Tài liệu Nghiên cứu phân lập một số chất đối chiếu từ thân hành trinh nữ hoàng cung crinum latifolium l., amaryllidaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ---------***-------- NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Luận văn Thạc sĩ Dược học Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------- NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy PGS. TS. Võ Thị Bạch Huệ Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 . i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nguyễn Thị Ngọc Hà . Luận văn thạc sĩ – Khóa 2016 -2018 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã ngành: 8720210 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Nguyễn Thị Ngọc Hà Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, PGS.TS. Võ Thị Bạch Huệ Từ khóa: Thân hành, Trinh nữ hoàng cung (TNHC), Crinum latifolium, kaempferol, daucosterol. Mở đầu: Trinh Nữ Hoàng cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) là cây thuốc quý được lưu truyền trong y học dân gian, với tác dụng kháng viêm, kháng khối u, chống oxi hóa, giảm đau… Alcaloid và flavonoid là hai nhóm hợp chất được nghiên cứu nhiều trong TNHC. Ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu thành phần flavonoid trong thân hành TNHC. Đề tài được thực hiện với mục tiêu phân lập các hợp chất tinh khiết và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của cao ethyl acetat chiết từ thân hành TNHC. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nguyên liệu: Thân hành TNHC. Phương pháp nghiên cứu: Xác định hàm lượng polyphenol trong thân hành TNHC bằng thuốc thử Folin-ciocalteu. Khảo sát quy trình chiết flavonoid toàn phần. Từ cao flavonoid toàn phần, bằng kỹ thuật sắc ký cột, các kỹ thuật tinh chế để phân lập các hợp chất tinh khiết. Xác định cấu trúc bằng phổ UV, NMR, MS. Sàng lọc tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và xác định MIC của cao chiết từ thân hành TNHC. Kết quả: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng polyphenol trong thân hành TNHC bằng thuốc thử Folin – ciocalteu. Phân lập được 2 hợp chất daucosterol và kaempferol từ thân hành TNHC. Cao ethyl acetat chiết từ thân hành có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm. Kết luận: Phân lập được hai hợp chất từ thân hành TNHC, tuy nhiên hàm lượng flavonoid trong thân hành rất ít. Cao ethyl acetat từ thân hành TNHC cho tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm . Master’s Thesis – Academic course: 2016 -2018 Specialty: Drug Quality control & Toxicology - Code: 8720210 ISOLATION OF REFERENCE SUBSTANCES FORM THE BULBS OF CRINUM LATIFOLIUM (L.) Nguyen Thi Ngoc Ha Supervisor: Dr. Nguyen Huu Lac Thuy, Assoc. Prof. Dr. Vo Thi Bach Hue Keywords: bulbs, Crinum latifolium, kaempferol, daucosterol. Introduction: Crinum latifolium is a widely used traditional herb in Viet Nam, which has a number of other valuable biological effects such as antitumor, antioxidant, antiinflammatory, detoxification… Most studies have been focused on alkaloids and flavonoids in C. latifolium. However in Vietnam, there is no study about flavonoids in the bulbs of C.latifolium. The aim of this study to isolate pure compounds and test for antibacterial and antifungal. Materials and methods: Material: bulbs of C.latifolium. Methods: determination of the total phenolic content from the bulbs of C. latifolium by Folin-ciocalteu reagent. Investigation of flavonoid extraction process. By column chromatography, purification techniques isolate pure compounds from ethyl acetate extract. Identification of structure by UV, NMR and MS. Screen for antibacterial, antifungal activity and determine the MIC of the extract from the bulbs of C. latifolium. Results: Develop and validate procedure to determine the total phenolic content from the bulbs of C. latifolium (L.) by Folin-ciocalteu reagent. Daucosterol and kaempferol were isolated from the ethyl acetate extract. The ethyl acetate extract showed slight activity against bacterial and fungal. Conclusion: Two compounds were isolated from the bulbs of C. latifolium, the results showed the content of flavonoids in the bulbs was low. The ethyl acetate extract showed slight activity against bacterial and fungal. . i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... iii MỤC LỤC ....................................................................................................... vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT........................................................................ vii DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................ viii DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................. x DANH MỤC SƠ ĐỒ ....................................................................................... x ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 2 1.1. Tổng quan về cây Trinh Nữ Hoàng cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) .......................................................................................................... 2 1.2. Tổng quan về flavonoid trong chi Crinum và TNHC .......................................... 5 1.3. Phương pháp Folin–ciocalteu xác định hàm lượng polyphenol toàn phần .......... 9 1.4. Phương pháp khảo sát tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm ............................ 10 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 12 2.1. Nguyên liệu ........................................................................................................ 12 2.2. Vi sinh vật và môi trường thử nghiệm ............................................................... 12 2.3. Dung môi và hóa chất ........................................................................................ 13 2.4. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................. 13 2.5. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 14 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 22 3.1. Xác định hàm lượng polyphenol trong thân hành TNHC .................................. 22 3.3. Khảo sát quy trình chiết và tách flavonoid ........................................................ 34 3.4. Khảo sát cấu trúc bằng phương pháp phổ nghiệm ............................................. 48 3.5. Khảo sát tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm ...................................................... 52 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................. 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 63 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 67 . i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ tắt Từ nguyên Ý nghĩa tiếng Việt 13 13 Cộng hưởng từ hạt nhân C13 1 C-NMR H-NMR 1 C-Nuclear Magnetic Resonance H-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân proton br broad Đỉnh rộng d doublet Đỉnh đôi DMSO Dimethyl sulfoxid EtOAc Ethyl acetat FC Folin-Ciocalteu HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại MeOH Methanol Methanol MHA Mueller Hinton Agar MHB Mueller Hinton Broth MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MS Mass spectrum Phổ khối NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân ppm parts per million Phần triệu s singlet Đỉnh đơn SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng TNHC Trinh nữ Hoàng cung UV- Vis Ultraviolet - visible Tử ngoại – khả kiến VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký cột chân không VS Vanilline- sulfuric acid . Ethyl acetat ii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo nhóm flavon, flavan, chalcon. .......................................3 Hình 1.2: Công thức cấu tạo Euflavonoid, Isoflavonoid và Neoflavonoid ................5 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoid trong cây TNHC ........................7 Hình 2.1. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp pha loãng trên đĩa thạch......21 Hình 3.1. Phổ UV - Vis của mẫu chuẩn và mẫu thử .................................................23 Hình 3.2. Động học phản ứng của mẫu chuẩn và mẫu thử .......................................24 Hình 3.3. Kết quả phân tích ANOVA của quy trình tối ưu hóa................................26 Hình 3.4. Kết quả đánh giá các hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính .............26 Hình 3.5. Ảnh hưởng của yếu tố khảo sát lên hàm lượng polyphenol......................27 Hình 3.6. Các thông số tối ưu dự đoán bởi MODDE 5.0..........................................28 Hình 3.7. Động học phản ứng của quy trình tối ưu...................................................29 Hình 3.8. Phổ UV-Vis đánh giá độ đặc hiệu .............................................................30 Hình 3.9. Sự phụ thuộc giữa độ hấp thu và nồng độ mẫu chuẩn (µg/ml) .................31 Hình 3.10. Sắc ký đồ so sánh điều kiện chiết flavonoid ở cao n-hexan ...................34 Hình 3.11. Sắc ký đồ so sánh điều kiện chiết flavonoid ở cao cloroform ................35 Hình 3.12. Sắc ký đồ so sánh điều kiện chiết flavonoid ở cao ethyl acetat ..............35 Hình 3.13. Sắc ký đồ so sánh phân đoạn EtOAc của 2 quy trình chiết flavonoid ....39 Hình 3.14. Sắc ký đồ kiểm tra 7 phân đoạn thu được từ cột chân không (VLC) .....41 Hình 3.15. Sắc ký đồ kiểm tra các phân đoạn rửa giải than hoạt ..............................42 Hình 3.16. Các phân đoạn sắc ký cột ........................................................................45 Hình 3.17. Sắc ký đồ kiểm tra PĐ F2.6 tinh chế bằng cột pha đảo ..........................46 Hình 3.18. Sắc ký đồ hợp chất (1).............................................................................46 Hình 3.19. Sắc ký đồ HC-2 .......................................................................................46 Hình 3.20. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất (1) và (2) ........................47 Hình 3.21. Phổ MS hợp chất (1) ...............................................................................48 Hình 3.22. Phổ UV – Vis hợp chất (1) ......................................................................48 Hình 3.23. Sắc ký đồ so sánh HC-1 với kaempferol chuẩn. .....................................49 Hình 3.24. Phổ MS hợp chất (2) ...............................................................................50 . Hình 3.25. Cấu trúc daucosterol ................................................................................52 Hình 3.26. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao F1 ..................53 Hình 3.27. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm các phân đoạn......54 Hình 3.28. Mẫu chứng âm xác định MIC vi khuẩn (1) và vi nấm (2) ......................55 Hình 3.29. Kết quả thử MIC vi khuẩn của cao F1 ....................................................55 Hình 3.30. Kết quả thử MIC vi khuẩn cao phân đoạn F1.4 ......................................56 Hình 3.31. Kết quả thử MIC vi khuẩn cao phân đoạn F1.5 ......................................56 Hình 3.32. Kết quả thử MIC vi nấm cao phân đoạn F1 ............................................56 Hình 3.33. Kết quả thử MIC vi nấm cao phân đoạn F1.6 .........................................56 Hình 3.34. Kết quả thử MIC vi khuẩn cao phân đoạn F1.7 ......................................57 . DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật ......................................22 Bảng 3.2. Pha mẫu xác định bước sóng cực đại .......................................................23 Bảng 3.3. Pha mẫu đo động học phản ứng ................................................................24 Bảng 3.4. Xác định mức giới hạn của các yếu tố khảo sát .......................................25 Bảng 3.5. Kết quả 15 thí nghiệm trong thiết kế tối ưu hóa .......................................25 Bảng 3.6. Kết quả lặp lại 3 lần quy trình tối ưu ........................................................28 Bảng 3.7. Độ hấp thu động học phản ứng của quy trình tối ưu ................................29 Bảng 3.8. Pha mẫu đo độ đặc hiệu ............................................................................29 Bảng 3.9. Kết quả đánh giá tính tuyến tính mẫu chuẩn ............................................30 Bảng 3.10. Kết quả độ lặp lại ....................................................................................32 Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian ..............................................32 Bảng 3.12. Kết quả đánh giá độ đúng .......................................................................33 Bảng 3.13. Hiệu suất chiết (%) .................................................................................36 Bảng 3.14. So sánh cao ethyl acetat của 2 quy trình chiết flavonoid .......................39 Bảng 3.15. Các phân đoạn qua VLC .........................................................................41 Bảng 3.16. Các phân đoạn rửa giải than hoạt ...........................................................42 Bảng 3.17. Các phân đoạn qua sắc ký cột .................................................................44 Bảng 3.18. So sánh phổ 13C- NMR hợp chất (2) và tài liệu ......................................51 Bảng 3.19. Kết quả định tính kháng khuẩn và kháng nấm .......................................52 Bảng 3.20. Kết quả xác định MIC các mẫu có hoạt tính ..........................................55 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tổng quát quy trình chiết flavonoid (không tách alcaloid) ............17 Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết flavonoid không tách alkaloid ........................................37 Sơ đồ 3.2. Quy trình chiết cao flavonoid toàn phần (có tách alcaloid) .....................38 Sơ đồ 3.3. Quy trình chiết cao ethyl acetat F1 ..........................................................40 Sơ đồ 3.4. Quy trình tinh chế cao F1 (loại tạp bằng than hoạt) ................................43 . ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Trinh Nữ Hoàng cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) từ lâu đã là cây thuốc quý đã được lưu truyền trong y học dân gian, thường được sử dụng với công dụng kháng viêm, kháng khối u, chống oxi hóa, giảm đau… Do đó, nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và chứng minh tác dụng sinh học của các hợp chất trong cây Trinh nữ hoàng cung (TNHC) [29], [30], [32]. Các công trình tập trung nghiên cứu thành phần alcaloid trong TNHC và đã có hơn 40 alcaloid được phân lập và định danh. Các hợp chất alcaloid trong TNHC đã được chứng minh bằng thực nghiệm về tác dụng chống phân bào, ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, kích thích sinh sản và hoạt hóa tế bào lypmpho T [8]. Một công dụng khác của TNHC được biết đến là khả năng kháng viêm, chống oxi hóa của nhóm hợp chất flavonoid trong loài này. Flavonoid là thành phần chiếm tỉ lệ cao trong hợp chất tự nhiên có trong TNHC. Tại Việt Nam nghiên cứu về flavonoid chưa được thực hiện trên thân hành TNHC. Mặt khác, trên thị trường hiện nay có nhiều chế phẩm thuốc từ TNHC. Một yêu cầu đặt ra là phải đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu, bán thành phẩm, thành phẩm. Với mong muốn góp phần nghiên cứu các hợp chất trong thân hành TNHC với mục tiêu chính là hợp chất flavonoid và mở rộng nguồn nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu ứng dụng trong kiểm nghiệm dược liệu, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập một số chất đối chiếu từ thân hành Trinh Nữ Hoàng cung - Crinum latifolium L., Amaryllidaceae” với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Xây dựng quy trình định lượng polyphenol trong thân hành TNHC. 2. Khảo sát quy trình chiết flavonoid từ thân hành TNHC và phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao thân hành. 3. Khảo sát tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của cao ethyl acetat và các cao phân đoạn chiết từ thân hành TNHC. . CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (CRINUM LATIFOLIUM L. AMARYLLIDACEAE) 1.1.1. Đặc điểm thực vật Tên khoa học: Crinum latifolium L., Họ Thủy Tiên (Amaryllidaceae) Tên gọi khác: Náng lá rộng, Hoàng cung trinh nữ, Tỏi lơi lá rộng Phân loại thực vật Theo hệ thống phân loại A. L. Takhtajan (2009) [13], TNHC có vị trí như sau: Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Hành (Liliopsida) Phân lớp hành (Liliidae) Liên bộ hành (Lilianae) Bộ Thủy Tiên (Amaryllidales) Họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) Chi Crinum L. Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) Mô tả thực vật TNHC là cây thân thảo, sống lâu năm nhờ thân hành hay thân rễ. Thân hành như củ hành tây, đường kính 10–15cm, bao phủ bởi những vảy hình bản to dai và khô xác ở bên ngoài. Từ thân hành mọc ra nhiều củ con có thể tách ra để trồng riêng dễ dàng. Bẹ lá úp vào nhau thành thân giả dài khoảng 10-5 cm, có nhiều lá mỏng kéo dài từ 80-110 cm, rộng 3-8 cm, hai bên mép lá nguyên, có lượn sóng, đầu lá nhọn hoặc tù. Gân lá song song, mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá có một sống lá nổi rất rõ. . Hoa mọc thành tán gồm 6-18 hoa, trên một cán hoa dài 30-60 cm. Cánh hoa màu trắng pha hồng, bao hoa gồm 6 phiến bằng nhau, hàn liền 1/3 thành ống hẹp, khi nở phiến quăn lại. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 3. Nhị 6, không đều, rời dính, đính trên miệng ống bao hoa thành vòng 2. Bộ nhụy gồm 3 lá noãn tạo thành bầu dưới 3 ô, mỗi ô chứa 6-8 noãn, đính noãn trung trụ [2], [6]. Bộ phận dùng: Lá và thân hành Phân bố và sinh thái: được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc… Ở Việt Nam cây được trồng chủ yếu ở các tỉnh từ Quảng Nam–Đà Nẵng trở vào. TNHC là cây ưa ẩm, ưa sáng hoặc có thể chịu bóng một phần, sinh trưởng và phát triển ở khí hậu nóng, ẩm của vùng nhiệt đới. Trung bình mỗi năm cây có thể sinh ra 6-8 lá mới và đẻ thêm 3-5 hành con. Cây ra hoa hàng năm vào tháng 6-8 [2], [6]. 1.1.2. Thành phần hóa học Thành phần được nghiên cứu trong TNHC chủ yếu là các hợp chất alcaloid Alcaloid : chủ yếu thuộc khung crinin, lycorin, ngoài ra còn có các hợp chất thuộc khung belladin, cheryllin [8]. Flavonoid: đã có 8 hợp chất được phân lập từ TNHC, chủ yếu thuộc các nhóm sau: Flavon Flavan Chalcon Hình 1.1. Công thức cấu tạo nhóm flavon, flavan, chalcon. Nhóm coumarin: 4-senecioyloxymethyl-3,4-dimethoxycoumarin được phân lập từ dịch chiết methanol của TNHC [28]. . Nhóm carbohydrat: rễ chứa 2 glucan là glucan A và glucan B. Glucan A gồm 12 đơn vị glucose, còn glucan B có khoảng 110 gốc của glucose. 1.1.3. Tác dụng dược lý Tác dụng kháng khối u, độc tế bào Dịch chiết C. latifolium và các phân đoạn alcaloid ức chế tế bào u lympho chuột và kích hoạt hoạt động chống khối u của đại thực bào in vitro [30]. Dịch chiết nước TNHC có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào của các tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt di căn ở người (IC50 = 4,5 ± 0,8 mg/ml), tế bào tuyến tiền liệt nhạy cảm androgen LNCaP (IC50 = 2,3 ± 0,1 mg/ml) và tế bào tăng sản tuyến tiền liệt BPH-1 (IC50 = 2,1 ± 0,04 mg/ml) [21]. Cao chiết bằng nước nóng có tác dụng kích thích sự sản sinh của tế bào lympho T, và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp các tế bào CD4 + T trong thử nghiệm in vitro trên bạch cầu đơn nhân to ngoại vi lấy từ máu ngoại vi của chuột thử nghiệm [18]. Tác dụng chống oxi hóa Dịch nước C. latifolium cho thấy khả năng thu hồi gốc peroxyl mạnh, với giá trị ORAC là 1610 ± 150 µmol TE/g [21]. Tác dụng kháng viêm Tác dụng chống viêm của dịch chiết C. latifolium thể hiện bằng khả năng ức chế indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO), ở liều IC50 241 ± 57 µg/ml ức chế tryptophan suy thoái và ở liều 92 ± 20 µg/ml ức chế sự phân chia các tế bào máu đơn nhân (PBMC) [21]. Tác dụng kháng khuẩn Dịch chiết methanol C. latifolium cho thấy tác dụng kháng S. aureus và E. coli, Tuy nhiên tác dụng kháng khuẩn thể hiện yếu [32]. . 1.2. TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID TRONG CHI CRINUM VÀ TNHC 1.2.1. Tổng quan về flavonoid Flavonoid là hợp chất lớn trong thực vật, các hợp chất flavonoid thường có màu. Các hợp chất được xếp vào nhóm flavonoid có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Người ta chia flavonoid thành các loại sau: Euflavonoid bao gồm các nhóm lớn flavon, flavonol, flavanol, flavanolon, chalcon. Isoflavonoid bao gồm các nhóm lớn Isoflavon, Isoflavan, Isoflavandiol, Isoflaven, Coumestan, Pterocarpan. Neoflavonoid chỉ giới hạn trong một số loài thực vật và bao gồm các nhóm 4-phenyl chroman và 4-phenyl coumarin. Euflavonoid Isoflavonoid Neoflavonoid Hình 1.2: Công thức cấu tạo Euflavonoid, Isoflavonoid và Neoflavonoid 1.2.2. Các nghiên cứu về hợp chất polyphenol và flavonoid trong thân hành chi Crinum Thân hành là dạng thân bị biến đổi với đoạn thân thẳng đứng mọng nước và ngắn, được bao phủ bởi các lá biến dạng mọng nước và dày gọi là vảy. Thân hành là cơ quan dự trữ chất dinh dưỡng của cây. Ở giữa mỗi thân hành có 1 chồi non ra hoa, có các rễ mọc ở phía dưới đáy. Các công trình nghiên cứu về thành phần flavonoid trong các cây thuộc chi Crinum: . Năm 1990, tác giả Ramadan đã phân lập được ba flavonoid là (-)-4’-hydroxy-7methoxy-8-methylflavan từ phân đoạn ether dầu hỏa và 2’,4,4’-trihydroxychalcon; 2’,4,4’-trihydroxy-3’-methylchalcon từ phân đoạn ethyl acetat trong thân hành Crinurn augusturn Roxb [19]. Năm 2000, Ramadan sử dụng kỹ thuật sắc ký cột nhanh, và sắc ký lỏng điều chế phân lập từ thân hành Crinum bulbispermum Milne được 4-hydroxy-2',4'-dimethoxydihydrochalcon; 4'-hydroxy-7-methoxy flavan-3-ol; 2(S),3',4'-dihydroxy-7-methoxy flavan; isolarrien; isoliquiritigenin và liquiritigenin từ phân đoạn cloroform [33]. Năm 2009, Qian Sun và cộng sự đã phân lập được ba flavonoid là (2S)-3’,7dihydroxy-4’-methoxyflavan; 7-hydroxyflavanon; 4’,7-dihydroxy-flavon từ phân đoạn cloroform và ethyl acetat của dịch chiết ethanol từ thân hành Crinum asiaticum L. var. sinicum. Ngoài ra, nhóm tác giả còn phân lập được 5 hợp chất phenolic gồm trans-caffeic acid; 4-coumatic acid; 4-hydroxy benzoic acid; ethyl–4-hydroxyl benzoat và 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-1,3-benzodioxol–5-carboxaldehyd [31]. Năm 2015, Sanjay jagtap đã tìm thấy rutin, isoquercetin, astragalin, phenolic acid and kaempferol trong dịch chiết thân hành Crinum woodrowii bằng kỹ thuật HPTLC [20]. Năm 2018, acetovanillon (apocynin) and 4-hydroxyacetophenon (piceol) được phân lập từ thân hành Crinum buphanoides và Crinum graminicola [26]. 1.2.3. Các nghiên cứu về polyphenol và flavonoid trong TNHC So với nhóm alcaloid, thì số hợp chất flavonoid TNHC được công bố ít hơn. Các flavonoid TNHC được phân lập chủ yếu từ lá, hoa, chưa có công trình nghiên cứu thành phần flavonoid trong thân hành. Nhóm tác giả Nguyễn Hải Nam đã phân lập từ dịch chiết methanol được 5 hợp chất flavonoid là 4',7-dihydroxyflavan; trihydroxydihydrochalcon; 4',7-dihydroxy-3'-methoxyflavan; 3',5,6-trihydroxy-4',7,8-trimethoxyflavon và 2',4',74',7- dihydroxy-3'-vinyloxyflavan; trong đó có 3',5,6-trihydroxy-4',7,8-trimethoxyflavon đã được chứng minh là có tác dụng sinh học [7], [28], [29]. . Năm 2005, nhóm tác giả thuộc phân viện hóa học các hợp chất tự nhiên tại thành phố Hồ Chí Minh đã chiết tách được 2 flavonoid là kaemferol-3-O--D glucopyranosid và kaemferol-3,4-O--D glucopyranosid từ dịch chiết ethanol lá TNHC [9]. Năm 2014, isoquercitrin là lần đầu được phân lập từ lá TNHC [8]. 4’,7-dihydroxyflavan 4’,7-dihydroxy-3’-methoxyflavan 4’,7-dihydroxy-3’-vinyloxyflavan 5,6,3’-trihydroxy-7,8,4’-trimethoxyflavon 2’,4’,7-trihydroxydihydrochalcon Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl Isoquercetrin Hình 1.3. Cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoid trong cây TNHC . Để chiết dược liệu với số lượng lớn dùng cho phân lập, thì phương pháp chiết thường được sử dụng là ngấm kiệt, ngâm. Ngoài ra, phương pháp chiết siêu tới hạn đang được ứng dụng với ưu điểm giảm thiểu dung môi chiết, hiệu quả kinh tế. Từ cao toàn phần, tiến hành tách thành các phân đoạn nhỏ bằng kỹ thuật sắc ký cột. SKC chân không là một kỹ thuật biến đổi của sắc ký cột cổ điển. Về bản chất SKC chân không là một dạng sắc ký hấp phụ trên cột pha thuận với tốc độ nhanh. Pha tĩnh thường được sử dụng là silicagel. Dung môi khan triển n-hexan, cloroform, ethyl acetat đến methanol. Sau đó, tinh chế hoặc tách flavonoid được dựa vào tính chất, độ tan trong các dung môi, dùng nhiệt độ để kết tinh các flavonoid tinh khiết. 1.2.4. Tổng quan tác dụng sinh học hợp chất flavonoid TNHC Các hợp chất flavonoid được biết đến là những hợp chất có tác dụng chống oxi hóa với khả năng dập dập tắt các gốc tự do và tạo phức với ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa khử. Ngoài ra, flavonoid còn được chứng minh là tác dụng bảo vệ gan, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng virus, kháng khối u, chống huyết khối, chống loãng xương [11], [23]. Ngoài tác dụng chống oxi hóa, các hợp chất flavonoid được phân lập từ TNHC được chứng minh là có tác dụng kháng viêm, kháng khối u, kháng khuẩn... 3',5,6-trihydroxy-4',7,8-trimethoxyflavon có tác dụng ức chế yếu đối với sự hình thành tế bào hình ống, được thực hiện trên tế bào HUVEC [28]. Astragalin ức chế tế bào viêm gây ra bởi 20 μM H2O2 và ức chế dày thành khí quản và khí phế thũng gây ra bởi 20 μg của ovalbumin (OVA) ở chuột. Với liều uống 20 mg/kg astragalin giảm cảm ứng của F4/80/CD68/CD11b trong đường hô hấp, làm giảm sự phát triển của α-SMA trong các đường dẫn khí xảy ra viêm và đảo ngược sự dày lên trong đường thở. Do đó, astragalin có thể là một tác nhân điều trị chống hen suyễn và các bệnh phổi tắc nghẽn [22]. Isoquercitrin có sinh khả dụng cao hơn quercetin và cho một số tác dụng bảo vệ hóa học cả in vitro và in vivo, chống lại sự oxy hóa, ung thư, rối loạn tim mạch, tiểu đường và phản ứng dị ứng. Điều trị bằng isoquercitrin đối với các tế bào KU812 kích thích . PMACI làm giảm đáng kể việc sản xuất histamin và các cytokine pro-inflammatory, như interleukin (IL)-6, IL-8, IL-1β và yếu tố hoại tử khối u (TNF - tumor necrosis factor)–α. Isoquercitrin đã ức chế sự kích hoạt NF-κB qua trung gian PMACI trong tế bào cơ thể người [25]. Kaempferol là hợp chất polyphenol chống oxi hóa, đã được báo cáo có biểu hiện chống lại các khối u ác tính khác nhau. Kaempferol ức chế sự biểu hiện COX-2 do UVB gây ra ở tế bào biểu bì da JB6 P + và làm suy yếu hoạt động phiên mã của UVB gây COX-2 và AP-1. Thử nghiệm in vitro và ex vivo kinase chứng minh rằng kaempferol ức chế hoạt tính của Src kinase, từ đó cho thấy kaempferol là một tác nhân chống ung thư da thông qua sự tương tác ức chế với Src. [24]. Kaempferol có tác dụng ức chế Enterococcus faecalis ATCC 29212 với MIC 130 µg/ml [16]. 1.3. PHƯƠNG PHÁP FOLIN–CIOCALTEU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL TOÀN PHẦN Một số phương pháp dùng xác định hàm lượng polyphenol toàn phần như Prussian blue, Folin - Denis và Folin–Ciocalteu Reagent. Phương pháp Folin - Ciocalteu được sử dụng phổ biển hơn với ưu điểm dễ thực hiện, nhạy hơn một số phương pháp định lượng khác. Nhược điểm của phương pháp là ngoài hợp chất phenol ra còn có những hợp chất khác phản ứng với thuốc thử Folin–Ciocalteu như đường glucose, acid ascorbic, amin thơm, sulfit, sulfur oxid ... [12]. Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng oxy hóa khử trong môi trường kiềm của thuốc thử Folin–Ciocalteu với hợp chất phenol trong đó acid phosphotungstic và acid phosphomolybdic bị khử bởi hợp chất phenol tạo các oxyd có màu xanh lam của tungsten và molybden (Mo8O23 – W8O23), đo độ hấp thu của dung dịch thu được sau phản ứng . Mo(VI)/W(VI) (vàng) + e- → Mo(V)/W(V) (xanh lam) Pha chế Hòa tan 100 g natri tungstat (Na2WO4.2H2O) và 25 g natri molybdat (Na2MoO4.2H2O) vào 700 ml nước cất. Thêm 100 ml acid hydrochlorid đậm đặc và . 0 50 ml acid phosphoric 85%. Đun sôi hồi lưu trong 10 giờ. Sau đó dừng đun và rửa bộ ngưng tụ với lượng ít nước, để nguội rồi thêm 150 gam lithium sulfat Li2SO4.4H2O và một vài giọt brom. Đun nóng hỗn hợp (không lắp bộ ngưng tụ) trong khoảng 15 phút để giải đuổi brom dư. Dung dịch thu được phải trong suốt và có màu vàng đậm không có bất kì dấu vết của màu xanh nào (lá cây hay lam). Bổ sung nước vừa đủ 1000 ml và lọc qua phễu thủy tinh. Thuốc thử Folin – Ciocalteu bền vững lâu dài thậm chí khi pha loãng nếu được bảo quản tránh các tác nhân khử [34]. Ban đầu quy trình định lượng được thực hiện như sau: hút 1,0 ml mẫu thử, sau đó thêm ít nhất 60 ml nước cất trong bình định mức 100 ml. Thêm thuốc thử FC (5,0 ml) và lắc đều. Sau 1- 8 phút, thêm 15,0 ml dung dịch natri carbonat 20%, điền nước cất đến vạch 100,0 ml và đo độ hấp thu sau khoảng 2 giờ ở bước sóng 760 nm [34]. Hiện nay, tùy vào điều kiện tiến hành, nồng độ thuốc thử FC thay đổi 10-100%, nồng độ natri carbonat 5-29%. Các chất chuẩn có thể được sử dụng trong phương pháp Folin-Ciocalteu như acid galic, pyrogallol, catechin, acid tannic, acid chlorogenic, acid caffeic, acid protocatechuic, acid vanillic, acid ferulic. Bước sóng hấp thu cực đại thay đổi theo pH môi trường, hàm lượng polyphenol trong mẫu thử[1], [15], [17]. 1.4. PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM 1.4.1. Phương pháp khuếch tán Nguyên tắc: Sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị ức chế do sự khuếch tán của chất kháng khuẩn từ một lỗ đục/giấy trên mặt thạch vào môi trường xung quanh. Tính kháng khuẩn được thể hiện thông qua đường kính vòng kháng khuẩn. Phương pháp khuếch tán gồm phương pháp đặt giấy và phương pháp đục lỗ. Ưu điểm : Nhanh, thực hiện được nhiều mẫu thử cùng lúc Nhược điểm: Phương pháp đặt giấy: dễ gây âm tính giả do mẫu thử không khuếch tán ra khỏi giấy tẩm. Phương pháp đục lỗ: đòi hỏi kinh nghiệm khi tiến hành trách rách, nứt thạch. .