõ ràng về hậu quả nhƣ viêm phổi thùy hoặc làm cho dịch tích tụ giữa phổi - màng phổi, đƣợc gọi là tràn dịch màng phổi hoặc viêm phổi cũng có thể tạo ra các khoang chứ mủ (áp xe) trong phổi là một biến chứng nguy hiểm... làm cho lợn còi cọc, chậm lớn, tiêu tốn thức ăn cao, giá thành sản phẩm thiếu cạnh tranh. Cho tới nay ở Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh viêm phổi lợn, tuy nhiên mới chỉ tập chung vào tỷ lệ nhiễm, dịch tễ học, và phác đồ phòng trị bệnh, còn các kết quả phân lập và giám định thì rất ít các tác giả nghiên cứu. Xuất phát từ thực tiễn sản xuất nhằm mục đích trên hiểu rõ hơn về đặc tính nuôi cấy và giám định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus suis từ đó xây dựng kế hoạch về phòng và trị bệnh một cách có hiệu quả, chúng tôi tiến 1 hành nghiên cứu đề tài :“Nghiên cứu phân lập và giám định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus suis gây viêm phổi lợn tại Thái Nguyên”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và xác định đặc điểm nuôi cấy, đặc tính sinh hóa của vi khuẩn S.suis gây bệnh viêm phổi ở lợn tại Thái Nguyên. - Dựa vào kết quả xác định đặc điểm phân lập và giám định đặc tính sinh hóa để xây dựng đƣợc phác đồ điều trị bệnh viêm phổi do vi khuẩn Streptococus suis. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Xác định đƣợc vai trò vi khuẩn Streptococcus suis trong bệnh viêm phổi. - Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo về bệnh viêm phổi ở lợn. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Phân lập, xác định vi khuẩn Streptococcus suis gây bệnh viêm phổi ở lợn. Xây dựng thành công đƣợc phƣơng pháp chẩn đoán bệnh viêm phổi do vi khuẩn Streptococcus suis. - Điều này phục vụ cho công tác phòng và điều trị bệnh viêm phổi ở lợn. 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus suis 2.1.1. Đặc điểm hình thái Hình thái, kích thƣớc và đặc tính nuôi cấy vi khuẩn Streptococus suis thuộc giống Streptococcus, họ Streptococcaceae, bộ Lactobacillales, lớp Bacilli. Streptococcus là vi khuẩn Gram dƣơng, hình cầu hoặc hình trứng đƣờng kính nhỏ hơn 1μm, chúng thƣờng đứng riêng lẻ, xếp thành đôi hoặc thành từng chuỗi ngắn nhƣ chuỗi hạt, có độ dài ngắn không đều nhau. Chiều dài của chuỗi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trƣờng. Vi khuẩn thuộc nhóm yếm khí tùy tiện, không di động, không sinh nha bào, nhƣng có khả năng hình thành giáp mô. Sự hình thành giáp mô có thể xác định đƣợc khi chúng sinh sống trong các mô hoặc phát triển trong các môi trƣờng nuôi cấy có chứa huyết thanh. 2.1.2. Đặc điểm nuôi cấy Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy sau 18 giờ chủ yếu là có dạng hình cầu, kích thƣớc 0,5 - 1μm, đứng thành dạng chuỗi 5 - 10 tế bào. Trong canh trùng già, sau 30 giờ nuôi cấy, vi khuẩn có thể thay đổi tính chất bắt màu, chuỗi cũng thấy dài hơn. Đặc biệt, khi nuôi cấy trong môi trƣờng dạng lỏng, hình thái các chuỗi đƣợc nhìn thấy rõ nhất. Vi khuẩn Streptococcus suis (S.suis) là những vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy tiện, gây bệnh thích hợp ở nhiệt độ 37ºC và phát triển tốt trên nhiều loại môi trƣờng nhƣ: - Môi trƣờng nƣớc thịt: Vi khuẩn Streptococcus suis hình thành hạt hoặc những bông, rồi lắng xuống đáy ống. Sau 2 giờ nuôi cấy môi trƣờng trong, đáy ống có cặn. - Môi trƣờng thạch thƣờng: Vi khuẩn Streptococcus suis hình thành khuẩn lạc dạng S, khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám - Trên môi trƣờng đặc: Có thể quan sát thấy khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy với kích thƣớc khoảng 1 - 2 mm. Sau 72 giờ thì kích thƣớc khuẩn lạc lớn nhất, có thể đạt tới 3 - 4 mm. Nếu đƣợc nuôi trong điều kiện có 5 - 10% CO2 thì 3 khuẩn lạc sẽ phát triển nhanh hơn và rộng hơn. Khuẩn lạc thƣờng tạo chất nhầy mạnh, độ nhầy càng rõ và tăng nếu nhƣ vi khuẩn đƣợc nuôi cấy vài giờ vào môi trƣờng nƣớc thịt có bổ sung huyết thanh trƣớc khi cấy sang môi trƣờng đặc hoặc thạch máu. Dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch thƣờng nhỏ và khô hơn trên môi trƣờng có bổ sung dinh dƣỡng. - Trên môi trƣờng thạch máu: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc tròn, gọn, hơi vồng, sáng trắng, mịn, dung huyết sau 24 giờ nuôi cấy. - Trên môi trƣờng MacConkey: Vi khuẩn mọc tốt, sau 24 giờ nuôi cấy, hình thành các khuẩn lạc nhỏ bằng đầu đinh ghim (Nguyễn Nhƣ Thanh và cs, 2001) [15]. 2.1.3. Đặc tính sinh hóa Vi khuẩn Streptococcus suis có khả năng lên men đƣờng glucose, lactose, succrose, inulin, trehalose, maltose, fructose; không lên men các loại đƣờng ribose, arabinose, sorbitol, mannitol, dextrose và xylose. Các phản ứng Oxydase, Catalase, Indol: Âm tính (Trịnh Phú Ngọc, 2002) [10]. * Cấu trúc kháng nguyên - Vi khuẩn Streptococcus suis có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp và có rất nhiều kháng nguyên đã đƣợc tìm thấy đó là: + Kháng nguyên thân (Somatic antigen): Kháng nguyên thân có ý nghĩa quan trọng trong việc quyết định độc lực của Streptococcus suis. Kháng nguyên thân nằm ở thành vi khuẩn (Cell wall) và đƣợc cấu tạo bởi các phân tử peptidoglycan ở lớp trong cùng (N-acetylglucosamine và N-acetylmuramic acid), tiếp đến là lớp giữa gồm các polysaccharide (N-acetylglucosamine và rhamnose), lớp ngoài cùng là các protein gồm M protein, lipoteichoic acid, R và T protein. + Kháng nguyên bám dính (Fimbriae antigen): Vai trò của kháng nguyên bám dính của Streptococcus suis còn chƣa đƣợc biết đến một cách rõ ràng, nhƣng có ý kiến cho rằng chúng đóng vai trò quan trọng trong việc giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào biểu mô của vật chủ. Vi khuẩn Streptococcus suis là một trong số ít các loại vi khuẩn Gram dƣơng có mang cấu trúc này. So với các loại vi khuẩn khác thì kháng nguyên bám dính của vi khuẩn Streptococcus suis có cấu trúc mỏng, ngắn, đƣờng kính khoảng 2 m, và dài có khi tới 200 m (Jacques và cs, 1990) [24]. 4 + Kháng nguyên giáp mô (Capsule antigen): Kháng nguyên giáp mô có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ vi khuẩn, kháng lại khả năng thực bào của cơ 33 thể vật chủ. Nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng các chủng Streptococcus suis có giáp mô thì có độc lực và có khả năng gây bệnh, còn các chủng không có giáp mô thì không có khả năng này (Higgins và Gottschalk, 2002) [22]. - Phân loại vi khuẩn Streptococcus suis theo serotype: Trƣớc đây, Streptococcus suis đƣợc phân loại huyết thanh học thành các nhóm theo ký hiệu S, R, RS và T. Sau đó, các nhóm S, R và RS này lần lƣợt đƣợc thay thế bằng các serotype ký hiệu lần lƣợt là serotype1; 2 và 1/2 (Windsor và Elliot, 1975) [36], còn nhóm T đƣợc thay thế bằng serotype 15 (Gottschalk và cs, 1989) [20]. Các chủng Streptococcus suis đƣợc phân thành 35 serotype dựa trên cấu trúc kháng nguyên polysaccharide của giáp mô (ký hiệu từ 1 đến 34 và 1/2) (Perch và cs, 1983; Higgins và cs, 1995) [27], [23]. Trong đó, đáng chú ý nhất là các chủng Streptococcus suis thuộc serotype 2 phân lập đƣợc thƣờng xuyên nhất ở lợn và cũng là nguyên nhân gây ra các thể bệnh nguy hiểm khác nhau ở lợn và ngƣời (Higgins và Gottschalk, 2002) [23]. Các chủng thuộc các serotype gây ra các thể bệnh khác nhau. Thậm chí các chủng vi khuẩn thuộc cùng một serotype cũng có thể gây ra các thể bệnh khác nhau do vùng địa lý mà chúng phân bố. Một số serotype không có độc lực và có thể đƣợc phân lập từ lợn khỏe mạnh, không có triệu chứng lâm sàng nhƣ các serotype 17; 18; 19 và 21 (Higgins và Gottschalk, 2002) [23]. Đỗ Ngọc Thúy và cs (2009) [16] khi xác định serotype trong 211 chủng Streptococcus suis phân lập đƣợc từ lợn tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam cho biết số chủng thuộc serotype 2 chiếm tỷ lệ cao nhất 14/211 chủng (6,6%); serotype 9 có 10/211 chủng (4,7%); serotype 9, 31, 32 có 7/211 chủng (3,3%); các serotype 7, serotype 17 và serotype 21 có tỷ lệ tƣơng đƣơng là 1,4%; serotype 8 chiếm 0,9%. 2.1.4. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Những hiểu biết về các yếu tố độc lực của vi khuẩn Streptococcus suis còn rất hạn chế, phần lớn những nghiên cứu đƣợc tiến hành với các chủng thuộc serotype 2. Các nhà khoa học đều có chung quan điểm là có sự tồn tại của chủng 5 độc và chủng không độc của vi khuẩn Streptococcus suis serotype 2. Thành phần polysaccharide của giáp mô (capsular polysaccharide - CPS) đƣợc xác định là yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn này vì các chủng đột biến không có giáp mô đều thể hiện là không có độc tính và nhanh chóng bị loại bỏ khỏi hệ thống tuần hoàn của lợn và chuột 34 trong các thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm. Tuy vậy không phải tất cả các chủng có giáp mô đều là chủng độc (Lun và cs, 2007) [25]. Các yếu tố độc lực khác ngoài polysaccharide giáp mô của Streptococcus suis, bao gồm: - Yếu tố gây dung huyết, hay còn gọi là “suilysin” có trọng lƣợng phân tử 65 kDa và có độ phóng xạ riêng là 0,7x106 Units/ mg. Suilysin (SLY) thuộc về nhóm độc tố với những đặc điểm chung là dễ bị oxy hoá và bị hoạt hóa bởi một số hóa chất khử, dễ bị ức chế bởi cholesterol với nồng độ loãng, ức chế tính hoạt động của một số lƣợng ít, gốc N- của chuỗi amino acid của suilysin giống với perfringolysin O, streptolysin O, listeriolysin O, alveolysin, pneumolysin. Trong điều kiện invitro trên chuột và lợn đã đƣợc chứng minh là có khả năng tạo ra miễn dịch khi đƣợc tiêm vaccine chứa suilysin để kháng lại vi khuẩn Streptococcus suis serotype 2 gây bệnh. Suilysin là yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn S. suis vì sự trung hoà của yếu tố này đủ để bảo vệ chuột thí nghiệm chống lại các tác động có hại của vi khuẩn S. suis serotype 2 (Gottschalk và cs, 1998) [21]. - Hai loại protein là protein giải phóng muramidase (Muramidase released protein - MRP) có trọng lƣợng phân tử 136 kDa và protein giải phóng yếu tố ngoại bào (Extracellular factor - EF) đã đƣợc xác định là các yếu tố độc lực quan trọng trong sinh bệnh học của Streptococcus suis serotype 2 gây bệnh ở lợn và ngƣời (Vecht và cs, 1991) [33]. Các nghiên cứu về gây bệnh thực nghiệm trên lợn cũng đã cho thấy các chủng vi khuẩn có mang 2 yếu tố gây bệnh này (MRP+ và EF+) đã đƣợc phân lập từ các phủ tạng của lợn sau khi gây nhiễm với các triệu chứng điển hình của bệnh, trong khi đó các chủng không mang các yếu tố gây bệnh này (MRP- và EF-) có thể phân lập đƣợc thƣờng xuyên trong amidan của lợn khỏe và không có khả năng gây bệnh cho lợn thí nghiệm (Vecht và cs,(1985), (1991), (1992) [35] [33] [34]; Smith và cs, 1992) [31]). Ở Việt 6 Nam, Nguyễn Ngọc Nhiên và cs (1994) [13] tiêm 0,2 ml vi khuẩn Streptococcus suis vào dƣới da cho chuột bạch, chuột chết sau 24 - 36 giờ, chỗ tiêm áp xe có mủ và đã phân lập lại đƣợc vi khuẩn từ máu tim . 2.2. Bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra 2.2.1. Đặc điểm bệnh Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra ở lợn đã đƣợc thông báo là xảy ra ở hầu khắp các nƣớc trên thế giới đặc biệt là các nƣớc có ngành chăn nuôi lợn phát triển. Khả năng gây bệnh của S. suis phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ sức đề kháng của con vật, điều kiện vệ sinh môi trƣờng, chế độ chăm sóc nuôi dƣỡng, thời tiết khí hậu, tính chất kháng nguyên và độc lực của vi khuẩn sản sinh. Bệnh có thể bị lây nhiễm từ trại lợn này sang trại khác thông qua vật chủ trung gian là ruồi. Enright và cs (1987) [19] cho biết ruồi có thể mang S. suis serotype 2 tới 5 ngày và có thể làm nhiễm mầm bệnh vào thức ăn mà chúng đậu phải ít nhất là trong vòng 4 ngày .Pijoan (1996) [28] đã xác định hầu hết lợn sau cai sữa đều 36 có mang các chủng vi khuẩn S. suis nhƣng chỉ có một số ít các chủng này có khả năng gây bệnh cho lợn giai đoạn sau đó. 2.2.2.Triệu chứng và bệnh tích Clifton-Hadley (1983) [18] nghiên cứu ở lợn gây bệnh thực nghiệm và quan sát lợn trong các ổ dịch tự nhiên cho thấy lợn từ 1- 3 tuần tuổi thƣờng mắc thể viêm não và viêm màng não với các triệu chứng nhƣ ủ rũ, kém ăn, sƣng hầu, khó nuốt, đi lại khó khăn, lông khô, dựng đứng, sốt, da mẩn đỏ. Lợn hoạt động khó khăn, đi lại loạng choạng, khi nằm có biểu hiện tƣ thế nhƣ bơi chèo, tê liệt. Lợn mắc bệnh có hiện tƣợng viêm một khớp, khớp viêm thƣờng là khớp bẹn, đầu gối hoặc khớp bàn chân. Các tổn thƣơng đầu tiên bao gồm thủy thũng, sƣng khớp, màng khớp sung huyết, dịch khớp đục. Triệu chứng và các thể bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra ở lợn là rất phức tạp, khó nhận biết và khó phân biệt khi bệnh có biểu hiện bội nhiễm, kế phát bởi một số vi khuẩn khác. Các biến đổi về bệnh tích vi thể không có sự sai khác giữa các serotype gây bệnh và thƣờng tập trung ở não, phổi, tim và các khớp. Các tổn thƣơng quan sát thấy nhƣ viêm màng não, viêm não, viêm phổi - màng phổi có mủ hoặc viêm phổi kẽ (Reams và cs, 1994,1996)[29][30]. 7 Các thể bệnh và bệnh tích của bệnh do các serotype khác nhau gây ra là không giống nhau (Vansconcelos và cs, 1994) [32]. Các biến đổi về bệnh tích vi thể không có sự sai khác giữa các serotype gây bệnh và thƣờng tập trung ở não, phổi, tim và các khớp. Các tổn thƣơng quan sát thấy nhƣ viêm màng não, viêm não, viêm phổi - màng phổi có mủ hoặc viêm phổi kẽ (Reams và cs, 1994) [31]. Các triệu chứng bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra ở lợn rất đa dạng, bao gồm nhƣ viêm não, nhiễm trùng máu, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, viêm đa thanh mạc, viêm màng bụng, viêm phổi và thƣờng dẫn đến chết đột ngột (Higgins và cs, 2002; Lun và cs, 2007) [22], [25]). Lê Văn Tạo (2005) [14] cho biết để gây bệnh vi khuẩn S. suis sau khi vào cơ thể sẽ nhân lên tại hạch hạch nhân rồi vào máu gây nhiễm trùng huyết, nên triệu chứng đầu tiên là sốt 40,6 41,7º C, triệu chứng thần kinh nhƣ run rẩy, đứng không vững, liệt, dẫn đến chết. Triệu chứng, bệnh tích và các thể bệnh thƣờng thấy: - Thể nhiễm trùng huyết: + Lợn bệnh sốt rất cao (41 - 42ºC), chảy nƣớc mắt, ly bì, nằm bệt, niêm mạc đỏ sẫm, da đỏ tím từng mảng. Lợn bệnh chết trong khoảng 1 đến 3 ngày, tỷ lệ chết lên đến 100%. +Bệnh tích: da đỏ tím từng mảng, tụ huyết và xuất huyết ở một số phủ tạng (lách, thận, hạch lâm ba). - Thể viêm não tuỷ: + Lợn bệnh sốt cao, bỏ ăn, đi lại siêu vẹo, run rẩy, co giật, nôn mửa, hôn mê và chết sau 2-3 ngày. Bệnh thƣờng thấy ở lợn sau cai sữa và lợn từ 2-3 tháng tuổi, tỷ lệ chết 100%. + Bệnh tích: màng não tụ huyết và xuất huyết, dịch não và tủy vẩn đục. - Thể viêm họng, viêm phế quản, viêm phổi: + Lợn bệnh sốt cao, chảy nƣớc mắt, dịch mũi, họng sƣng, bỏ ăn, thở khó, thở nhanh; da tụ huyết từng mảng. Thể này thƣờng gặp ở lợn con và lợn sau cai sữa, tỷ lệ chết 60 -70%. + Bệnh tích: hạch amidan sƣng, tụ máu, niêm mạc phế quản tụ huyết, niêm mạc mũi có màng giả, tiểu phế quản và phế nang viêm có dịch thẩm xuất, 8 có mủ và bọt khí; hạch phổi sƣng, tụ huyết. Lợn bị bệnh thể phổi gây ra bệnh tích ở phổi có các mức độ biểu hiện khác nhau từ viêm phổi - màng phổi dạng nhục hoá đến viêm phổi dạng fibrin có mủ. - Thể viêm hạch: + Lợn sốt cao, hạch hầu và hạch mang tai sƣng thủy thũng, sau thành apxe mủ, lâu thành bã đậu. Bệnh thấy ở lợn vỗ béo, diễn biến 5-8 ngày, tỷ lệ chết 20-30%. + Bệnh tích: hạch hầu, hạch trƣớc vai, trƣớc đùi sƣng tụ huyết ở giai đoạn đầu, giai đoạn cuối viêm bã đậu. 2.2.3. Các biện pháp phòng bệnh - Phòng bệnh bằng vệ sinh, chăm sóc, nuôi dƣỡng và quản lý trong chăn nuôi lợn việc chia đàn, phân ô chuồng theo từng loại lợn là rất cần thiết. Với lợn con sau cai sữa, cần chia thành các ô nhỏ để đạt đƣợc tốc độ tăng trƣởng tối đa vì khả năng lây truyền bệnh khi nuôi nhốt với mật độ cao là rất lớn. Để chủ động phòng bệnh ở lợn do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra cần: + Thƣờng xuyên thực hiện phun thuốc diệt ruồi, muỗi để ngăn chặn nguồn mang mầm bệnh vào chuồng trại. Thu gom rác, phân, chất độn chuồng, nƣớc thải; phun thuốc tiêu độc, tẩy uế chuồng trại bằng các loại thuốc sát trùng nhƣ NaOH 2%, Benkocid Han-Iodine 10% ... theo đúng qui định. + Chú trọng khâu chăm sóc nuôi dƣỡng và quản lý đàn; hạn chế sự xâm nhiễm và lây lan dịch bệnh nên thực hiện chính sách “Cùng vào cùng ra”. + Bổ sung kháng sinh vào thức ăn để giảm tỷ lệ lợn khoẻ mang trùng + Lợn con sau khi sinh cần đƣợc bú đầy đủ sữa đầu của mẹ để có đủ kháng thể bảo vệ chúng trong giai đoạn đầu - là giai đoạn dễ cảm nhiễm với bệnh nhất. + Loại bỏ những lợn mang trùng và có hƣớng điều trị kịp thời lợn mắc bệnh. + Không đƣợc vận chuyển lợn từ vùng có dịch sang vùng khác. Đối với các vùng chăn nuôi tập trung và các trang trại, biện pháp tốt nhất là tự sản xuất lấy con giống. Khi nhập lợn về phải nuôi cách ly tại khu vực nuôi 9 cách ly ít nhất 15 ngày. Sau đó kiểm tra thấy lợn khoẻ mạnh bình thƣờng và không có dấu hiệu gì về bệnh thì mới tiến hành cho nhập đàn. + Khi có dịch xảy ra, phải cách ly những con bệnh ra khu vực nuôi cách ly để tránh lây lan. Theo dõi và điều trị kịp thời những con bị bệnh. Với những con không có khả năng chữa khỏi thì tiến hành loại thải. Trong quá trình theo dõi, phải cách ly tuyệt đối không đƣợc nhập đàn mới vào, thƣờng xuyên phun thuốc tiêu độc, tẩy uế chuồng trại bằng các thuốc sát trùng nhằm nhanh chóng tiêu diệt mầm bệnh Phạm Sỹ Lăng và cs, (2012) [5]. - Phòng bệnh bằng vaccine Hiện nay, các loại vaccine đƣợc sử dụng để phòng bệnh do Streptococcus suis gây ra cho lợn chủ yếu là các vaccine chuồng và hiệu quả bảo hộ của các loại vaccine này cũng chƣa đƣợc xác định một cách rõ ràng. Có thể do một số nguyên nhân của hiện tƣợng kháng nguyên bị biến tính mất tính đặc hiệu do quá trình xử lý bằng nhiệt hoặc formalin, do sự sản sinh kháng thể đối với các kháng nguyên mà không có liên quan đến độc lực của vi khuẩn và sự thiếu hụt các chủng Streptococcus suis hay serotype liên quan đến quá trình sinh bệnh học Higgins và cs, (2002) [22]. Các nhà khoa học cũng đã chế tạo thử nghiệm nhiều loại vaccine khác nhau nhƣ vaccine toàn khuẩn, vaccine sống nhƣợc độc, vaccine tiểu phần (chế từ kháng nguyên giáp mô hoặc các protein thành tế bào). Tuy nhiên, miễn dịch bảo hộ ở chuột hoặc lợn thí nghiệm đƣợc tiêm các loại vaccine này cũng rất thất thƣờng và không ổn định. Trong một số trƣờng hợp khẩn cấp, việc lựa chọn dùng vaccine vẫn là phƣơng thức tối ƣu nhất để bảo vệ đàn lợn. Ở Việt Nam, từ các kết quả nghiên cứu về bệnh cầu khuẩn ở lợn, Khƣơng Thị Bích Ngọc (1996) [12] đã chế tạo vaccine cầu khuẩn chết có bổ trợ keo phèn tiêm phòng cho lợn nái, đạt hiệu quả bảo hộ tƣơng đối cao. Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng vaccine cầu khuẩn để tiêm phòng cho đàn lợn ở nƣớc ta chƣa đƣợc phổ biến rộng rãi, bệnh liên cầu khuẩn vẫn thƣờng xuyên xẩy ra ở lợn gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi. 10 2.2.4. Điều trị bệnh Trong thực tế, khi sử dụng kháng sinh có độ mẫn cảm cao để điều trị cho lợn mắc bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra đã mang lại hiệu quả. Tuy nhiên, sử dụng kháng sinh để điều trị phải dùng sớm và chỉ có hiệu quả tốt khi con vật chƣa có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nặng hay chƣa có biểu hiện quá ủ rũ, bỏ ăn. Điều trị muộn thì hiệu quả sẽ rất kém hoặc không có hiệu quả. Chẩn đoán phát hiện sớm bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra và điều trị bằng kháng sinh thích hợp là biện pháp nhằm tăng khả năng sống sót cho đàn lợn. 2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Theo Trịnh Phú Ngọc và cs (1999) [11] cho biết: Các chủng Sreptococcus phân lập đƣợc từ lợn các tỉnh phía bắc Việt Nam đều mang hình thái, tính chất sinh hóa giống nhƣ các chủng chuẩn đã đƣợc mô tả trong các tài liệu trƣớc đây. Kiểm tra tính chất mọc của Streptococcus trên môi trƣờng: Thạch thƣờng: khuẩn lạc mọc yếu, khuẩn lạc trắng, trong, tròn, gọn. Thạch máu: khuẩn lạc mọc tốt, màu hơi tím, lồi, tròn, gọn, mịn, dung huyết. Thạch Edward: khuẩn lạc nhỏ mịn, ƣớt, tròn gọn, trong, mặt hơi lồi, màu hơi tím. Thạch Shapman: không mọc, màu đỏ tƣơi. Nƣớc thịt 5% huyết thanh: mọc tốt, hơi đục.Trên môi trƣờng MacConkey: Vi khuẩn mọc tốt, sau 24 giờ nuôi cấy, hình thành các khuẩn lạc nhỏ bằng đầu đinh ghim (Nguyễn Nhƣ Thanh và cs, 2001; Trịnh Phú Ngọc và cs, 1999; Phạm Sỹ Lăng và cs, 2006) [15], [11], [7]. Theo (Lê Văn Tạo, 2005) [14] cho biết: Streptococcus luôn có mặt trong hạch amidan và xoang mũi của một số lợn khỏe mà không có triệu chứng lâm sàng. Streptococcus có thể gây bệnh quanh năm, nhƣng các vụ dịch thƣờng xảy ra vào đầu mùa xuân hoặc sau khi có những thay đổi thời tiết đột ngột. Bệnh có thể lây qua đƣờng tiêu hóa, hô hấp và qua da. Gần đây nhất là ở Tứ Xuyên, Trung Quốc ổ dịch liên cầu khuẩn bắt đầu xuất hiện từ cuối tháng 6 năm 2005 đến tháng 8 năm 2005. Theo thống kê có 6736 lợn bị mắc bệnh vói 641 ổ dịch, số lợn chết là 319 con. Quan trọng hơn vi khuẩn liên cầu thuộc serotype 2 đã làm cho 214 ngƣòi bị nhiễm 11