Tài liệu Nghiên cứu in vitro tác động của huyết tương giàu tiểu cầu (prp) lên mô nha chu

. BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Nghiên cứu in vitro tác động của huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) lên mô nha chu Mã số: 2016.3.1.345 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Phạm Anh Vũ Thụy Tp. Hồ Chí Minh, 2018 . . BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Nghiên cứu in vitro tác động của huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) lên mô nha chu Mã số: 2016.3.1.345 Chủ nhiệm đề tài PGS.TS. Phạm Anh Vũ Thụy Tp. Hồ Chí Minh, 2018 . . MỞ ĐẦU Viêm nha chu là bệnh lý gây mất bám dính mô liên kết, tiến triển đến mất xương và dây chằng nha chu, có thể làm di lệch, lung lay và sau cùng là mất răng nếu không điều trị thích hợp. Ngày nay, bệnh khá phổ biến và chiếm tỷ lệ khá cao đặc biệt là các nước đang phát triển. Hầu hết các liệu pháp điều trị nha chu đều hướng tới việc làm giảm độ sâu túi nha chu, duy trì hoặc cải thiện mức độ bám dính lâm sàng. Trong 3 thập kỷ qua, mục tiêu chính của điều trị nha chu đã chuyển từ “lành hóa” sang “tái tạo” mô nha chu, đảo ngược quá trình hư hại mô nha chu do bệnh gây ra. Áp dụng kỹ thuật tái tạo mô có hướng dẫn (Guided Tissue Regeneration – GTR), một phương pháp sử dụng màng tự tiêu hoặc màng sinh học để tái tạo những khiếm khuyết nha chu đã tạo nên một cuộc cách mạng, phá bỏ quan niệm bệnh nha chu không hoàn nguyên đã tồn tại rất lâu trong ngành nha chu. Gần đây, với sự tiến bộ trong sinh học phân tử, việc tái tạo mô nha chu thông qua các chất trung gian sinh học, trong đó các yếu tố tăng trưởng polypeptide (PGFs) rất được quan tâm. PGFs có khả năng điều hòa các hoạt động sinh học bao gồm sự bám dính, di cư, tăng sinh và biệt hóa của tế bào trong xương và mô liên kết. Sử dụng huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) là một liệu pháp tự thân với lượng tiểu cầu được tập trung nhiều hơn mức bình thường khoảng 3-4 lần, mở ra hướng đi rất khả quan trong tái tạo mô nha chu bị khuyết hổng (1,2). Tiểu cầu là một nguồn phong phú các yếu tố tăng trưởng từ tiểu cầu (PDGF), yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta (TGF-β), yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGF), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản (bFGF) và interleukin... (3). Tiểu cầu cũng giải phóng nhiều protein có hoạt tính sinh học có khả năng về thu hút các đại thực bào, các tế bào gốc trung mô trong đó có nguyên bào sợi, nguyên bào xương. Do vậy, nó không chỉ thúc đẩy việc loại bỏ các mô bị thoái hóa và hoại tử, mà còn kích thích sự tái tạo mô và lành hóa. Một trong những nguyên nhân mà PRP được sử dụng rộng rãi trong thời gian qua là nó có tính an toàn và nguồn thay thế tự nhiên để phẫu thuật. PRP có vai trò quan trọng trong việc ứng dụng điều trị đặc biệt thông qua sự kích thích tế bào nội sinh nhờ các thành phần yếu tố tăng trưởng tự nhiên của chính nó. . . Chiquet và cs. (2015) cho rằng nguyên bào sợi là những tế bào có nguồn gốc trung mô, chịu trách nhiệm sản xuất hầu hết chất nền ngoại bào trong mô liên kết, rất quan trọng trong việc sửa chữa và lành thương, thông qua sự tăng sinh, di cư và biệt hóa tế bào (4). Nguyên bào sợi ở những mô khác nhau đặc trưng cho từng biểu hiện gene, đặc điểm tăng trưởng và khả năng vận động… So với nguyên bào sợi da, nguyên bào sợi nướu biểu hiện kiểu hình riêng biệt, tăng khả năng điều hòa quá trình viêm và tái tạo chất nền ngoại bào (5,6). Năm 2004, Seo và cộng sự đã phân lập thành công tế bào gốc dây chằng nha chu người (hPDLSC). Những tế bào này có thể biệt hóa tạo thành dây chằng nha chu, xương ổ răng, xê măng, thần kinh ngoại biên và mạch máu (7). Tại Việt Nam, Trần Lê Bảo Hà và cộng sự đã phân lập thành công hPhPDLSC vào năm 2014 (7). Nhiều yếu tố đã được chứng minh có vai trò ảnh hưởng đến tính chất của hPDLSC bao gồm nguồn gốc mô, tuổi của đối tượng hiến tặng, tình trạng viêm, môi trường nuôi cấy và đặc biệt là các yếu tố tăng trưởng. Với mục đích đánh giá tác động của PRP ở các nồng độ khác nhau lên mô nha chu in vitro, cụ thể là đối với nguyên bào sợi nướu và tế bào gốc dây chằng nha chu người, chúng tôi khảo sát đáp ứng sinh học của các loại tế bào này khi được nuôi cấy in vitro trên các phương diện: tăng sinh và di cư của tế bào. . . PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Cấy chuyền nguyên bào sợi nướu hay tế bào gốc dây chằng nha chu người Nguồn tế bào nguyên bào sợi nướu và tế bào gốc dây chằng nha chu người thế hệ P3 được cung cấp từ phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lý học và Công nghệ sinh học động vật, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. Cấy chuyền nhằm cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho tế bào tăng sinh, phát triển giúp duy trì dòng tế bào đang có. Các tế bào này được cấy chuyền sang thế hệ P4 và nuôi trong môi trường DMEM/F12, ủ ấm ở 370C, 5% CO2 cho đến khi đạt độ che phủ bề mặt bình Roux đến khoảng 80%. Tế bào gốc dây chằng nha này biểu hiện những marker (dấu ấn phân tử) của tế bào gốc trung mô như CD44, CD73 và CD90, đồng thời sở hữu đặc tính đa tiềm năng có thế biệt hóa thành những loại tế bào khác nhau như nguyên bào xương và tế bào tạo mỡ in vitro (8). 2. Tách chiết PRP Quy trình thu nhận PRP được thực hiện bằng bộ kit tách chiết huyết tương giàu tiểu cầu (NEW PRPPRO KIT) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất (Công ty TNHH Thế Giới Gen). Máu ngoại vi được lấy từ người tình nguyện 20-30 tuổi, khỏe mạnh, không hút thuốc, không có tiền sử bệnh về máu. Máu được thu vào 3 ống lấy máu, mỗi ống 8,5ml. Sau khi quay ly tâm 2000 vòng/phút trong 10 phút, hút nhẹ dịch màu vàng bên trên cho vào ống. Đem ly tâm lần nữa với tốc độ 3500 vòng/phút trong 5 phút. Hút bỏ 10ml dịch vàng bên trên là huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP), hút 5ml dịch đáy ống vào ống nghiệm sẵn có 100 µl dung dịch CaCl2 để kích hoạt tiểu cầu giải phóng các yếu tố tăng trưởng. Sau 15 phút, tách khối đông đặc trong ống. Phần dung dịch còn lại thu nhận được là huyết tương giàu tiểu cầu ở dạng hoạt hóa. 3. Thử nghiệm sự tăng sinh Để đánh giá ảnh hưởng của PRP lên sự tăng sinh của mỗi loại tế bào, chúng tôi sử dụng phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm và thử nghiệm hình thành colony. Môi trường DMEM/F12 có bổ sung FBS 10% (Sigma) là nhóm chứng dương và môi trường DMEM/F12 không huyết thanh là nhóm chứng âm của thí nghiệm. Đối với phương pháp đếm tế bào: Tế bào được cấy vào đĩa 96 giếng (103 tế bào/giếng) và nuôi ổn định 24 giờ trong tủ ủ ở 370C, 5% CO2. Nhóm thí nghiệm sử dụng môi trường DMEM/F12 không huyết thanh có bổ sung PRP 1%, 2%, 5% Thay . . môi trường cách ngày ở mỗi giếng. Sau 1, 3, 5, 7 ngày, tế bào được tách ra khỏi bề mặt nuôi bằng Trypsin/EDTA 0,25% và xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm. Đối với thử nghiệm hình thành colony: Tế bào được cấy vào đĩa 6 giếng và khảo sát ở mật độ 2ml tế bào/đĩa, 103 tế bào/ml, nuôi trong tủ ủ ở 370C, 5% CO2. Thay môi trường cách ngày trong 14 ngày để theo dõi sự hình thành colony (tiêu chuẩn mỗi colony có ít nhất 50 tế bào). Đĩa tế bào nuôi cấy sau đó được nhuộm với crystal violet 0,54% trong glutaraldehyde 6% và quan sát. 4. Thử nghiệm sự di cư Sử dụng phương pháp Scratch-wound healing (SWH) để đánh giá sự di cư của mỗi loại tế bào dưới ảnh hưởng của PRP. Nguyên bào sợi nướu hay tế bào gốc dây chằng nha chu người được cấy vào các đĩa có đường kính 35mm với mật độ 5x104 tế bào mỗi đĩa. Khi độ bao phủ đạt 80%, tiến hành tạo đường rạch trên bề mặt đĩa nuôi cấy bằng micropipette đầu týp 1ml. Các tế bào không dính kết trong đĩa nuôi cấy được rửa trôi một lần bằng PBS (phosphat buffer saline). Bổ sung PRP vào môi trường nuôi cấy mỗi 24 giờ. Ở các mốc 0, 24 và 48 giờ, quan sát sự di cư của tế bào vào đường rạch bằng kính hiển vi quang học với vật kính 4X và 10X. Hình ảnh thu được phân tích bằng phần mềm Image-Analysis J 1.51j8 để ghi nhận phần trăm diện tích vết thương còn lại mà tế bào chưa di cư (vùng vô bào). Kết quả phần trăm này càng thấp chứng tỏ khả năng di cư càng tốt. 5. Phân tích số liệu Tất cả thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần. Số liệu được phân tích sử dụng phần mềm SPSS phiên bản 23 (IBM, New York, USA). Phép kiểm Mann-Whitney dùng để so sánh số lượng khúm tế bào sau hai tuần nuôi cấy giữa các nhóm PRP và với các nhóm chứng. Phép kiểm One way ANOVA và test Post-hoc Dunnett T3 (nếu có khác biệt phương sai) hoặc Tukey HSD (nếu không khác biệt phương sai) để so sánh số tế bào tăng sinh, phần trăm diện tích vùng vô bào tại các thời điểm khác nhau của các nhóm thí nghiệm và nhóm chứng. . . KẾT QUẢ I. NGUYÊN BÀO SỢI NƯỚU NGƯỜI 1. Thử nghiệm tăng sinh Biểu đồ 1. Số lượng tế bào trong các môi trường nuôi cấy ở các ngày 1, 3, 5, 7 (phương pháp đếm tế bào). Nhìn chung, ở các môi trường khác nhau trong thí nghiệm này, tế bào hGF được nuôi cấy đều có sự tăng giảm theo thời gian. Ở môi trường có PRP 1%, đường biểu diễn số lượng tế bào giống với ở nhóm chứng âm và nhóm chứng dương: tăng sinh từ ngày 1 đến ngày 3 và đạt đỉnh vào ngày 5, sau đó giảm vào ngày 7. Vào ngày 3 và ngày 5, số lượng tế bào ở nhóm PRP 1% thấp hơn nhóm chứng dương và cao hơn nhóm chứng âm có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Nhóm PRP 2% và 5% có xu hướng tăng sinh tế bào khác so với nhóm PRP 1%: số lượng tế bào tăng sinh đạt đỉnh vào ngày 3 sau đó giảm vào ngày 5. Tuy nhiên, nhóm PRP 5% có số lượng tế bào tăng từ ngày 5 đến ngày 7, tuy nhiên khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p=0,48). . . *** *** Biểu đồ 2. Số lượng tế bào của các môi trường có PRP vào ngày 3. (*** p<0,001) Vào ngày 3, ở nhóm PRP 5% số lượng tế bào cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm PRP 2% (p<0,001) và nhóm PRP 1% (p<0,001). Khác biệt về số lượng tế bào giữa nhóm PRP 1% và PRP 2% không có ý nghĩa thống kê (p=0,63). ** Biểu đồ 3. Số lượng tế bào của các môi trường có PRP vào ngày 5 (** p<0,01) Vào ngày 5, số lượng tế bào ở nhóm PRP 1% tiếp tục tăng và cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm PRP 2% (p=0,003), và nhóm PRP 5% (p=0,004). Số tế bào ở nhóm PRP 2% và nhóm PRP 5% khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p=0,64). . . Hình 1. Thí nghiệm hình thành colony của hGF ở các môi trường nuôi cấy sau 14 ngày. (Hàng trên: Quan sát trực tiếp trên đĩa cấy. Hàng dưới: Quan sát dưới vật kính x4). *** ** ** *** Biểu đồ 4. Số lượng colony của các môi trường nuôi cấy sau 14 ngày. (** p<0,01; *** p<0,001) Sau 14 ngày nuôi cấy, các môi trường nuôi cấy đều tạo colony, ngoại trừ môi trường chứng âm. Số lượng colony ở nhóm PRP 5% cao nhất, cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm PRP 1% và PRP 2% (p<0,001), nhưng cao hơn không có ý nghĩa thống kê so với chứng dương (p=0,13). Chênh lệch về số lượng colony giữa nhóm PRP 1% và PRP 2% không có ý nghĩa thống kê (p=0,68). . . 2. Thử nghiệm di cư Hình 2. Thử nghiệm Scratch-wound healing của các môi trường nuôi cấy ở các mốc 0, 24, 48 giờ. Biểu đồ 5. Phần trăm diện tích vùng vô bào của các môi trường ở các mốc 0, 24, 48 giờ. Trong các môi trường: chứng âm, chứng dương, PRP 1%, PRP 2%, phần trăm diện tích vùng vô bào đều giảm theo thời gian có ý nghĩa thống kê giữa các mốc 0 giờ và 24 giờ, 24 giờ và 48 giờ (p<0,001), nghĩa là ở các môi trường này tế bào đều có sự di cư. Riêng môi trường có PRP 5%, phần diện tích này giảm có ý nghĩa từ 0 giờ đến . . 24 giờ (p<0,01), tuy nhiên giữa mốc 24 giờ và 48 giờ có giảm nhưng không có ý nghĩa thống kê (p=0,13). Nhóm chứng âm ở cả hai mốc 24 giờ và 48 giờ đều có diện tích vùng vô bào cao nhất (p<0,05). Không có khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm chứng dương và PRP 1%, giữa nhóm PRP 2% và 5% (p>0,05). * * Biểu đồ 6. Phần trăm diện tích vùng vô bào của các môi trường có PRP ở mốc 24 giờ. (* p<0,05) Ở mốc 24 giờ, không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa nhóm PRP 2% và nhóm PRP 5% (p=0,99). Phần trăm diện tích vùng vô bào ở nhóm PRP 2% (29,02%) và nhóm PRP 5% (27,73%) thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm PRP 1% (p=0,001). p>0,05 Biểu đồ 7. Phần trăm diện tích vùng vô bào của các môi trường có PRP ở mốc 48 giờ. . . Ở mốc 48 giờ, mặc dù phần diện tích vùng vô bào ở nhóm PRP 1% (24,37%) cao hơn so với nhóm PRP 2% (13,93%) và 5% (15,94%), nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). II. TẾ BÀO GỐC DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI 1. Khả năng hình thành khúm tế bào (CFU) Các nồng độ khác nhau của PRP tác động lên khả năng hình thành CFU của hPDLSC, được trình bày trong Hình 3. Kết quả cho thấy các nhóm PRP thúc đẩy sự hình thành CFU trên tế bào với hình dạng thoi đặc trưng của hPDLSC. Kết quả định lượng số khúm tế bào sau hai tuần nuôi cấy được thể hiện ở Biểu đồ 8. Môi trường nuôi cấy có bổ sung PRP 2% có tác động lớn nhất lên khả năng hình thành CFU của hPDLSC với số lượng khúm tế bào sau 2 tuần nuôi cấy ở nhóm này cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng dương và nhóm PRP 1% (p < 0,05). Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa số lượng CFU ở nhóm được nuôi cấy bằng môi trường bổ sung PRP 1% và PRP 5%. Hình 3. Ảnh hưởng của PRP lên khả năng hình thành CFU của hPDLSC sau 2 tuần. Hình ảnh các CFU trên đĩa nuôi 6-giếng (trên) và hình ảnh 1 khúm tế bào ở x40 (dưới). . . Biểu đồ 8. Kết quả định lượng số CFU giữa các nhóm (*p < 0,05) 2. Sự tăng sinh Sự ảnh hưởng của các nồng độ PRP (1%, 2% và 5%) đến sự tăng sinh của hPDLSC theo các mốc thời gian thí nghiệm (ngày 1, 3, 5 và 7) được thể hiện ở Biểu đồ 9. Trong vòng 3 ngày đầu, số lượng tế bào ở tất cả các nhóm thí nghiệm kể cả các nhóm chứng có sự gia tăng, và đạt đỉnh vào ngày thứ 3. Sau 1 ngày nuôi cấy, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa số lượng tế bào của các nhóm. Tại ngày thứ ba, có sự gia tăng số lượng tế bào ở tất cả các nhóm so với ngày thứ nhất phụ thuộc nồng độ của PRP (Biểu đồ 10). Trong đó, các nhóm hPDLSC được nuôi cấy với 1%, 2%, PRP 5% và nhóm chứng dương có mức độ tăng sinh tế bào cao hơn có ý nghĩa thống kê khi so sánh với nhóm chứng âm. Đáng chú ý, nhóm hPDLSC được nuôi cấy với PRP 5% cho thấy tỉ lệ tăng sinh tế bào cao nhất khi số lượng tế bào của nhóm này gấp từ 1,5 đến 3 lần so với tất cả các nhóm còn lại. Nhóm PRP 2% cho thấy hiệu quả cao tiếp theo sau nhóm 5%. Tuy mức độ tăng sinh tế bào ở nhóm PRP 1% và PRP 2% thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm PRP 5% (p < 0,05), nhưng ở cả hai nhóm nồng độ này đều cho thấy vai trò thúc đẩy quá trình tăng sinh tế bào, biểu hiện là kết quả số lượng tế bào đều cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng âm (p < 0,05). Vào ngày thứ 5 và 7, số lượng tế bào ở tất cả các nhóm trên giảm dần. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa số lượng tế bào của tất cả các nhóm vào ngày thứ 5. Vào ngày thứ 7, số lượng tế bào giảm ở nhóm được nuôi cấy với môi trường bổ sung PRP 5% thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng âm và nhóm chứng dương (p < 0,05) (Biểu đồ 11). . . Biểu đồ 9. Số lượng hPDLSC dưới ảnh hưởng của các nồng độ PRP tại các mốc thời gian khác nhau. Biểu đồ 10. Số lượng hPDLSC ở các nhóm thí nghiệm tại ngày thứ 3 (*p<0,05; ***p<0,001). . . Biểu đồ 11. Số lượng hPDLSC ở các nhóm thí nghiệm tại ngày thứ 7 (*p<0,05). 3. Sự di cư Kết quả đánh giá tác động của các nồng độ PRP (1%, 2% và 5%) lên sự lành thương của hPDLSC được phân tích định lượng qua sự thu hẹp dần diện tích vùng trống tế bào trong thử nghiệm tạo đường rạch vô bào mô phỏng vết thương (Hình 4). Tất cả các nhóm PRP 1%, 2% và 5% đều cho thấy tác động thúc đẩy hPDLSC di cư vào vùng trống tế bào tốt hơn so với các nhóm chứng. Bằng chứng là diện tích vùng trống tế bào của tất cả các nhóm này thu hẹp hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng âm ở cả mốc 24 giờ và 48 giờ (Biểu đồ 12). Tại mốc 24 giờ, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê diện tích vùng trống tế bào giữa các nhóm PRP cùng nhóm chứng dương so với nhóm chứng âm (Biểu đồ 13). Sau 48h, diện tích vùng trống tế bào của nhóm PRP 1%, 2% và 5% nhỏ hơn có ý nghĩa thống kê so với cả nhóm chứng âm và nhóm chứng dương (Biểu đồ 14). Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm PRP 1%, 2% và 5%. . . Hình 4. Tác động của các nồng độ PRP khác nhau lên sự lành thương in vitro của hPDLSC. Vùng tế bào trống còn lại gỉam do PRP sau 0, 24 và 48 giờ. Biểu đồ 12: Tác động của các nồng độ PRP khác nhau lên sự lành thương in vitro của hPDLSC. Định lượng phần trăm diện tích vùng trống hPDLSC tại các mốc thời gian 0, 24 và 48 giờ. . . Biểu đồ 13. Phần trăm diện tích vùng trống hPDLSC tại mốc 24 giờ (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001) Biểu đồ 14. Phần trăm diện tích vùng trống hPDLSC tại mốc 48 giờ (**p<0,01; ***p<0,001). . . BÀN LUẬN Hiệu quả của PRP trong việc tạo ra môi trường thuận lợi tại chỗ cho sự tái tạo mô bằng cách phóng thích ra các yếu tố tăng trưởng, các cytokine đã được nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo chứng minh qua việc tác động lên khả năng tăng sinh và di cư của một số loại tế bào. Các yếu tố tăng trưởng như yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta (TGF-β1), yếu tố tăng trưởng từ tiểu cầu (PDGF), yếu tố tăng trưởng nội mạch (VEGF), yếu tố tăng trưởng insulin 1 (IGF-1) và yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) giúp kích thích tạo mạch tại chỗ, tạo ổ cho tế bào gốc, tăng cường sự tăng sinh, di cư, biệt hoá của tế bào cũng như giúp cho sự tích tụ của các protein như collagen nhằm tạo điều kiện cho sự tái tạo cấu trúc và chức năng bình thường của mô (9). Nhiều nghiên cứu trước đây đã đánh giá hiệu quả của PRP lên chức năng của tế bào. Tuy nhiên, các nghiên cứu này sử dụng nhiều phương pháp và công thức khác nhau để tách chiết PRP trên nhiều loại tế bào dòng. Trong nghiên cứu này, PRP được tách chiết bằng quy trình chuẩn đã được kiểm nghiệm bởi Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh là an toàn và hiệu quả nhằm áp dụng trực tiếp trên lâm sàng. I. NGUYÊN BÀO SỢI NƯỚU NGƯỜI Nhiều nghiên cứu trước đây đã cho thấy sự tăng sinh tế bào phụ thuộc nồng độ PRP như trong nghiên cứu của Soffer và cs. (2004) (10), nghĩa là với những nồng độ PRP khác nhau thì sự tăng sinh tế bào cũng thay đổi, có thể thúc đẩy hoặc kìm hãm. Nghiên cứu của Liu và cs. (2002) khảo sát tác dụng của PRP với nồng độ tiểu cầu khác nhau (8,8%, 17,5% và 35%) đối với nguyên bào sợi cho thấy với nồng độ 35% cho kết quả kém nhất. Tác giả cho rằng nồng độ PRP quá cao ảnh hưởng đến pH, do đó tác động âm tính đến sự tăng sinh tế bào (10). Nghiên cứu của Graziani và cs. (2006) cũng đưa đến kết luận rằng, dù ảnh hưởng của PRP trên sự tăng sinh nguyên bào xương và nguyên bào sợi nướu miệng là phụ thuộc nồng độ, nhưng việc tăng nồng độ PRP không có nghĩa là tăng khả năng tăng sinh của tế bào (11). Hiện tại chưa nghiên cứu nào khảo sát một số đặc tính sinh học như tăng sinh và di cư của nguyên bào sợi nướu dưới tác động của PRP ở các nồng độ thấp như trong nghiên cứu hiện tại. Nghiên cứu này cho thấy nồng độ PRP 5% tăng sinh tốt nhất vào ngày thứ 3, cao hơn có ý nghĩa thống kê với tất cả các nhóm còn lại. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Xuzhu Wang và cs. (2017) là trong thời gian 7 ngày nuôi cấy, sự hiện diện . . của PRP 1% hoặc PRP 5% làm tăng sự tăng sinh, còn 10% hoặc 20% sẽ làm suy giảm, trong đó PRP 5% thúc đẩy nguyên bào sợi nướu tăng trưởng ở mức cao nhất (12). Đối với các tế bào có nguồn gốc trung mô nói chung, PRP có xu hướng đạt hiệu quả tốt hơn ở nồng độ thấp, trong đó 5% được đề cập là nồng độ đạt hiệu quả tối ưu. Chẳng hạn, nghiên cứu của Sara Tavassoli-Hojjati và cs. (2016) thử nghiệm các nồng độ 0,1%, 5% và 50% trên nguyên bào sợi nha chu cho thấy PRP 5% có tác dụng tốt nhất 3 ngày đầu tiên trong khi nhóm PRP 0,1% không có khác biệt với nhóm chứng dương và nhóm PRP 50% thấp hơn đáng kể (13). Nghiên cứu của Choi và cs. (2005) cũng cho thấy kết quả tương tự: sự pha loãng PRP tới mức từ 0,5 đến 5% có thể kích thích tốt nhất sự tăng sinh tế bào xương ổ răng (14). Thử nghiệm tăng sinh bằng phương pháp đếm tế bào được thực hiện trong 7 ngày và ghi nhận tại 4 thời điểm ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7 với sự đạt đỉnh số lượng tế bào cao nhất vào ngày 3 (PRP 2%, PRP 5%) hoặc ngày 5 (PRP 1%). Các nghiên cứu trước đây đều thực hiện thử nghiệm tăng sinh trong khoảng thời gian 7 ngày dù khác nhau về nồng độ PRP được khảo sát. Chẳng hạn nghiên cứu của Sara TavassoliHojjati và cs. (2016) với các nồng độ PRP 0,1%, 5% và 50% khảo sát sự tăng sinh vào các ngày 1, 2, 3, 4 và 7 (13). Nghiên cứu của Xuzhu Wang và cs. (2017) cũng khảo sát các nồng độ PRP 1%, 5%, 10%, 20% vào các ngày 1, 3, 5, 7(12). Nghiên cứu của Creeper F. và cs. (2012) chỉ ra rằng các nồng độ PRP khác nhau (50%, 20%, 10%) không thúc đẩy sự tổng hợp DNA ngắn hạn (24 giờ), mà kích thích sự tăng sinh dài hạn (5 ngày) (15). Trong ngày đầu tiên, có thể tế bào chưa thích nghi được với môi trường mới nên tăng sinh còn chậm, tác dụng của PRP chưa thể đạt hiệu quả mong đợi. Thời gian 7 ngày là khoảng thời gian đủ dài, phù hợp để quan sát được hai giai đoạn tăng sinh đạt đỉnh và suy giảm của tế bào. Thử nghiệm CFU-F được thực hiện nhằm mục đích thể hiện khả năng tự làm mới và tính sống còn của tế bào đơn lẻ khi được nuôi cấy ở mật độ thấp. Một tế bào được xem có khả năng tạo colony (clonogenic) là khi được nuôi cấy, tế bào đơn lẻ đó vẫn giữ được khả năng sinh sản bằng cách phân chia nhiều lần để đạt được một cụm tối thiểu 50 tế bào. Nghiên cứu của Geetanjali B. Tomar và cs. (2010) cho rằng tế bào gốc trung mô (MSC) nướu, trong đó bao gồm cả hGF, có khả năng tự làm mới tốt hơn MSC tủy xương qua thử nghiệm CFU-F (16). Nghiên cứu của Quanchen Xu và cs. (2016) cũng thực hiện thử nghiệm CFU-F và khẳng định hGF có đặc tính của . . MSC bao gồm khả năng tự làm mới. Nghiên cứu của chúng tôi cũng ủng hộ kết luận về khả năng tạo colony của hGF. Tuy nhiên, chúng tôi chưa tìm thấy nghiên cứu nào trước đây khảo sát tác động của các nồng độ PRP lên sự hình thành colony của hGF. Kết quả từ nghiên cứu này cho thấy, trong các nồng độ PRP được khảo sát, 5% là nồng độ tốt nhất để kích thích hGF đơn lẻ tự làm mới và hình thành colony. Monica Caceres và cs. (2008) công bố rằng nghiên cứu của họ là nghiên cứu đầu tiên chỉ ra rằng tế bào GFs có khả năng di cư và xâm lấn để đáp ứng với kích thích hóa ứng động có nguồn gốc từ PRP. Nghiên cứu này cũng chứng minh, các nồng độ PRP 100%, 50% và 10% cải thiện có ý nghĩa thống kể khả năng di cư của tế bào so với nhóm chứng âm với 0% huyết thanh phôi thai bò (p<0,01), tuy nhiên họ không tìm thấy khác biệt có ý nghĩa giữa các nồng độ này (p>0,05) (17). Thí nghiệm của Dhanaraj và cs. (2012) cũng kết luận rằng môi trường có PRP 10% sẽ kích thích sự di cư của tế bào gốc trung mô (gấp 10 lần), nguyên bào xương (4 lần) và nguyên bào sụn (7 lần) so với nhóm chứng (18). Các nghiên cứu khảo sát sự phụ thuộc vào nồng độ PRP trên sự di cư của nguyên bào sợi nướu người không nhiều, do những điều kiện thí nghiệm khác nhau nên kết quả có thể không đồng nhất với thí nghiệm của chúng tôi, tức là nhóm PRP 2% và PRP 5% có khả năng làm hGFs di cư tốt hơn so với nhóm PRP 1% và nhóm chứng, nhưng về căn bản, tiềm năng của PRP trong sự di cư tế bào là quan điểm tương đồng giữa thí nghiệm này và các thí nghiệm đã từng công bố trước đây. Gần đây, nghiên cứu của Xuzhu Wang và cs. (2017) khảo sát về đặc tính của nguyên bào sợi nướu trong lành thương mô nha chu xung quanh bề mặt Titanium implant dưới tác động của PRP và PRF cũng cho thấy rằng PRP ảnh hưởng đến sự di cư của tế bào hơn 250% có ý nghĩa thống kê khi so sánh với nhóm chứng (12). II. TẾ BÀO GỐC DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI Trong nghiên ứu này, chúng tôi sử dụng tế bào gốc dây chằng nha chu (hPDLSC) đã được chứng minh về tính đa năng (8) nhằm mô phỏng quá trình lành thương mô nha chu thông qua đặc tính tăng sinh và di cư của tế bào trong thực tế. Sự tăng sinh của tế bào trước hết được khảo sát bằng thí nghiệm đánh giá khả năng hình thành CFU và thí nghiệm tăng sinh. Một các tổng quát, kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra các nồng độ thấp PPR (1%, 2% và 5%) kích thích hoạt động tăng .