Tài liệu Nghiên cứu nhân nhanh invitro trồng ngoài tự nhiên giống lan phi điệp (dendrobium anosmum) và giống lan cát (cattleya sp)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG   BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CỦA SINH VIÊN THAM GIA CUỘC THI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016 XÉT GIẢI THƯỞNG “TÀI NĂNG KHOA HỌC TRẺ ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT” NĂM 2015 - 2016 NGÀNH: SINH HỌC ỨNG DỤNG NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO; TRỒNG NGOÀI TỰ NHIÊN GIỐNG LAN PHI ĐIỆP (Dendrobium anosmum) VÀ GIỐNG LAN CÁT (Cattleya sp.)     THUỘC NHÓM NGÀNH KHOA HỌC: KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG   Bình Dương, năm 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG   BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CỦA SINH VIÊN THAM GIA CUỘC THI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016 XÉT GIẢI THƯỞNG “TÀI NĂNG KHOA HỌC TRẺ ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT” NĂM 2015 - 2016 NGÀNH: SINH HỌC ỨNG DỤNG NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO; TRỒNG NGOÀI TỰ NHIÊN GIỐNG LAN PHI ĐIỆP (Dendrobium anosmum) VÀ GIỐNG LAN CÁT (Cattleya sp.) THUỘC NHÓM NGÀNH KHOA HỌC: KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG Giảng viên hướng dẫn : ThS. PHAN VĂN THUẦN  Sinh viên thực hiện:    NGUYỄN THỊ THÚY HẠNH PHẠM THỊ DIỆU VIÊN NGUYỄN LÝ LÊ  Lớp       : C14SH02 Khoá     : 2014 – 2017      Bình Dương, năm 2016 UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh in vitro; trồng ngoài điều kiện tự nhiên giống lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) và giống lan Cát (Cattleya sp.).” - Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thúy Hạnh – Phạm Thị Diệu Viên – Nguyễn Lý Lê - Lớp: C14SH02 - Khoa: Tài Nguyên Môi Trường - Năm thứ: 2 - Số năm đào tạo: 3 - Người hướng dẫn: Th.S Phan Văn Thuần 2. Mục tiêu đề tài: - Nhân nhanh, tạo số lượng cây con in vitro lớn trong phòng thí nhiệm các giống: giống lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) và giống lan Cát (Cattleya). - Trồng cây con thích nghi với điều kiện tự nhiên. 3. Tính mới và sáng tạo: - Ứng dựng của phương pháp nhân giống invitro vào sản xuất trực tiếp giống lan Phi điệp và Cattleya. - Nghiên cứu được giá thể thích hợp với điều kiện tự nhiên ở Bình Dương cho cây con đạt mức sống cao. 4. Kết quả nghiên cứu: Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đạt được những kết quả sau: - Chất khử trùng HgCl2 0.1% rất thích hợp để khử trùng quả lan Phi điệp, thời gian tối thích là 5 phút và hạt lan cấy lên môi trường MS bổ sung 0.5 mg/L BAP cho tỉ lệ nảy mầm cao. - Để nhân nhanh số lượng lớn chồi in vitro lan Phi điệp nên sử dụng môi trường MS + 1.5 mg/L BAP + 0.9 mg/L Kinetin cho hệ số nhân chồi cao (39.75 chồi/mẫu) và thời gian nuôi cấy cần 5 tháng. - Môi trường MS + 10%V nước dừa + 50g/L chuối chín + 0.5g/L than là thích hợp cho quá trình tạo rễ lan Phi điệp với số lượng rễ trung bình đạt 9.11 rễ/mẫu. Thời gian tạo rễ thích hợp nhất là 4 tháng. - Môi trường MS + 50g/L chuối chín + 1.2g/L than + 15%V nước dừa + 2mg/L NAA là thích hợp cho quá trình tạo rễ lan Cattleya với số lượng rễ trung bình đạt 4.29 rễ/mẫu. Thời gian tạo rễ thích hợp nhất là 4 tháng. - Giá thể bằng xơ dừa và than là thích hợp nhất cho việc đưa cây lan Phi điệp và lan Cattleya ra trồng ngoài tự nhiên. Tỉ lệ sống sót đạt 95% 5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, khả năng áp dụng của đề tài: - Chủ động nguồn giống lan quý cung cấp cho thị trường. - Cung cấp một số mẫu vật cho giảng dạy thực hành ở trường ĐH Thủ Dầu Một - Cung cấp một số phương pháp trồng lan Phi điệp và lan Cattleya 6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài: Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm chính thực hiện đề tài (Ký, họ và tên) Nguyễn Thị Thúy Hạnh Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực hiện đề tài (Phần này do người hướng dẫn ghi) Tôi đánh giá cao về kết quả nghiên cứu đề tài. Trong thời gian nghiên cứu nhóm sinh viên đã làm việc nghiêm túc và hoàn thành được nội dung lớn. Kết quả thu được nhân nhanh được số lượng cây con invitro lớn trong phòng thí nghiệm các giống: giống lan Phi điệp và giống lan Cattleya và trồng cây con thích nghi với điều kiện tự nhiên. Những đóng góp trên đã góp phần ứng dụng invitro vào sản xuất trực tiếp giống lan Phi điệp và lan Cattleya. Nghiên cứu giá thể thích hợp trồng ngoài tự nhiên ở Bình Dương cho cây con đạt mức sống cao. Ngày Xác nhận của lãnh đạo khoa (Ký, họ và tên) tháng năm Người hướng dẫn (Ký, họ và tên) Phan Văn Thuần UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I. SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN: Họ và tên: Ảnh 4x6 NGUYỄN THỊ THÚY HẠNH Sinh ngày: 14/03/1995 Nơi sinh: Quảng Bình Lớp: C14SH02 - Khóa: 2014 - 2017 Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Địa chỉ liên hệ: 104/8/1 khu 4 phường Phú Hòa TP Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương Điện thoại: 0987236874 - Email: [email protected] II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP * Năm thứ 1: Ngành học: Cao đẳng Sư phạm Sinh học - Khoa: Khoa học tự nhiên Kết quả xếp loại học tập: TB Khá * Năm thứ 2: Ngành học : Cao đẳng Sư phạm Sinh học - Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Kết quả xếp loại học tập: Khá Xác nhận của lãnh đạo khoa Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm chính thực hiện đề tài (Ký, họ và tên) Nguyễn Thị Thúy Hạnh DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI STT 1. Họ và tên Nguyễn Thị Thúy Hạnh Lớp C14SH02 2. Phạm Thị Diệu Viên C14SH02 3. Nguyễn Lý Lê C14SH02 Chữ kí i MỤC LỤC Trang phụ bìa MỤC LỤC................................................................................................................ .i DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT.................................................................iii DANH MỤC BẢNG BIỂU.....................................................................................iv DANH MỤC HÌNH.................................................................................................v MỞ ĐẦU..................................................................................................................1 1.Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài............................................1 2. Lý do chọn đề tài...................................................................................................2 3. Mục tiêu đề tài.......................................................................................................4 4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................4 4.1. Điều kiện và môi trường nuôi cấy.......................................................................4 4.1.1. Môi trường nuôi cấy........................................................................................4 4.1.2. Điều kiện trong phòng thí nghiệm...................................................................6 4.1.3. Điều kiện trong tự nhiên..................................................................................6 4.2. Phương pháp xác định môi trường tối ưu............................................................6 4.2.1. Đối với lan Phi điệp.........................................................................................6 4.2.2. Đối với lan Cattleya.........................................................................................6 4.3. Đánh giá các chỉ số, chỉ tiêu thu mẫu và phân tích.............................................7 5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu..........................................................................7 5.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................7 5.1.1. Giống lan Cattleya...........................................................................................7 5.1.2. Giống lan Phi điệp...........................................................................................7 5.2. Phạm vi nghiên cứu............................................................................................7 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................8 1.1. Lược sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật.......................................8 1.2. Ứng dụng của nhân giống in vitro ở một số cây hoa.........................................12 1.3. Vài nét về cây lan Cattleya và lan Phi điệp.......................................................13 1.3.1 Nguồn gốc lịch sử lan Cattleya.......................................................................13 1.3.2. Đặc điểm thực vật học của lan Cattleya.........................................................14 ii 1.3.3. Phân loại........................................................................................................14 1.3.4. Sơ lược về chi Hoàng Thảo (Dendrobium) và cây lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum)................................................................................................................15 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ.....................................................................17 2.1.1. Nguyên liệu....................................................................................................17 2.1.2. Hóa chất và dụng cụ......................................................................................17 2.1.2.1. Hóa chất......................................................................................................17 2.1.2.2. Dụng cụ......................................................................................................18 2.2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................18 2.2.1. Nội dung nghiên cứu......................................................................................18 2.2.2. Quy trình tiến hành........................................................................................18 2.2.2.1. Đối với lan Phi điệp....................................................................................18 2.2.2.2. Đối với lan Cattleya....................................................................................19 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................21 3.1. Tạo cây con in vitro từ gieo hạt lan Phi điệp.....................................................21 3.2. Nghiên cứu nhân nhanh với số lượng chồi lớn cây con in vitro Phi điệp..........22 3.3. Nghiên cứu khả năng tạo rễ của cây lan Phi điệp..............................................24 3.4. Nghiên cứu khả năng tạo rễ của cây lan Cattleya.............................................26 3.5. Nghiên cứu khả năng đưa cây con lan Phi điệp và lan Cattleya ra trồng ngoài tự nhiên....................................................................................................................... .27 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ........................................................................30 1. Kết luận...............................................................................................................30 2. Khuyến nghị........................................................................................................30 TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................31 PHỤ LỤC.................................................................................................................. . iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Ý nghĩa BAP Benzyl amino purine cs Cộng sự HgCl2 Clorua thủy ngân HCl Axit clohydric IAA β – indolacetic acid PP Vitamin B3 MS Murashige và Skoog (1962) NAA 1-Naphthaleneacetic acid NaOH Natri hiđroxit TP Thành phố 2,4-D 2,4-D dichlorophenoxy acetic acid DNA Deoxyribonucleotide acid iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Tên các bảng Trang Bảng 4.1.1 Thành phần môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962)...................4 Bảng 3.1. Kết quả vô trùng mẫu trái lan Phi điệp....................................................21 Bảng 3.2. Số liệu cụm chồi của cây lan Phi điệp.....................................................22 Bảng 3.3. Nghiên cứu khả năng tạo rễ của cây lan Phi điệp....................................24 Bảng 3.4. Nghiên cứu khả năng tạo rễ của cây lan Cattleya....................................26 Bảng 3.5. Tỷ lệ sống của cây lan trồng trên các giá thể khác nhau..........................28 v DANH MỤC HÌNH Tên các hình Trang Hình 3.1. Quả và chồi lan Phi điệp..........................................................................22 Hình 3.2.1. Biểu đồ số lượng cụm chồi của cây lan Phi Điệp..................................23 Hình 3.2.2. Chồi lan Phi điệp sau 4 tháng................................................................23 Hình 3.3.1 Biểu đồ so sánh khả năng tạo rễ lan Phi Điệp qua các tháng.................25 Hình 3.3.2. Hình ảnh lan Phi điệp sau 4 tháng.........................................................25 Hình 3.4.1. Biểu đồ so sánh khả năng tạo rễ của cây lan Cattleya qua các tháng....26 Hình 3.4.2. Hình ảnh lan Cattleya sau 4 tháng........................................................27 Hình 3.5. Hình ảnh cây lan đưa ra đất......................................................................28 1 MỞ ĐẦU 1. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài Nuôi cấy mô thực vật (nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ quan...) trong môi trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng. Kỹ thuật in vitro dựa trên nguyên lý là tế bào thực vật có tính toàn năng, nghĩa là từ một mô, một cơ quan, tế bào bất kỳ một bộ phận nào của cây đều có thể phát triển thành một cây hoàn chỉnh nếu được nuôi trong môi trường thích hợp [21]. Năm 1960, Morel trong lúc tìm cách làm sạch bệnh cho cây hoa lan bằng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh đã nhận thấy khả năng sinh sản, đâm chồi một cách tự nhiên của các mô phân sinh ngọn của một số loại hoa lan. Và cuối cùng, Morel (1966) đã thành công trong việc nhân nhanh in vitro cây hoa lan thuộc chi Cymbidium. Trên thế giới, nhiều loài lan thuô ̣c các chi như Cymbidium, Dendrobium, Epidendrum, Laeliocattleya, Acampe… đã được nhân giống vô tính in vitro thành công. Đối với chi Nervilia, có nhiều báo cáo của các tác giả Trung Quốc thành công trong việc nhân giống vô tính như He Fuchang và cs (1990), Pan Xue Feng và cs (2001), Chen Jenn-Yih và cs (2002), Du Qin và cs (2005), Li Bin (2008) [31, 32, 33, 34]. Năm 2009, báo cáo của Li Shou Ling và cộng sự cho thấy môi trường MS có bổ sung 2.0mg/L 6-BA, 0.1mg/L NAA, 10%V nước dừa và 0.1% than hoạt tính thích hợp để tạo chồi, còn môi trường MS bổ sung 2.0mg/L 6-BA và 0.5mg/L NAA thích hợp để tạo rễ [31]. Ngày nay, bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, thuốc lá, dứa, các cây lương thực, cây ăn quả, cây cảnh, cây dược liê ̣u.... Việc nhân giống này đã trở thành công nghệ và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới. Ở Viê ̣t Nam, kỹ thuâ ̣t nuôi cấy mô thực vật cũng đã được áp dùng và thành công trên nhiều đối tượng. Đă ̣c biê ̣t, trên đối tượng là các loài thuô ̣c họ Lan (Orchidaceae) đã có nhiều báo cáo như Dương Tấn Nhựt và Đỗ Thị Tâm đã tiến hành "Nhân giống vô tính một số giống địa lan Cymbidium bằng đỉnh sinh trưởng" [15], Phan Xuân 2 Huyên và cs với báo cáo "Phục tráng và nhân nhanh các giống địa lan Cymbidium bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng" [8], Dương Mô ̣ng Hùng và cs đã "Nhân giống lan tai trâu bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm" [3], Mai Văn Phô và Nguyễn Hoàng Lộc báo cáo thành công trong viê ̣c nuôi cấy mô lan nghing xuân [15], Nguyễn Quang Thạch và cs đã xây dựng quy trình kỹ thuật nuôi trồng cây địa lan Cymbidium spp. cấy mô [20]… Sở dĩ việc nhân giống vô tính in vitro cây hoa lan thành công nhanh chóng và mỹ mãn là do bởi hoa lan có phương thức sinh sản thông qua protocorm. Phương thức này chủ yếu gặp ở các đối tượng một lá mầm (monocotyledon) như phong lan, dứa, huệ... Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng sẽ tạo thành hàng loạt protocorm và các protocorm này có thể phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bằng phương thức này trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể. 2. Lý do chọn đề tài. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một lĩnh vực bao gồm nhiều kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy in vitro như: nuôi cấy phôi, cơ quan, tế bào và protoplast. Việc ra đời của các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mở ra một hướng mới cho nghiên cứu thực vật, nó nhanh chóng dành được một vị trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất và cải thiện giống cây trồng [2]. Kỹ thuật nhân giống in vitro không chỉ ứng dụng để nhân giống và phục tráng cây trồng mà nó còn đem lại hiệu quả kinh tế cao trong việc nhân nhanh và tạo ra một số lượng lớn cây con đồng đều, sạch bệnh, đặc biệt là còn giữ được tính trạng quý của bố mẹ và cho phép chủ động cung cấp nguồn giống cũng như vật liệu vô trùng cho các thí nghiệm [22]. Cho đến nay, có nhiều đối tượng cây hoa khác nhau đã được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào và thu được nhiều kết quả đáng kể như: hoa tulip, hoa lay ơn, hoa cẩm chướng, hoa hồng,… Trước đây chủ yếu nhân giống lan bằng phương pháp hữu tính hoặc phương pháp vô tính. Quá trình nhân giống hữu tính, gieo hạt mang tính ngẫu nhiên thu được cây có tính trạng yêu thích và gần như không thể có được cây con cho hoa đẹp như cây mẹ. Còn trong quá trình tạo ra cây mới bằng phương pháp nhân giống vô tính, không đảm 3 bảo được số lượng cây khỏe mạnh, có một số trường hợp cây bị nhiễm bệnh từ cây bố mẹ, hệ số nhân ra để đáp ứng nhu cầu thị trường thì không đủ. Để có số lượng lớn cây giống, đồng đều đáp ứng nhu cầu thị trường, trong những năm gần đây phương pháp nhân giống vô tính in vitro phổ biến hơn các phương pháp khác. Vì nó nhân nhanh với hệ số nhân giống cao, đưa ra sản phẩm nhanh hơn, các giống cây đồng nhất và sạch bệnh. Do vậy nuôi cấy mô cây lan đã được ứng dụng gần đây nhưng chi phí đắt và giá thành giống thì lại cao. Để giảm chi phí trong quá trình nuôi cấy sẽ không sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng, thay vào đó sẽ sử dụng các chất phụ gia hữu cơ như chuối chín, nước dừa, than hoạt tính,...và kết hợp với điều kiện môi trường ngoài tự nhiên. Trong thế giới đầy màu sắc của phong lan thì Cattleya được mệnh danh là nữ hoàng bởi hoa Cattleya là tổng hợp của vẻ đẹp và hương sắc vẹn toàn. Lan Cattleya là một trong những loài hoa to có rất nhiều những sắc màu rực rỡ, khi hoa nở thì tỏa hương thơm ngào ngạt từ sắc hồng, tím trắng cho đến cam, vàng….Cattleya có tuổi thọ rất dài, có thể sống đến 20 - 30 năm nếu chăm sóc tốt [35], [36]. Có thể nói đây là một trong những loại lan tuyệt đẹp, hoa thường có mùi thơm nhưng lại chống tàn và ngắn nhất có thể kể đến là loài Cattleya Mantini chỉ có thời gian nở hoa trong một tuần lễ. Nhưng với những loài khác thuộc giống này thì thời gian nở hoa thường là nửa tháng, với những loài cá biệt có thể đạt đến 3 tuần lễ [35]. Lan Phi điệp còn có tên khác như Hoàng thảo đùi gà, Hoàng thảo dẹt, Huỳnh thảo, Phi điệp. Cây dùng trong y học cổ truyền với tên thuốc là Thạch hộc hay Kẹp thảo. Giống lan thông thường có chiều cao 40 – 60 cm. Hoa có nhiều màu, phần đông tím trắng, nhạt hay thẫm. Hoa mọc ở các đốt gần ngọn 2 – 4 chiếc to khoảng 10 cm lâu tàn và thơm. Một khóm hoa có thể đạt tới 100 hoa, có mùi hương thơm nồng nàn. [1] Để tiến hành nhân nhanh các giống lan này nhằm chủ động nguồn giống lan quý “Nghiên cứu nhân nhanh in vitro; trồng ngoài điều kiện tự nhiên giống lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) và giống lan Cát (Cattleya sp.).” 4 3. Mục tiêu đề tài: - Nhân nhanh, tạo số lượng cây con in vitro lớn trong phòng thí nghiệm các giống: giống lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) và giống lan Cát (Cattleya). - Trồng cây con thích nghi với điều kiện tự nhiên. 4. Phương pháp nghiên cứu 4.1. Điều kiện và môi trường nuôi cấy 4.1.1. Môi trường nuôi cấy Các môi trường được sử dụng gồm: Môi trường MS cơ bản, môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP, phụ gia hữu cơ: chuối chín, nước dừa và than hoạt tính với các nồng độ và hàm lượng ở các mức khác nhau để thăm dò môi trường thích hợp nhất. Nguồn carbon là đường saccharose. Môi trường được làm đặc bằng agar, pH của môi trường được điều chỉnh đến 5,8 (bằng KOH 0,1N và NaOH 0,1N). Môi trường nuôi cấy được khử trùng ở 121oC trong 20 phút. 5 Bảng 4.1.1. Thành phần môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962) THÀNH PHẦN HÀM LƯỢNG (mg/L) 1. Đa lượng KNO3 1900 KH2PO4 170 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O 440 FeSO4.7H2O 27,8 Na2-EDTA 37,3 2. Vi lượng H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 ZnSO4.4H2O 8,6 Na2MoO4.2H2O 0,25 KI 0,83 3. Vitamin Myo-inositol 100 Thiamine.HCl 0,1 Pyridoxine.HCl 0,5 Nicotinic acid 0,5 4. Amoni acid Glycine 2 6 4.1.2. Điều kiện trong phòng thí nghiệm Điều kiện nuôi cấy in vitro: + Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày + Nhiệt độ: 22 ± 20C + Cường độ ánh sáng: 2000 - 3000lux 4.1.3. Điều kiện trong tự nhiên Điều kiện tự nhiên vườn lan: + Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày + Nhiệt độ: 19 - 390C + Cường độ ánh sáng: 960 - 10200 lux 4.2. Phương pháp xác định môi trường tối ưu. 4.2.1 Đối với lan Phi Điệp. - Từ quả lan được thu thập ngoài tự nhiên được khử trùng và được gieo trên các môi trường MS bổ sung 0.5 mg/L BAP chất điều hòa sinh trưởng. Sau 6 tháng đánh giá khả năng nảy mầm, sinh trưởng của cây con in vitro. - Cây con in vitro được cấy lên môi trường MS bổ sung 1.5 mg/L BAP kết hợp 0.9 mg/L Kinetin để tăng nhanh số lượng chồi. Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi in vitro. - Chồi in vitro được cấy lên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng với các nồng độ khác nhau để đánh giá khả năng tạo rễ, khả năng sinh trưởng và phát triển. 7 - Các cây con in vitro sau khi đạt chiều cao, số lá, đầy đủ các bộ phận (thân, lá, rễ) khỏe mạnh được huấn luyện, thích nghi dần và trồng trên các giá thể khác nhau để đánh giá khả năng sống sót, khả năng sinh trưởng ngoài tự nhiên. Giá thể với tỷ lệ khác nhau. Chọn giá thể tốt nhất để đưa cây ra đất. 4.2.2 Đối với lan Cattleya. - Chồi in vitro được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh học trường đại học Thủ Dầu Một được cấy lên môi trường MS bổ sung 50 g/L chuối chín, 1.2 g/L than hoạt tính, 15%V nước dừa để tạo rễ cho chồi in vitro. Đánh giá khả năng tạo chồi và sinh trưởng, phát triển của cây con. - Các cây con in vitro sau khi đạt chiều cao, số lá, đầy đủ các bộ phận (thân, lá, rễ) khỏe mạnh được huấn luyện, thích nghi dần và trồng trên các giá thể khác nhau để đánh giá khả năng sống sót, khả năng sinh trưởng ngoài tự nhiên. Chọn giá thể tốt nhất để đưa cây ra đất. 4.3. Đánh giá các chỉ số, chỉ tiêu thu mẫu và phân tích. - Thu thập các chỉ số qua mỗi thời gian cách nhau 1 tuần: chiều cao của chồi, số lượng chồi, chiều dài của lá, số lượng lá, chiều dài của rễ, số lượng rễ, tỷ lệ mẫu nhiểm, tỷ lệ mẫu chết, màu sắc của cây, sinh trưởng và phát triển của cây... - Các số liệu thu thập được xử lý bằng Excel. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 5.1. Đối tượng nghiên cứu 5.1.1 Giống lan Cát - Tên khoa học: Cattleya sp. - Chi: Cattleya - Họ: Orchidaceae 5.1.2 Giống lan Phi điệp - Tên khoa học: Dendrobium anosmum - Chi: Dendrobium - Họ: Orchidaceae [1].[17]. 5.2. Phạm vi nghiên cứu 8 Kết hợp giữa phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật trường Đại học Thủ Dầu Một với vườn trồng lan thực nghiệm trường Đại học Thủ Dầu Một. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lược sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật nhanh chóng đi vào thực tiễn cuộc sống. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật được bao hàm trong ứng dụng của Công nghệ Sinh học. Nó bao gồm nhân giống và nhân nhanh giống, sản xuất sinh khối các sản phẩm sinh hóa, sản xuất và chuyển hóa sinh học các dược liệu tự nhiên, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý, cải thiện và tạo giống cây trồng, nghiên cứu bệnh học thực vật, làm sạch virus…[21]. Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã chính thức xây dựng học thuyết tế bào. Học thuyết tế bào khẳng định: Mỗi cơ thể động thực vật đều bao gồm những thể tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế bào [32]. Năm 1898, Haberlandt tiến hành nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào này tách từ nhu mô lá, tượng tầng của tầng biểu bì và lông hút của nhiều loài thực vật, kết quả thu được là không thành công [33]. Năm 1902, Haberlandt để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào ông đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Theo ông, mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Điều đó, theo kiến thức sinh học hiện đại có nghĩa là: Mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Tuy nhiên, Haberlandt đã không thành công trong thí nghiệm chứng minh chứng tính toàn năng của tế bào do bởi ông đã chọn cây Một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, mặt khác do ông lại dùng các tế bào đã