Tài liệu Nghiên cứu nhân giống và đặc điểm hình thái loài địa hoàng (rehmannia glutinosa (gaertn) libosch) giai đoạn in vitro và trong vườn ươm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH PHÚ THỌ TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG CÙ LAN HƯƠNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÀ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI LOÀI ĐỊA HOÀNG (Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch.) GIAI ĐOẠN IN VITRO VÀ TRONG VƯỜN ƯƠM LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Thực vật học Phú Thọ, năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH PHÚ THỌ TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG CÙ LAN HƯƠNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÀ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI LOÀI ĐỊA HOÀNG (Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch.) GIAI ĐOẠN IN VITRO VÀ TRONG VƯỜN ƯƠM LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Thực vật học Mã số: 8420111 Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Phạm Thanh Loan Phú Thọ, năm 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của Tiến sĩ Phạm Thanh Loan, Viện trƣởng Viện nghiên cứu Ứng dụng & Phát triển, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng - Tỉnh Phú Thọ. Các thông tin, số liệu trong luận văn là trung thực và có nguồn gốc rõ ràng và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. TÁC GIẢ LUẬN VĂN Cù Lan Hƣơng ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các tập thể và cá nhân để hoàn thiện đề tài luận văn này. Trƣớc hết tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Khoa học tự nhiên, Viện nghiên cứu Ứng dụng & Phát triển, cùng các giảng viên Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, đặc biệt là sự hƣớng dẫn của TS. Phạm Thanh Loan, TS. Vũ Xuân Dƣơng, Ths. Hà Thị Tâm Tiến trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Phú Thọ, ngày tháng 8 năm 2020 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Cù Lan Hƣơng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. ii MỤC LỤC ...................................................................................................... iii DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................ v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................. viii MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................. 1 2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................... 2 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu............................................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................... 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ........................... 4 1.1. Tổng quan về cây Địa hoàng.................................................................... 4 1.1.1. Danh pháp, nguồn gốc lịch sử ............................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm sinh học và yêu cầu sinh thái ................................................ 5 1.1.3. Các thời kì sinh trƣởng của cây Địa hoàng ........................................... 8 1.1.4. Thành phần hóa học và ứng dụng dƣợc lý ............................................ 9 1.2.1. Kỹ thuật nhân giống in vitro ............................................................... 10 1.2.2. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro ............................................. 11 1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy mô .............................................. 12 1.2.4. Quy trình nhân giống in vitro .............................................................. 18 1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro cây Địa hoàng ..................... 19 1.3.1. Nghiên cứu ngoài nƣớc ....................................................................... 19 1.3.2. Nghiên cứu trong nƣớc........................................................................ 22 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 24 2.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 24 2.1.1 Nội dung 1: Nhân giống in vitro cây Địa hoàng .................................. 24 2.1.2. Nội dung 2: Đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh trƣởng cây Địa hoàng in vitro ........................................................................................................... 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 24 iv 2.2.1. Nội dung 1: Nhân giống in vitro cây Địa hoàng ................................. 24 2.2.2. Nội dung 2: Đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh trƣởng, năng suất cây Địa hoàng in vitro .......................................................................................... 28 2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu...................................................................... 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...................... 36 3.1. Nhân giống in vitro cây Địa hoàng ........................................................ 36 3.1.1. Môi trƣờng khởi động thích hợp ......................................................... 36 3.1.2. Môi trƣờng nhân chồi thích hợp ......................................................... 37 3.1.3. Môi trƣờng ra rễ tạo cây Địa hoàng in vitro hoàn chỉnh..................... 42 3.1.4. Giá thể ra cây thích hợp ...................................................................... 50 3.1.5. Quy trình nhân giống in vitro cây Địa hoàng ..................................... 53 3.2. Đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh trƣởng và năng suất của cây Địa hoàng in vitro ................................................................................................ 54 3.2.1. Đánh giá đặc điểm hình thái của cây Địa hoàng trồng từ cây giống in vitro ............................................................................................................... 54 3.2.2. Đặc điểm giải phẫu của cây Địa hoàng in vitro .................................. 56 3.2.3. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất Địa hoàng trồng từ cây nuôi cấy mô ................................................................................................... 66 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 69 4.1. Kết luận .................................................................................................. 69 4.2. Kiến nghị ................................................................................................ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 70 v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nền đến sự nảy chồi củ Địa hoàng ... 36 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của loại Cytokinin đến sự nhân chồi Địa hoàng ....... 39 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng tái tổ hợp BAP và IAA đến sự nhân chồi .................. 40 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ NAA và IAA đến sự ra rễ cây Địa hoàng ... 43 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng phối hợp PVP với NAA và IAA đến sự ra rễ cây Địa hoàng ............................................................................................................. 45 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng phối hợp BAP và auxin đến sự ra rễ cây Địa hoàng . 48 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng loại giá thể đến cây Địa hoàng in vitro...................... 51 Bảng 3.8. Đặc điểm hình thái thân của cây Địa hoàng trồng từ cây nuôi cấy mô .................................................................................................................. 54 Bảng 3.9. Đặc điểm hình thái lá của cây Địa hoàng trồng từ cây nuôi cấy mô ....................................................................................................................... 55 Bảng 3.10. Đặc điểm hình thái của củ Địa hoàng ......................................... 55 Bảng 3.11. Đặc điểm các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất Địa hoàng trong mô hình từ cây giống nuôi cấy mô ...................................................... 66 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cây Địa hoàng (Rehmannia glutinosa) ............................................. 5 Hình 2.1. Vào mẫu ......................................................................................... 31 Hình 2.2. Nhân nhanh ..................................................................................... 31 Hình 2.3. Cây con............................................................................................ 32 Hình 2.4. Kiểm tra cây con đƣa ra huấn luyện ............................................... 33 Hình 2.5. Ra cây trong khay huấn luyện ......................................................... 33 Hình 2.6. Huấn luyện cây................................................................................ 34 Hình 2.7. Cây giống ........................................................................................ 34 Hình 3.1. Sự nảy chồi in vitro củ Địa hoàng trong các môi trƣờng nuôi cấy . 37 Hình 3.2. Chồi Địa hoàng trong các công thức thí nghiệm sau 2 tuần nuôi cấy ......................................................................................................................... 39 Hình 3.3. Chồi in vitro cây Địa hoàng trong các môi trƣờng sau 4 tuần nuôi cấy ................................................................................................................... 41 Hình 3.4. Cây Địa hoàng in vitro trong môi trƣờng ra rễ ............................... 45 Hình 3.5. Hình thái cây Địa hoàng trong các công thức thí nghiệm .............. 46 Hình 3.6. Cây Địa hoàng in vitro trong các công thức thí nghiệm ................. 49 Hình 3.7. Hình thái cây Địa hoàng in vitro trong công thức thí nghiệm 16 ... 49 Hình 3.8. Cây Địa hoàng in vitro huấn luyện trong nhà lƣới ......................... 52 Hình 3.9. Cây Địa hoàng in vitro sau 4 tuần trồng ra đất trong vƣờn ƣơm .... 52 Hình 3.10. Quy trình nhân giống in vitro cây Địa hoàng ............................... 53 Hình 3.11. Hình thái củ Địa hoàng từ cây nuôi cấy mô ................................. 56 Hình 3.12. Phiến lá cây In vitro ...................................................................... 56 Hình 3.13. Phiến lá cây Ex vitro ..................................................................... 57 Hình 3.14. Phiến lá cây trồng bằng củ ............................................................ 57 Hình 3.15. Gân lá cây In vitro ......................................................................... 59 Hình 3.16. Gân lá cây Ex vitro........................................................................ 60 Hình 3.18. Thân cây In vitro ........................................................................... 62 Hình 3.19. Thân cây Ex vitro .......................................................................... 62 Hình 3.20. Thân cây trồng bằng củ ................................................................. 63 vii Hình 3.21. Rễ cây In vitro ............................................................................... 64 Hình 3.22. Rễ cây Ex vitro .............................................................................. 64 Hình 3.23. Rễ cây trồng bằng củ ..................................................................... 65 Hình 3.24. Hạt lipid ......................................................................................... 65 Ảnh 3.25. Mô hình trồng ngoài thực địa ......................................................... 67 Ảnh 3.26. Giai đoạn 3 tháng tuổi .................................................................... 68 Ảnh 3.27. Giai đoạn chuẩn bị thu hoạch ......................................................... 68 Ảnh 3.28. Củ giống thu hoạch ........................................................................ 68 viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BAP Benzylaminopurine NAA α-Naphthaleneacetic acid IBA 3-Indolebutyric acid ĐC Đối chứng PVP Polyvinylpyrrolidone MS Murashige and skoog 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Địa hoàng (Rehmannia glutinosa), một loại thảo dƣợc truyền thống, có giá trị dƣợc liệu cao và đƣợc sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc. Dƣợc liệu Địa hoàng đƣợc sử dụng theo 3 dạng khác nhau: Tiên Địa hoàng (Địa hoàng tƣơi) với công dụng thanh nhiệt, lƣơng huyết điều trị bệnh nóng trong, chảy máu cam, nôn ra máu…; Sinh địa (Địa hoàng khô) công năng tƣ âm, dƣỡng huyết chuyên trị huyết hƣ gây nóng sốt, nôn ra máu, băng huyết, kinh nguyệt không đều, chảy máu cam; Thục địa (rễ củ Địa hoàng đã qua chế biến) công dụng dƣỡng âm, bổ máu, lợi tủy chuyên trị di tinh, âm hƣ ho suyễn, mệt mỏi, hồi hộp, chóng mặt ù tai, kinh nguyệt không đều, rong huyết,... Ở Việt Nam, nhu cầu của thị trƣờng đối với củ Địa hoàng từ 100 - 200 tấn khô/năm, nhƣng hầu hết là nhập khẩu từ Trung Quốc; Năm 2019, Việt Nam mới tự sản xuất đƣợc khoảng 10 tấn (bằng 1/20 nhu cầu). Đây là dƣợc liệu chủ lực đƣợc công ty sản xuất, kinh doanh thuốc và dƣợc liệu nhƣ: Công ty cổ phần Traphaco, công ty cổ phần Nam Dƣợc, công ty cổ phần dƣợc phẩm Yên Bái, công ty cổ phần dƣợc Trung ƣơng Mediplantex sử dụng làm nguyên liệu sản xuất. Do vậy, thị trƣờng tiêu thụ của cây Địa hoàng tại Việt Nam là rất lớn. Theo quyết định 1976/QĐ-TTg của Thủ tƣớng chính phủ, Địa hoàng là một trong 7 loại cây dƣợc liệu đƣợc ƣu tiên nghiên cứu và phát triển tại Phú Thọ giai đoạn 2015 - 2020 và là một trong những loài dƣợc liệu đƣợc Chính phủ phê duyệt phát triển 200 ha/năm trong giai đoạn 2015 - 2020 và định hƣớng phát triển đến năm 2030; Nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp dƣợc tại Việt Nam. Hiện nay, Địa hoàng chủ yếu đƣợc trồng tại một số tỉnh nhƣ Bắc Giang, Hà Giang, Thái Bình, Hƣng Yên với quy mô nhỏ, chỉ từ 2 - 5 ha/tỉnh, năng suất của trung bình đạt 12 - 15 tấn củ tƣơi/ha. Cây Địa hoàng chủ yếu 2 đƣợc trồng bằng lát cắt củ, theo tập quán canh tác ngƣời dân thƣờng chọn những củ nhỏ để làm giống, củ to để bán, qua nhiều thế hệ, cây Địa hoàng đã bị thoái hóa. Mặt khác củ giống hay bị nhiễm bệnh thối nhũn củ, dẫn tới năng suất và chất lƣợng củ Địa hoàng thƣơng phẩm thấp. Một trong những giải pháp tạo ra giống cây trồng sạch bệnh có ƣu thế về sinh trƣởng, phát triển, cho năng suất và chất lƣợng dƣợc liệu cao là nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây Địa hoàng để tạo ra giống cây trồng sạch bệnh, sinh trƣởng phát triển tốt, năng suất cao, mang những đặc điểm ƣu việt của những cây mẹ đã đƣợc tuyển chọn. Nhân giống bằng phƣơng pháp in vitro khắc phục hạn chế của các phƣơng pháp nhân giống truyền thống. Với phƣơng pháp này, hoàn toàn có thể tạo ra một quần thể cây trồng đồng đều, giữ nguyên đặc tính tốt của giống mẹ, hệ số nhân giống cao, sớm cho hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích nhân giống, đáp ứng đƣợc nhu cầu về giống phục vụ cho ngƣời dân. 2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng đƣợc quy trình nhân giống in vitro cây Địa hoàng góp phần tạo nguồn cây giống sạch bệnh, chất lƣợng cao. Đánh giá đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh trƣởng, năng suất của cây Địa hoàng in vitro. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Cây Địa hoàng (Rehmannia glutinosa), mẫu củ đƣợc thu từ những cây mẹ sinh trƣởng, phát triển tốt, sạch virus TMV và CMV trồng tại tỉnh Phú Thọ - Phạm vi nghiên cứu: Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Trung tâm Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu ứng dụng và phát triển, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng. Thời gian: Từ tháng 2 năm 2019 đến tháng 8 năm 2020 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu là cơ sở xác định môi trƣờng thích hợp để cây Địa hoàng nảy chồi tái sinh cây. Tối ƣu môi trƣờng nhân nhanh, tạo số lƣợng lớn chồi cây Địa hoàng in vitro. Tối ƣu môi trƣờng ra rễ tạo cây Địa hoàng in vitro hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm. Xác định chế độ huấn luyện cây trong nhà lƣới, giá thể thích hợp để ra cây. - Ý nghĩa thực tiễn: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro sẽ đƣợc áp dụng trong quá trình sản xuất cây Địa hoàng của ngƣời dân, góp phần tạo nguồn giống cây trồng sạch bệnh cho năng suất cao, chất lƣợng tốt. 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về cây Địa hoàng 1.1.1. Danh pháp, nguồn gốc lịch sử Theo Vũ Tuấn Minh (2008) cây Địa hoàng có nguồn gốc Trung Quốc, hiện nay Trung Quốc đang độc quyền loại sản phẩm này. Các nƣớc khác nhƣ Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam trồng trên quy mô diện tích nhỏ. Trung Quốc hiện nay có hai loại Địa hoàng đƣợc trồng phổ biến nhƣ giống Hoài Khánh ở vùng Hà Nam, giống Kiến Kiều đƣợc trồng phổ biến ở vùng Hàn Châu và Triết Giang. Trong hai giống trên giống Hoài Khánh có phẩm chất tốt hơn nhƣng yêu cầu điều kiện ngoại cảnh khắt khe hơn giống Kiến Kiều. Địa hoàng đƣợc ngƣời Trung Quốc trồng ở nhiều vùng và là mặt hàng xuất khẩu đứng đầu thế giới [4]. Theo Nguyễn Tiến Bân (1997) cây Địa hoàng (Rehmannia glutinosa Libosch) thuộc họ Hoa mõm chó (Scrophulariaceae) là cây thân thảo cao từ 20cm đến 40cm, toàn thân cây có lông trắng mềm. Thân rễ phình thành củ, lúc đầu mọc thẳng, sau đâm ngang, mỗi cây có 5 - 7 củ, củ có cuống dài, vỏ củ màu đỏ nhạt, đƣờng kính thân củ từ 1cm đến 4 cm. Lá hình trứng lộn ngƣợc đến hình bầu dục dài, đuôi lá tù, mép lá có răng cƣa tù không đều nhau, lá có nhiều nếp nhăn, lá dƣới gốc dài hẹp, lá dài từ 3 - 15 cm, rộng từ 1 - 6 cm. Hoa hình chuông mọc thành chùm ở đầu cành, đài hoa hình chuông, bên trên nứt thành 5 cánh, tràng hình ống hơi uốn cong, đầu khía 5 cánh, giống nhƣ hình môi, mặt ngoài màu đỏ tím, mặt trong màu vàng có vân tím, có 4 nhị (2 lớn, 2 bé), rất hiếm khi thấy quả. Quả bế đôi, hình tròn trứng, cánh đài bao úp, nhiều hạt, hình trứng, bé nhỏ, màu nâu nhạt. Năm 1958 giống Địa hoàng đƣợc nhập từ Trung Quốc về Việt Nam, Viện Dƣợc liệu đã nghiên cứu di thực thuần hóa và đƣa vào trồng tại một số tỉnh. [6] [7]. 5 1.1.2. Đặc điểm sinh học và yêu cầu sinh thái 1.1.2.1. Đặc điểm sinh học Hình 1.1. Cây Địa hoàng (Rehmannia glutinosa) Theo tác giả Nguyễn Bá Hoạt và CS. (2005) cây Địa hoàng có các đặc điểm thực vật nhƣ sau: - Thân lá: Thân cây Địa hoàng đƣợc phát sinh từ các điểm sinh trƣởng trên đoạn hom giống. Địa hoàng là loại cây thân thảo, có chiều cao trung bình 40 - 50 cm. Các đốt rất ngắn, mỗi đốt mang một lá. Thân không có khả năng phát sinh cành, các đốt thân phía trên dài ra nhanh ở thời kỳ cây bắt đầu ra hoa. Toàn thân cây có một lớp lông mềm màu tro trắng. Sau khi ra hoa cây đạt chiều cao tối đa. Trên thân lá mọc quanh gốc theo các đốt thân, các lá phía trên và diện tích lá nhỏ. Lá Địa hoàng loại lá đơn nguyên, mép lá có răng cƣa tù, không đều. Phiến lá có nhiều gân chính và gân phụ nổi rõ nhƣng phiến lá vẫn mềm. Trên mặt lá có một lớp lông mềm màu tro trắng làm cho lá có màu lục hơi ngả bạc. - Bộ rễ: Rễ Địa hoàng là bộ phận dùng để làm thuốc bao gồm 4 loại: Rễ hom, rễ tơ, rễ bất định và rễ củ. Trong đó rễ củ là bộ phận thu hoạch. + Rễ hom: Hom củ giống sau khi trồng 8 - 10 ngày thì các mầm trên hom phát sinh rễ. Nhiệm vụ của rễ hom hút dinh dƣỡng ở giai đoạn đầu khi 6 mới trồng. + Rễ tơ: Phát sinh ở phần gốc thân của cây mới mọc từ hom. Rễ tơ thực hiện nhiệm vụ hút nƣớc, dinh dƣỡng cung cấp cho cây trong suốt quá trình sinh trƣởng phát triển. Chúng thƣờng có kích thƣớc nhỏ, ngắn và số lƣợng nhiều (hơn 100 rễ). Sau trồng 30 ngày thì cây con xuất hiện loại rễ này. Khi phát sinh rễ củ thì rễ tơ vẫn phát triển. + Rễ bất định: Đây là loại rễ có khả năng hình thành củ, có thể do điều kiện bất lợi hoặc do nguyên nhân nội tại không thể hình thành củ đƣợc. Kích thƣớc loại rễ này lớn hơn rễ tơ và dài từ 15 - 20 cm, số lƣợng 6 - 10 rễ trên cây. Rễ bất định tiêu hao dinh dƣỡng của cây cho nên cần hạn chế loại rễ này bằng các biện pháp kỹ thuật thích hợp. + Rễ củ: Loại rễ này thƣờng xuất hiện sau trồng 45 - 50 ngày, đây là loại rễ có khả năng tạo củ lớn nhất và quyết định năng suất của Địa hoàng. Rễ củ có đƣợc hình thành hay không và hình thành sớm hay muộn đƣợc quyết định bởi sự phân hoá nội tại kết hợp với ảnh hƣởng của các điều kiện ngoại cảnh cụ thể. Khi mới xuất hiện loại rễ này có biểu hiện bên ngoài nửa giống nhƣ rễ bất định, nửa nhƣ rễ tơ. Sau đó nhờ sự phân hoá bên trong, đặc biệt là sự phân hoá của tế bào tƣợng tầng, sự phát triển của bó mạch libe sơ cấp và thứ cấp mà hình thành nên củ Địa hoàng. Phần sát gốc với thân của củ kém phát triển tạo thành cuống củ có chiều dài vào khoảng 4 - 7 cm, chiều dài của củ từ 15 - 20 cm, có đƣờng kính củ biến động 0,5 - 3,4 cm, vỏ củ màu hồng nhạt, phần ruột có màu vàng nhạt. Trên củ địa hoàng có rất nhiều điểm sinh trƣởng và rất dễ nảy mầm ngay tại ruộng nếu nhƣ tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng. - Hoa, quả và hạt: Hoa Địa hoàng là hoa tự chùm, phát sinh từ đỉnh sinh trƣởng của thân. Đài và cánh hoa đều hình chuông. Hoa có 5 cánh, phía dƣới hợp và hơi cong, dài 3 - 4 cm; Mặt ngoài màu tím sẫm, mặt trong hơi vàng và có những đốm tím. Hoa có 4 nhị gồm 2 nhị lớn và 2 nhị lại kém phát triển. 7 Trong điều kiện sinh thái của Trung Quốc hoa Địa hoàng ra vào tháng 3 - 4 và kết quả vào tháng 5 - 6, mỗi quả có từ 200 - 300 hạt, hạt nhỏ có màu nâu nhạt, dạng hình trứng. Khối lƣợng nghìn hạt là 0,15 g. Trong điều kiện sinh thái của Việt Nam, Địa hoàng thƣờng có hoa nhƣng không kết hạt, vì vậy phải nhân giống vô tính. [3] 1.1.2.2. Yêu cầu sinh thái Địa hoàng là cây có sức sinh trƣởng tƣơng đối yếu, do đó chỉ thích nghi với khí hậu ôn hoà, đầy đủ ánh sáng, đất đủ dinh dƣỡng, thoát nƣớc tốt, có độ xốp và độ dày tầng canh tác cần thiết. Theo tác giả Đỗ Tất Lợi (2012), Nguyễn Bá Hoạt và CS. (2005) các yêu cầu sinh thái cần thiết cho cây Địa hoàng phát triển là: - Nhiệt độ: Khoảng nhiệt độ thích hợp cho cây phát triển là 18 - 25oC, ngoài khoảng nhiệt độ này Địa hoàng sinh trƣởng phát triển kém. Nếu nhiệt độ dƣới 10oC thì cây bắt đầu ngừng sinh trƣởng và có những biểu hiện ra bên ngoài từ màu lá xanh chuyển sang màu lá tím thẫm, nếu nhiệt độ thấp và kéo dài 10 ngày thì lá không thể khôi phục đƣợc chức năng quang hợp và dần chết. Nếu nhiệt độ cao quá làm cho cây sớm phát triển gây mất cân đối, cây sớm ra hoa, số lá ít, sự tích luỹ dinh dƣỡng về củ kém. Nắng nhiều, nhiệt độ cao làm cho lá bị khô xém, dễ bị nhiễm bệnh. - Ẩm độ: Ẩm độ đất thích hợp trong thời kỳ nảy mầm là 65 - 70%. Thời kỳ sinh trƣởng thân, lá và hình thành rễ củ là 70 - 75%; Thời kỳ củ già, chín cần 65 - 70%. Khi thu hoạch cần ẩm độ 60 - 65%. Thời kỳ củ già, vào giai đoạn thu hoạch nếu có mƣa lớn, ẩm độ đất quá cao củ dễ bị bệnh và thối nhũn. - Lƣợng mƣa: Một trong những yếu tố cần quan tâm đến trong quá trình trồng Địa hoàng là sự phân bố lƣợng mƣa các tháng trong năm. Để có năng suất ổn định thì lƣợng mƣa cần phân bố tƣơng đối đều. Tuy nhiên trong 3 tháng đầu lƣợng mƣa yêu cầu nhiều hơn các tháng sau. Các vùng có lƣợng 8 mƣa từ 1500 - 1800 mm/ năm có thể trồng đƣợc Địa hoàng. - Đất đai: Địa hoàng là cây ƣa đất có thành phần cơ giới nhẹ, đất cát pha là loại đất thích hợp nhất. Đất mới khai hoang có độ phì cao, tầng canh tác tƣơng đối dày, giữ nƣớc và thoát nƣớc tốt, đất đồi có độ dốc 5 - 10o có thể trồng đƣợc Địa hoàng. Các loại đất sét, đất thịt nặng, nghèo dinh dƣỡng không nên trồng sinh địa. Độ pH thích hợp sẽ cho Địa hoàng sinh trƣởng phát triển tốt từ 5,5 - 7,0. Vì vậy khi trồng trên đất chua cần phải bón vôi. 1.1.3. Các thời kì sinh trưởng của cây Địa hoàng Thời gian sinh trƣởng của cây Địa hoàng thƣờng kéo dài từ 150 - 180 ngày với 3 thời kỳ chính (Vũ Tuấn Minh, 2009) : - Thời kỳ nảy mầm: Thời kỳ nảy mầm đƣợc xác định từ có 75 % số cây mọc trên đồng ruộng đến khi cây đạt 4 - 5 lá thật. Trong điều kiện bình thƣờng, thời kỳ này kéo dài 25 ngày, trong điều liện bất lợi nhƣ hạn hán hay gặp rét có thể kéo dài hơn 1 tháng. Trong giai đoạn này sức sinh trƣởng của Địa hoàng phụ thuộc vào chất lƣợng hom giống, hạt giống và các điều kiện ngoại cảnh khác nhƣ nhiệt độ, ẩm độ đất, độ sâu lấp đất. Cây con trong giai đoạn này yếu, dinh dƣỡng chủ yếu dựa vào hom giống, thân lá sinh trƣởng chậm. [4] - Thời kỳ sinh trƣởng thân lá và hình thành củ: Sau khi cây đạt 4 - 5 lá thật, bộ rễ hút dinh dƣỡng để nuôi cây. Sức sinh trƣởng của cây mạnh dần lên, khi cây đƣợc từ 5 - 6 lá thì tốc độ ra lá tăng, trung bình 5 - 10 ngày cây ra đƣợc 1 lá. Số lá đạt tối đa cho từng giống khác nhau, dao động từ 24 - 25 lá đến 37 - 38 lá. Khi cây có 9 - 10 lá thật là giai đoạn tăng nhanh về số lá và rễ củ đƣợc hình thành và phát triển. Sau trồng 65 ngày tốc độ củ tăng mạnh nhất. Thời gian đầu, củ chủ yếu phát triển về chiều dài, sau đó củ sẽ phát triển về đƣờng kính và đạt cực đại sau trồng 85 - 90 ngày. Tại thời điểm này các bộ phận trên mặt đất đạt tối đa về đƣờng kính tán, tổng số lá trên cây. Bộ phận dƣới mặt đất có bƣớc nhảy vọt về tích luỹ các chất đƣờng và Glucosid. Cùng 9 lúc đó phía ngọn cây, mầm nách xuất hiện nụ hoa. Lúc này dinh dƣỡng cần cho sự tích luỹ trong củ và ra hoa. [5] - Thời kỳ củ già chín: Khi cây sinh trƣởng đƣợc 140 ngày thì sức sinh trƣởng của cây chậm dần, đƣờng kính tán giảm xuống, các lá phía dƣới rụng dần, các lá phía trên chuyển từ màu xanh sang màu xanh vàng rồi héo. Dƣới mặt đất củ Địa hoàng đạt tới độ lớn nhất cả về chất và về lƣợng, đây là thời kỳ bƣớc vào thu hoạch cho năng suất cao nhất, chất lƣợng tốt nhất. Trong điều kiện bình thƣờng một cây có từ 8 - 14 rễ củ, nhƣng chỉ có 3 - 5 rễ hình thành củ. Những rễ hình thành củ thƣờng nằm ở vị trí gần mặt đất, khi thiếu dinh dƣỡng rễ củ sẽ trở thành rễ bất định, bởi vậy chúng ta cần phải tạo mọi điều kiện để tất cả rễ củ đều thành củ. 1.1.4. Thành phần hóa học và ứng dụng dược lý Đỗ Huy Bích và CS. (2003) có đề cập đến thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý của cây Địa hoàng nhƣ sau: - Thành phần hoá học: Trong rễ Địa hoàng có catalpol, mannit, rehmannin, glucose, carotene và có tới 15 acid amin và D-glucozamin, acid phosphorie và các cacbohydrat, chủ yếu là stachyoza; Còn có chất campesterol. - Tác dụng dƣợc lý: + Tác dụng đối với huyết đƣờng: Khi dùng nƣớc sắc Địa hoàng hay dùng Remanin 0,5 g/kg khối lƣợng tiêm cho thỏ thì huyết đƣờng giảm xuống, sau 7h mới trở lại bình thƣờng vì vậy ngƣời ta cho rằng trong cây Địa hoàng có một loại chất tan trong nƣớc, có phản ứng trung tính, màu vàng nhạt giống nhƣ dầu, có thể chứa nitơ và sulfua làm giảm huyết đƣờng trong máu. + Tác dụng với huyết quản: Khi dùng Địa hoàng với liều lƣợng nhỏ thì làm co mạch máu, liều lƣợng lớn thì làm giãn mạch máu, có tác dụng lên tĩnh mạch, làm gây mê động vật thí nghiệm. Ngoài những tác dụng trên Địa hoàng còn có các tác dụng khác nhƣ cầm máu, ức chế quá trình hình thành kén của 10 một số loại vi trùng. Theo y học cổ truyền Địa hoàng có vị ngọt hơi đắng, tính hàn, vào bốn kinh Tâm, Can, Thận và Tiểu trƣờng, có tác dụng thanh nhiệt, mát máu, ức chế huyết đƣờng, lợi tiểu, mạnh tim nên thƣờng đƣợc dùng trong các bệnh thiếu máu, suy nhƣợc, tiểu đƣờng, chảy máu, rong kinh. 1.2. Phƣơng pháp nhân giống Địa hoàng 1.2.1. Kỹ thuật nhân giống in vitro Địa hoàng ở Trung Quốc từ thời xa xƣa vẫn đƣợc nhân giống bằng hạt. Nhƣng cây trồng bằng hạt phải mất 2 năm mới cho thu hoạch, nên từ những năm 1911, nó đã chuyển sang nhân giống bằng lát cắt rễ củ (Xu and Davey, 1983). Hạt Địa hoàng chỉ còn đƣợc dùng trong lai tạo giống mới. [23] Từ khi di thực vào Việt Nam đến nay Địa hoàng vẫn đƣợc nhân giống bằng lát cắt rễ củ. Lựa chọn những củ Địa hoàng kích thƣớc vừa phải, cắt thành những đoạn nhỏ dài 1 - 2 cm. Xử lý hai đầu lát cắt bằng tro, vôi hoặc xi măng rồi đem trồng trực tiếp ra ngoài đồng ruộng. Mầm củ thƣờng mọc vào mùa xuân ở nhiệt độ thích hợp từ 18 - 25oC. Sau khi trồng 35 - 45 ngày, cây bắt đầu ra rễ củ và rễ phát triển nhanh chóng vào cuối tháng 7 đến giữa tháng 10, sau 140 ngày có thể thu hoạch củ Địa hoàng. Thực tế trong sản xuất, củ Địa hoàng thƣờng bị nhiễm virus và nấm làm ảnh hƣởng trực tiếp đến năng suất và chất lƣợng củ Địa hoàng. Bên cạnh đó việc nhân giống bằng hạt không thể thực hiện đƣợc do tỷ lệ nhân giống thấp, chất lƣợng cây giống kém. Cây Địa hoàng ngày càng bị thoái hóa do bị nhiễm virus, nấm bệnh hay do nhân giống sinh dƣỡng liên tiếp qua nhiều thế hệ. Năng suất củ giảm cũng do trình độ canh tác của nông dân, đồng thời việc thƣờng chọn các củ lớn để bán, những củ nhỏ dùng để làm giống cũng làm ảnh hƣởng đến năng suất (Bajai, 1988). [11] Về mặt thời vụ, ở nƣớc ta hình thành hai vụ chính: Vụ xuân hè và vụ thu đông. Vụ thu đông năng suất và chất lƣợng rễ củ tốt hơn vụ xuân hè nên đƣợc coi là vụ chính để trồng lấy dƣợc liệu. Khó khăn chủ yếu là vụ xuân hè