Tài liệu Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật để hoàn thiện quy trình nhân nhanh trong nuôi cấy mô hoa phong lữ thảo

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA NÔNG – LÂM – NGƢ Phùng Thị Thanh Mai “NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT ĐỂ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN NHANH TRONG NUÔI CẤY MÔ HOA PHONG LỮ THẢO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Nhóm ngành: Khoa học cây trồng Giảng viên hướng dẫn 1: ThS. Trần Thành Vinh 2: ThS. Nguyễn Viết Dũng Phú Thọ, 2017 2 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài khóa luận này, em luôn nhận được sự nhiệt tình giúp đỡ về nhiều mặt của các thầy cô giáo và gia đình. Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: ThS. Trần Thành Vinh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài khóa luận. TS.Lê Đức Thảo,Trưởng bộ môn Đột biến & Ưu thế lai, Th.s Nguyễn Viết Dũng, Viện Di truyền Nông nghiệp đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, cán bộ công nhân viên tại bộ môn Đột biến & Ưu thế lai, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam, gia đình, người thân và toàn thể bạn bè đã động viên, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Qua đây em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Trường Đại học Hùng Vương đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho em trong thời gian học tập. 3 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BAP : 6-Benzylaminopurine CT : Công thức CV (%) : Sai số thí nghiệm ĐC : Đối chứng Kin : Kinetin (6 –furfrylaminopurine) LSD0,05 : Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5% MS : Môi trường Murashige and Skoog TB : Trung bình α – NAA : Axit α – naphtyl axetic PLT : Phong lữ thảo 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Phong lữ thảo (Pelargonium Sp) là một loài hoa đẹp, với những chiếc lá to tròn, mềm mại, dịu dàng, vẻ đẹp của cây với màu sắc hoa phong phú đa dạng đỏ, vàng, trắng, phấn hồng…Phong lữ thảo có nguồn gốc từ các nước vùng Địa Trung Hải, hiện được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Từ khi hoa bắt đầu nở cho đến khi tàn kéo dài hơn 2 tuần. Cụm hoa Phong lữ thảo càng rực rỡ thêm khi vươn thẳng trên đám lá xanh mướt, hoa có độ bền lâu, hài hoà với thân cành nên có giá trị thẩm mỹ cao khi được trồng ở chậu hay trang trí trong gia đình, khuôn viên, vườn hoa… Ngoài tác dụng làm đẹp cảnh quan, trồng chậu trang trí; trong y học, Phong lữ còn là loại thuốc bổ chống suy nhược và có khả năng khử trùng. Đặc biệt, cuống hoa, lá và hoa còn được dùng chưng cất tinh dầu hay sản xuất các loại nước hoa dành cho nam giới. Mặc dù mới du nhập vào nước ta, song nhờ các đặc điểm ưu việt trên mà hoa Phong lữ thảo đã được người sản xuất cũng như người tiêu dùng rất ưa chuộng và hiện đang là một trong những loại hoa trồng chậu đang được phát triển, có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, năng suất cũng như chất lượng hoa cung cấp cho thị trường còn rất hạn chế bởi do Phong lữ thảo là giống hoa mới nhập, chưa đáp ứng được nhu cầu sử dụng của người tiêu dùng. Phương pháp nhân giống hoa Phong lữ thảo hiện nay chủ yếu là giâm cành và gieo hạt được áp dụng phổ biến tuy nhiên hai phương pháp này còn có những mặt hạn chế như giống cây đem giâm vẫn nhiễm bệnh, không đồng đều… Chính vì vậy, hiện nay phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào được áp dụng một cách phổ biến hơn để khắc phục được những hạn chế của các phương pháp cổ điển. Với phương pháp này, hoàn toàn có thể tạo ra một quần thể cây trồng đồng đều, giữ nguyên đặc tính tốt của giống mẹ, hệ số nhân giống cao, sớm cho hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích nhân giống. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu sử 2 dụng của nguời tiêu dùng với chất lượng cây giống cao với số lượng lớn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật để hoàn thiện quy trình nhân nhanh trong nuôi cấy mô hoa Phong lữ thảo” 2. Mục tiêu của đề tài Góp phần xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro hoa Phong lữ thảo. 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học giúp hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống hoa Phong lữ thảo - Đối với nghiên cứu khoa học: Giúp sinh viên tiếp cận với công tác nghiên cứu khoa học, nâng cao trình độ chuyên môn đồng thời tạo cho mình tác phong làm việc đúng đắn, nghiêm túc, sáng tạo, đúc rút được những kinh nghiệm thực tế. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Qua kết quả nghiên cứu đề tài góp phần hoàn thiện quy trình nhân nhanh hoa Phong lữ thảo ứng dụng vào thực tiễn sản suất, nâng cao chất lượng hoa trồng. 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc, vị trí, phân loại của cây hoa Phong lữ thảo Phong lữ thảo (Pelargonium sp) có nguồn gốc tại Nam Phi, Reunion, Madagascar, Ai Cập và Maroc, sau đó mới được phát triển ra các nước Châu Âu như Ý, Tây Ban Nha và Pháp vào thế kỷ 17. Hiện nay hoa Phong lữ thảo phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, đặc biệt là vùng ôn đới và khu vực miền núi của vùng nhiệt đới Địa Trung Hải rất thích hợp cho loại hoa này phát triển . Phong lữ thảo có: Tên khoa học: Pelargonium sp Chi: Pelargonium Họ: Geraniaceae (Mỏ hạc) Bộ: Geraniales. 1.1.1. Đặc điểm thực vật học của cây hoa Phong lữ thảo - Lá : Lá của cây Phong lữ thảo thường có hình dạng lá tròn, lá xẻ thuỳ với răng cưa nhỏ, bên trong mặt lá có các vòng tròn thẫm, kích thước bản lá to, màu xanh sẫm. - Hoa: Hoa của cây Phong lữ thảo có dạng chùm, cánh hoa có hình bầu dục, mỗi bông hoa là một cụm hoa dạng đầu, bao gồm những bông con tập hợp lại với nhau. Tập hợp nhiều bông hoa trên một cành hoa. - Quả và hạt: Quả của cây Phong lữ thảo có dạng quả nang, quả dài và mảnh, trên một cành hoa có nhiều bông hoa, mỗi bông sau khi tàn chỉ có duy nhất một quả và có một hạt màu đen bên trong. Bình quân mỗi cành hoa cho từ 10 - 20 hạt. - Thân: Cây Phong lữ thảo thuộc dạng thân bụi, chiều cao trung bình từ 20 đến 50cm, có khả năng phân cành mạnh nên trong sản xuất phải cắt tỉa cành để tập trung dinh dưỡng cho các cành chính phát triển và tạo tán cho cây phù hợp với yêu cầu trồng chậu. 4 - Rễ: Rễ cây Phong lữ thảo không ăn sâu và có nhiều rễ nhỏ, phát triển theo chiều ngang ở tầng mặt đất, với số lượng rễ nhiều nên khả năng hút nước và chất dinh dưỡng của cây rất mạnh, nên khi trồng chậu cho Phong lữ thảo đường kính chậu thích hợp sẽ giúp cho bộ rễ phát triển tốt, tránh được những ảnh hưởng bất thường của thời tiết như nắng nóng, khô hạn. 1.1.2. Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa Phong lữ thảo 1.1.2.1. Ánh sáng Ánh sáng là một yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển của cây hoa. Ánh sáng cung cấp năng lượng cho phản ứng quang hợp tạo ra chất hữu cơ cho cây. Để hoa Phong lữ thảo đạt năng suất, chất lượng cao thì ánh sáng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình ra hoa của cây. Tuy nhiên, nếu để cây chịu ánh sáng trực tiếp liên tục và nhiệt độ cao có thể làm ảnh hưởng tới khả năng quang hợp của lá, làm cho lá bị héo, ngay cả khi làm ẩm ướt, ngoài ra có thể gây đỏ cuống lá và thân cây. Cường độ ánh sáng là nguyên nhân chính ảnh hưởng tới chiều cao cây cũng như khả năng ra hoa cây Phong lữ thảo. (Nguyễn Xuân Linh, 2000). 1.1.2.2. Nhiệt độ Nhiệt độ tối ưu trong ngày phụ thuộc vào cường độ ánh sáng. Phong lữ thảo là cây có nguồn gốc ôn đới nên thích hợp ở những nơi có khí hậu mát mẻ, có biên độ nhiệt độ ngày và đêm cao cây sẽ sinh trưởng, phát triển tốt. Độ ẩm không khí thích hợp 80 - 85%, nhiệt độ thích hợp 18 đến 22 0C ban ngày, ban đêm 15 đến 170C là tốt nhất. 1.1.2.3. Đất và dinh dưỡng Giá thể đối với Phong lữ thảo hết sức quan trọng, giá thể có thể là trấu hun, xơ dừa, mùn cưa…giá thể giúp cho cây đứng vững và là nơi giữ, cung cấp nước, dinh dưỡng cho cây trong suốt quá trình sinh trưởng, phát triển. Ngoài ra còn phải cung cấp dinh dưỡng qua đất bằng cách bón các loại phân trực tiếp vài đất trồng và cung cấp dinh dưỡng qua lá bằng cách phun các loại phân bón lá thích hợp. Đối với đất, Phong lữ thảo có thể trồng trên bất cứ một loại đất nào, tuy nhiên đất phải có cấu trúc tốt và thoát nước. Trong suốt quá 5 trình trồng, đất phải luôn tơi xốp và bề mặt đất phải đủ ẩm. Nhìn chung, Phong lữ thảo ưa đất có thành phần cơ giới nhẹ, nhiều mùn và có hàm lượng dinh dưỡng cao như đất mùn trên núi, đất phù sa…. để đạt được hiệu quả trang trí cao thì việc phối hợp giữa các giá thể xơ dừa, mùn, trấu hun...và đất là một trong những khâu hết sức quan trọng để hoa Phong lữ thảo đạt năng suất chất lượng cao. 1.1.3. Giá trị sử dụng - Hoa đẹp cả về màu sắc và hình dáng hoa lá, được trồng làm hoa trang trí phòng khách, bàn làm việc, trang trí không gian sinh hoạt của gia đình…hay làm quà tặng khách hàng, tặng bạn bè, người thân… - Có thể trồng hoa Phong Lữ thành từng luống hoặc trong chậu cảnh để xếp thành những thảm hoa trang trí thuần màu hay xen kẽ với nhiều màu sắc khác nhau trong khách sạn, biệt thự, lối đi nơi công viên,…nhìn rất đẹp mắt và sinh động. - Ngoài tác dụng làm đẹp cảnh quan, trồng chậu trang trí; trong y học, Phong Lữ còn là loại thuốc bổ chống suy nhược và có khả năng khử trùng. Đặc biệt, cuống hoa, lá và hoa còn được dùng chưng cất tinh dầu hay sản xuất các loại nước hoa dành cho nam giới. 1.2. Tình hình sản xuất hoa trồng chậu, trồng thảm trên thế giới và ở Việt Nam 1.2.1. Tình hình sản xuất hoa trồng chậu, trồng thảm trên thế giới Ngày nay sản xuất hoa trồng chậu, trồng thảm trên thế giới đang phát triển một cách mạnh mẽ và đã trở thành một ngành thương mại cao. Sản xuất hoa trồng chậu, trồng thảm đã mang lại lợi ích to lớn cho nền kinh tế các nước trồng hoa, cây cảnh, trong đó có các nước Châu Á. Năm 2000 lượng tiêu thụ hoa chậu trên thế giới vào khoảng 20 đến 23 tỷ USD. Mỹ nhập khẩu khoảng 1/3 lượng hoa chậu trên thế giới, sau đó là Đức 20%, rồi đến Pháp và Ý. Các nước xuất khẩu hoa chậu lớn nhất thế giới là Hà Lan, Đan Mạch và Bỉ khoảng 1,75 tỷ USD năm 1995. (Lê Xuân Tảo, 2004) [2] . Theo Terril A. Nell (2004), hoa trồng chậu chiếm một phần quan trọng trong sản xuất trồng hoa ở Mỹ (20,3% của ngành trồng hoa) trong đó 6 năm tiểu bang là California, Florida, Texas, Pennsylvania, New York chiếm tới 53% sản xuất hoa trồng chậu ở nước này. Thời vụ chủ yếu là vào mùa xuân và mùa hè, đặc biệt là tháng tư và tháng sáu thì hoa Phong lữ thảo được sản xuất và bán ra thị trường rất lớn. Phong lữ thảo trồng chậu được xếp hạng là một trong số các loại hoa trồng chậu tiêu thụ cao ở thị trường nước Mỹ. Ở Châu Á, Nhật Bản là nước sản xuất hoa trồng chậu lớn nhất (chủ yếu phục vụ nội tiêu) năm 1994 diện tích hoa cắt cành khoảng 18.000ha, diện tích hoa trồng chậu 2000ha). Tiếp theo là Isarael, Ấn độ và một số nước Đông Nam Á và Nam Á khác như Thái Lan, Maylaysia, Hàn Quốc và Trung Quốc. Hiện nay, Trung Quốc có xu hướng phát triển mạnh hoa trang trí, bao gồm các loại hoa như: hoa Báo xuân (Primula), Trạng nguyên, Thu hải đường (Begonia)... với diện tích khoảng trên 60.000ha, các loại cây này chủ yếu xuất khẩu sang một số nước Asean, trong đó có miền Bắc Việt Nam. Thành phố Côn Minh là thủ phủ của tỉnh Vân Nam, Trung Quốc, với lợi thế về thiên nhiên và khí hậu tương tự như Sapa, có thể thấy Côn Minh tràn ngập đủ loại hoa và đủ màu sắc khác nhau. Trên hè phố, trong các ô vuông trồng cây lấy bóng mát cũng được trang trí bằng các chậu hoa nhỏ, màu sắc rất sặc sỡ. Sản xuất hoa có thể xem là ngành chủ chốt của Côn Minh, nơi cung cấp 70% hoa tươi cho Trung Quốc. 1.2.2. Tình hình sản xuất hoa trồng chậu, trồng thảm ở Việt Nam Tại Việt Nam, sản xuất hoa chậu chủ yếu tập trung ở một số tỉnh phía Nam như Gò Vấp, Thủ Đức, Vĩnh Long, Tiền Giang, Thành Phố Hồ Chí Minh. Đà Lạt là nơi sản xuất hoa nổi tiếng của nước ta, năm 2003 diện tích trồng hoa của Đà Lạt chỉ 743ha, đến năm 2005 diện tích đã tăng lên 1063ha hoa các loại và đến nay năm 2009 xấp xỉ 3000ha. Hiện Đà Lạt có nhiều cá nhân và công ty sản xuất hoa chậu như Công ty TNHH Bonie Farm, công ty TNHH Lang Biang, Công ty quản lý công trình đô thị, công ty TNHH Ánh Minh, Công ty Dalat Hasfarm và các nông hộ chuyên bán hoa chậu dọc đường Nguyễn Thị Minh Khai, khu Hoà Bình, các điểm du lịch. Hoa chậu Đà Lạt không những cung cấp cho nhu cầu của địa phương mà còn đáp ứng 7 người tiêu dùng nhiều tỉnh, thành trong cả nước. Mỗi độ xuân về, hoa chậu Đà Lạt theo những chuyến xe đi khắp nẻo đường đất nước để đến với Hà Nội, Đà Nẵng, Nha Trang… đem niềm vui, hương sắc của những loại hoa ôn đới, làm tô đẹp thêm không gian của nhiều ngôi nhà. Sa Pa, là vùng du lịch nổi tiếng ở khu vực phía Bắc với điều kiện thiên nhiên thuận lợi nên có tiềm năng phát triển hoa rất lớn. Ngoài các loại hoa ôn đới như Hồng, Lay ơn, Cẩm chướng, Địa Lan … thì việc sản xuất hoa trồng chậu, trồng thảm ở Sapa đã và đang phát triển tuy nhiên còn khá khiêm tốn. Thị trường hoa cao cấp mới chỉ phát triển trong địa bàn tỉnh Lào Cai, chưa có thị trường và thương hiệu ở các vùng tiêu thụ lớn như Hà Nội, Hải Phòng, Quang Ninh…. Một số giống hoa trồng chậu hiện được thị trường trong nước ưa chuộng như: hoa Mào gà (Celosia argentea), Cúc lá nho (Cineraria), Mai Địa thảo (Impatiens walleriana), Dạ yến thảo (Petunia), Phong lữ thảo (Pelargonium sp.), Thu hải đường (Begonia)….Trong đó 3 loại hoa Dạ yến thảo, Phong lữ thảo, Thu hải đường có thể trồng được quanh năm ở những nơi có khí hậu mát mẻ như Đà Lạt, Sapa, Mộc Châu. Ngoài ra, 3 loại hoa này cũng có thể trồng và trang trí ở các thành phố lớn như Hà Nội, TP Hồ Chí Minh, Hải Phòng… trong các dịp lễ tết như: 30/4, 1/5, 20/10, tết Dương lịch, Âm lịch…. Phong lữ thảo là một trong những loài hoa đẹp, hoa dày lộ trên mặt tán, rực rỡ trên chậu cộng với chiều cao vừa phải, rất thích hợp cho trang trí trong phòng khách, cửa sổ…, tuy nhiên yêu cầu về nhiệt độ của loài hoa này không quá khắt khe, Phong lữ thảo yêu cầu nhiệt độ sinh trưởng phát triển tốt khoảng 18 – 22 0C ban ngày và khoảng 15 – 17 0C vào ban đêm. Hà Nội là nơi tiêu thụ, trang trí hoa trồng chậu nhiều nhất qua các ngày lễ lớn của đất nước. Hoa được trang trí khắp nơi trên địa bàn Hà Nội như: Hồ Gươm, Công viên, các đường phố lớn. Các giống hoa trồng chậu dùng để trang trí chủ yếu là Phong lữ thảo, Thu hải đường, Trạng nguyên…được lấy từ trong nước là Đà Lạt, Sapa và một số ít là từ hoa Côn Minh ở Trung Quốc. Rõ ràng, hoa trồng chậu, trồng thảm đang là một trong những xu hướng phát triển mới của người trồng hoa khi mà nhu cầu chơi hoa, trang trí khuôn viên, khách sạn ngày càng tăng. Hoa Phong lữ thảo 8 đã và đang trở thành đối tượng được các nhà nghiên cứu và sản xuất trong và ngoài nước quan tâm. 1.3. Tình hình nghiên cứu hoa ở Việt Nam và trên thế giới 1.3.1. Tình hình nghiên cứu hoa trên thế giới * Những nghiên cứu về nhân giống Các nhà nghiên cứu thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Quảng Châu, Trung Quốc đã xác định, khi nhân giống in vitro Phong lữ thảo từ lá non và cuống lá cho thấy 6-benzyladenine, thidiazuron và kinetin là hiệu quả nhanh ra chồi non. Còn 4-dichlorophenoxyacetic acid và Naphthaleneaceticd chỉ có hiệu quả trong việc kích thích ra rễ. Điều này cho thấy cytokinin đóng một vai trò quan trọng trong việc nhân giống hoa Phong lữ thảo bằng lá non và cuống cây. Trong nghiên cứu về vấn đề xác định vi khuẩn trong nuôi cấy mô Phong lữ thảo, tác giả G.Reuther cho biết, đối với hoa Phong lữ thảo khi nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô thì dễ bị lây lan loại vi khuẩn Endopytic và các chất ô nhiễm khác. Bằng phương pháp thử nghiệm vi khuẩn và sự phân bố của chất ô nhiễm ở phần lát cắt gây ảnh hưởng tới khả năng tạo nốt sần và hình thành chồi non. Theo Razdan (2003) và Batra (2001)[7] thì sự kết hợp tốt của auxin và cytokinin là cần thiết cho sự hình thành callus. Tăng sinh khối tối đa ở môi trường có sự kết hợp hoocmon MS với 20 µM IBA + 10 µM KIN, 20 µM IBA + 10 µM BAP và 20 µM IAA +10 µM KIN. Theo Saxena (2002) trong nghiên cứu của mình về phương pháp in vitro cho việc nhân giống Phong lữ thảo đã phát hiện ra rằng MS và bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA có hiệu quả trong nhân nhanh chồi Phong lữ thảo. Theo Sreedhar (1999)[20] đã báo cáo rằng số lượng chồi lớn nhất trong việc nhân giống Phong lữ thảo in vitro đã được quan sát ở môi trường BAP và IAA ở mức 1 mg/l là tốt nhất cho sự nhân chồi. * Nghiên cứu về giá thể 9 Tác giả Bunt (1965) , đã sử dụng hỗn hợp cho gieo hạt (tính theo thể tích) 1 than bùn + 1 cát + 2,4 kg/m3 đá vôi nghiền đều cho cây con mập, khoẻ. Theo JR Keseler, Đại học Auburn (1998), để Phong lữ thảo bền đẹp và hoa lâu tàn thì cần chú ý trong việc lựa chọn kích thước đường kính chậu hợp lý, cắt xén tỉa rễ khi cây sang năm thứ 2, bên cạnh đó để giá thể trồng chậu cũng cần được thay mới và pH 5,8-6,2. Giá thể tốt cho Phong lữ thảo là phải tơi xốp, nhẹ và thoát nước tốt như rêu, than bùn, rong biển, đá trân châu, vỏ thông hoặc đất sét nung trộn đều và thêm một ít đá vôi dolomitic, supe lân, các vi chất dinh dưỡng. Theo George Kueper (2004) xơ Dừa là một sản phẩm cung cấp giá thể tốt cho hoa trồng chậu của Mỹ. Hầu hết xơ dừa được nhập từ Ấn Độ, SriLanka, Philippines, Indonesia và Trung Mỹ. So với than bùn thì xơ dừa có pH từ 5,5-6,8 và thường chứa các hàm lượng kali, natri, clo cao hơn than bùn. Thời gian sử dụng xơ dừa cũng tăng lên gấp 2-4 lần so với than bùn, phân và nước giữ ẩm tốt hơn than bùn vì không có cutin sáp ngăn cản. Kết quả nghiên cứu của Jiang Qing Hai (2004) cho thấy, để cây sinh trưởng, phát triển tốt khi phối chế các vật liệu trồng cây cần chú ý các điều kiện cơ bản gồm các tính chất: - Tính chất vật lý, chủ yếu là mức độ tơi xốp, thông thoáng khí, khả năng hấp thu, khả năng hút nước và độ dày của vật liệu. - Tính chất hoá học, chủ yếu là độ chua (trị số pH) và mức độ hút dinh dưỡng. Nếu vật liệu có khả năng hấp thu giữ các ion dinh dưỡng khó bị nước rửa trôi mới có thể giải phóng dinh dưỡng cung cấp cho cây, hoặc vật liệu trồng có lượng trao đổi ion khá cao có thể tích nhiều dinh dưỡng. Nếu lượng trao đổi ion khá thấp chỉ tích được một ít dinh dưỡng thì cần phải thường xuyên bón phân. Đồng thời, lượng trao đổi ion cao còn có thể hạn chế tốc độ biến đổi trị số pH. - Tính chất kinh tế, chủ yếu là mức độ hữu hiệu của vật liệu nuôi cấy có thể sử dụng lại, dễ lấy, tiện cho việc trộn, sạch sẽ, không mùi, giá cả rẻ. 10 Tác giả Northen (1974)[16] cho rằng, giá thể gồm 3 phần vỏ thông xay nhuyễn + 1 phần cát (hoặc 8 phần osminda xay nhuyễn) + một phần than vụn, phù hợp cho việc cấy cây phong lan con lấy từ ống nghiệm . Giá thể này cho tỉ lệ sống của cây lan con cao và sinh trưởng, phát triển tốt. *Những nghiên cứu về phân bón và chế phẩm dinh dưỡng Một số nghiên cứu gần đây cho thấy chế phẩm phân bón hỗn hợp có tác dụng đối với cây trồng tốt hơn so với từng loại vi sinh vật riêng rẽ như E2001. Các sản phẩm phân bón thế hệ mới chứa đựng một tập hợp các vi sinh vật như cố định nitơ tự do, kích thích sinh trưởng, phân giải phosphate khó tan, kiểm soát vi sinh vật gây bệnh.... Hiệu quả sử dụng của các chế phẩm hỗn hợp này đối với từng loại cây trồng và từng tổ hợp vi sinh vật không giống nhau, do sự phong phú đa dạng của hệ vi sinh vật đất và tác động qua lại của các vi sinh vật với nhau, cũng như đối với cây trồng và điều kiện môi trường. Khi nghiên cứu về dinh dưỡng cho Phong lữ thảo, các nhà nghiên cứu thuộc Đại học Aubum, Hoa Kỳ đã nhận thấy: để Phong lữ thảo cho hoa thường xuyên và đạt năng suất cao thì việc thử nghiệm, phân tích và mô tả những thành phần quan trọng như đất, dinh dưỡng, nước…là những yếu tố thúc đẩy, khắc phục kịp thời để tốc độ tăng trưởng của cây không bị ảnh hưởng bất lợi. Các thành phần dinh dưỡng như Nitơ, Photpho, Kali... đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của cây, chúng phải được bổ sung theo một tỷ lệ nhất định 1.3.2. Tình hình nghiên cứu hoa tại Việt Nam *Những nghiên cứu về nhân giống Trung tâm hoa cây cảnh, Viện Di truyền Nông nghiệp đã sử dụng kích phát tố Thiên nông với liều lượng 1g/l sau đó nhúng gốc khoảng 30 phút, rồi đem phần dung dịch thuốc còn lại pha thêm 5g phân bón lá, cứ 3 - 5 ngày phun dung dịch này một lần có thể đảm bảo từ 80-90% số cây ra rễ với thời gian rút ngắn so với đối chứng từ 3 - 4 ngày. Phương pháp này thường được áp dụng cho việc nhân giống cúc vào mùa hè để đạt hiệu quả cao. 11 Năm 2002, Nguyễn Thị Kim Lý đã tiến một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cây hoa cúc trên các vùng trồng hoa Hà Nội, kết quả cho thấy: sử dụng IBA 1000ppm làm dung dịch để giâm cành cúc CN97 trên nền đất phù sa nhẹ chỉ tưới đẫm 1 lần và phun Zineb 0,1% sẽ cho tỷ lệ cây xuất vườn vào vụ Hè Thu đạt cao nhất. Với các giống hoa trồng chậu, trồng thảm thì ngoài việc nhân giống bằng hình thức gieo hạt thì giâm cành cũng là một trong những biện pháp kỹ thuật thường được áp dụng rộng rãi. Trong đó giá thể là một trong những yếu tố quyết định thời gian và chất lượng của cành giâm * Những nghiên cứu về giá thể Các nhà sinh học tại Viện Nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất giá thể tổng hợp trồng hoa Lan và cây cảnh từ các phụ phế phẩm nông nghiệp có ở Lâm Đồng. Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Duy Hạng đã sử dụng các loại phụ phế phẩm như bã mía, lõi ngô, vỏ đậu phộng, vỏ cà phê… đều có thể tận dụng để sản xuất phân hữu cơ nhờ các chủng vi sinh ưa nhiệt, có khả năng phân giải các phụ phế phẩm này thành các giá thể để trồng hoa, không chỉ hoa Địa Lan mà còn có thể áp dụng cho nhiều loại hoa khác nhau và cây cảnh, thay thế cho các giá thể truyền thống. Nhóm tác giả thiết lập quy trình sản xuất giá thể tổng hợp trồng hoa lan từ các phụ phế phẩm nông nghiệp bằng biện pháp lên men vi sinh. Loại giá thể tổng hợp này được sản xuất từ các chất hữu cơ có nguồn thực vật, hệ vi sinh vật hiếu khí và các chất khoáng đa lượng, trung - vi lượng nên rất thích hợp cho việc nuôi trồng lan và các loại hoa, cây cảnh khác. Dạng giá thể tổng hợp này có thể sản xuất dưới dạng viên hoặc sợi với thành phần dinh dưỡng gồm: chất hữu cơ 47%; Nitơ tổng số 0,8%; Phosphor 0,7%; Kali tổng số 1%; Oxid calci 0,3%; Oxid ma-nhê 0,3%; S (lưu huỳnh) 0,1% và thành phần vi lượng như Zn, Mo, Mn, Cu, B… Ngoài ra, trong giá thể còn có các hợp chất với hoạt tính sinh học cao, giúp cho cây trồng chậu có tính kháng bệnh. Một số hệ vi sinh vật có ích có khả năng ức chế một số loại nấm gây bệnh ở rễ. 12 Năm 2006, tác giả Huỳnh Thanh Hùng đã nghiên cứu các vật liệu làm giá thể trồng lan Dendrobium tại Thủ Đức ở Thành phố Hồ Chí Minh. Nguyên vật liệu thí nghiệm gồm phân giun đất nguyên chất, than gỗ (làm đối chứng), xơ dừa, mụn xơ dừa, mạt cưa, rễ lục bình và dớn. Chậu trồng Lan (bằng đất nung) có kích thước 11,5cm x 6,5cm x 8cm. Giá thể được phối trộn các vật liệu và chất kết dính được nén chặt tạo thành khối. Sau 5 tháng nghiên cứu theo dõi ảnh hưởng của giá thể trồng Lan, tác giả có kết luận, trong các vật liệu phối trộn phân bùn với xơ dừa, rễ lục bình và dớn cho cây Lan Dendrobium sinh trưởng tốt nhất. Hiện nay, nhiều loại hoa được nhân giống bằng phương pháp Invitro , giai đoạn sau nuôi cấy trong ống nghiệm quyết định tỷ lệ sống và chất lượng cây, giá thể giâm đóng vai trò quan trọng. Yêu cầu của giá thể là vừa đảm bảo độ tơi xốp, có khả năng thoát nước tốt, có tính giữ ẩm cao đồng thời phải hoàn toàn sạch các mầm bệnh. Năm 2006, tác giả Lê Xuân Tảo đã tiến hành làm thí nghiệm để nghiên cứu loại giá thể thích hợp cho 2 loại hoa trồng chậu là hồng tiểu muội, cúc Indo. Các tác giả đã đưa ra kết luận, giá thể thích hợp dùng để trồng cúc Indo trong chậu gồm: ¼ trấu hun +1/4 vụn dừa + ¼ phân chuồng giúp cho cây sinh trưởng phát triển tốt, tỷ lệ nở hoa trên cây và độ bền tự nhiên ngày của cây cao. * Những nghiên cứu về phân bón và chế độ dinh dưỡng Dinh dưỡng là một trong những yếu tố tác động mạnh đến sự sinh trưởng, phát triển cây trồng nói chung và cây hoa nói riêng. Việc cung cấp dinh dưỡng hợp lý là biện pháp hữu hiệu để nâng cao năng suất chất lượng hoa. Gần đây, trong sản xuất người ta áp dụng phổ biến phương pháp dưỡng ngoài rễ chủ yếu là bằng cách phun lên lá. Phương pháp này có những đặc điểm sau: - Tiết kiệm được phân. - Tiết kiệm được nhiên liệu. 13 - Tiết kiệm được thời gian và sức lao động. Thường nên phun vào lúc cây còn non khi màng lớp cutin chưa thật phát triển, hoặc vào lúc cây sắp đạt cường độ cực đại của quá trình trao đổi (Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Trần Văn Phẩm, 2000). Pomior là một loại phân bón qua lá được phối hợp nhiều chất dinh dưỡng đa, trung và vi lượng, được phối hợp với các chất phức hoạt nhằm tăng khả năng bám dính và khả năng thẩm thấu nhanh chất dinh dưỡng vào trong cây. Tác giả Hoàng Ngọc Thuận đã kết luận, việc bón phân Pomior qua lá cho hoa cúc và các loại hoa trồng chậu là rất cần thiết, làm giảm tỉ lệ rụng nụ, tăng cường quá trình trao đổi chất, hình thành và phát triển nụ rất tốt. Khi nghiên cứu sử dụng chế phẩm phân bón lá nhằm giảm lượng phân bón gốc cho hoa Đồng tiền trồng tại Hải Phòng, tác giả Nguyễn Thị Kim Thanh, Phạm Thị Thanh Thuỷ (2008) đã khẳng định: hoa Đồng tiền được bón bằng phân bón lá có thể giảm lượng 1/3 lượng phân bón gốc mà không ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cũng như chất lượng của hoa Đồng tiền. Các tác giả cũng xác định: trong các chế phẩm nghiên cứu, chế phẩm Pomior và Đầu trâu tỏ ra có hiệu quả hơn đối với cây hoa Đồng tiền so với các loại chế phẩm phân bón lá. Công thức sử dụng chế phẩm Pomior và Đầu Trâu đều có hiệu quả tốt đến các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển và năng suất. Theo nghiên cứu của Nguyễn Xuân Linh (2005)[3] cây hoa Cúc nếu được bón đầy đủ và cân đối các loại phân như phân hữu cơ (phân bắc, phân chuồng, nước giải, phân vi sinh), phân vô cơ và các loại phân vi lượng (Cu, Fe, Zn, Mn, Bo, Co) sẽ sinh trưởng phát triển tốt, cho năng suất và chất lượng hoa cao. Theo Nguyễn Quang Thạch (2006), Kỳ Nhân là loại phân bón mới nhập nội từ Trung Quốc, thông qua Viện sinh học Nông nghiệp, hiện loại phân này đang được thử nghiệm với một số cây hoa Cúc, đồng tiền…, đã đem lại những kết quả đáng kể. Phân bón qua lá Kỳ nhân có tác dụng chủ yếu hoạt 14 hoá gen tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng của cây, đồng thời cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng. Năm 2006, tác giả Nguyễn Thị Hải khi nghiên cứu phân bón cho hai giống cúc Vàng pha lê và cúc Mâm xôi đã khẳng định công thức bón Phân chuồng + NPK + Kỳ nhân cho cây sinh trưởng, phát triển, chất lượng và độ bền tự nhiên hoa cao nhất. 1.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào 1.4.1. Cơ sở kỹ thuật của nuôi cấy mô, tế bào thực vật + Tính toàn năng của tế bào Vào năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng một tế bào bất kì của một sinh vật đa bào có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh (Vũ Văn Vụ, 1999). Theo quan điểm sinh học hiện đại thì một tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và vừa đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thuận lợi mỗi tế bào đó đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào. Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi nằm trong khối mô bình thường, tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một chương trình định sẵn (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2004) + Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào mô sinh thành các tế bào mô chuyên hóa thực hiện các chức năng khác nhau. Ví dụ mô dậu làm 15 nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, mô dẫn làm nhiệm vụ dẫn nước và chất dinh dưỡng. Tuy nhiên khi các tế bào đã biến đổi thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, không hẳn là chúng sẽ mất đi khả năng biến đổi. Trong trường hợp cần thiết, ở môi trường thích hợp chúng lại có khả năng trở về dạng tế bào phôi sinh, phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa, ngược lại với quá trình phân hóa tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là kết quả của quá trình phản phân hóa và phân hóa của tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô xét cho đến cùng cũng chính là quá trình phát sinh hình thái tế bào có định hướng. Để điều khiển quá trình này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều tiết sinh trưởng thuộc các nhóm auxin hay cytokinin. Tỷ lệ các chất này khác nhau sẽ kích thích tạo ra các phát sinh hình thái khác nhau (Murashige, 1980). Tỷ lệ auxin nhiều hơn thường tạo rễ, tỷ lệ cytokinin nhiều hơn tạo chồi. 1.4.2. Môi trường nuôi cấy in vitro Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô như mẫu cấy, ánh sáng, nhiệt độ, pH, ... nhưng phải kể đến là các thành phần trong môi trường nuôi cấy. Có thể nói các thành phần này có khả năng quyết định sự thành công hay thất bại trong nuôi cấy mô. Vì nó ảnh hưởng trực tiếp tới sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật. Thành phần này thay đổi tuỳ theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần môi trường cũng thay đổi. Môi trường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy. Tuy nhiên, tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).  Khoáng đa lượng: Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung 16 cấp là N, P, K, Ca, Mg và Fe (Murashige and Skoog, 1962; Vũ Văn Vụ và cs, 2009).  Khoáng vi lượng: Nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy. Các thí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hoá chất dùng để pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo... (Murashige and Skoog, 1962; Vũ Văn Vụ và cs, 2009).  Carbon và nguồn năng lượng: Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose. Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose. Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy. Nồng độ sucrose ban đầu có thể ảnh hưởng đến một sốtham số nuôi cấy như tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy (Murashige and Skoog, 1962; Vũ Văn Vụ và cs, 2009).  Vitamin: Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol (Murashige and Skoog, 1962; Vũ Văn Vụ và cs, 2009). 17  Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Có 5 nhóm chất điều hoà quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylen. Miller là người đầu tiên nhận thấy tỉ lệ auxin/cytokinin xác định dạng phân hoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy. Cả auxin và cytokinin đều được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát sinh hình thái và tỷ lệ hormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay tạo rễ không giống nhau (Murashige and Skoog, 1962; Vũ Văn Vụ và cs, 2009).  Auxin Auxin tự nhiên là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid (IAA). Các chất có cấu trúc gần giống IAA và có cùng vai trò với IAA trong vài cơ quan đều được gọi là auxin (như IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T và phenoxyaxetic acid). Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản trở sự phát triển của các phát thể chồi vừa được thành lập hay các chồi nách (các chồi ở trạng thái tiềm sinh). Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát thể non của rễ), nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này. Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamine (như thiamine mà rễ không tổng hợp được), amino acid (như arginin), và nhất là các hợp chất ortho- diphenolic (như cafeic acid, chlorogenic acid) (Murashige, 1980).  Cytokinin Cytokinin là một loại hormone thực vật kích thích tế bào phân chia. Các hợp chất này xuất phát từ purine adenin, một trong các base của DNA và RNA. Hợp chất cytokinin đầu tiên được khám phá là kinetin, tiếp theo là zeatin – một hợp chất có trong phần lớn thực vật và vài vi khuẩn, cấu trúc gần giống kinetin nhưng hoạt tính cao hơn gấp 10 lần. Sau zeatin, hơn 30 cytokinin khác nhau đã được cô lập. Ngày nay, người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm hợp chất, thiên nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lý giống kinetin.Nhiều chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin, chúng đều là các