Tài liệu Nghiên cứu hoạt tính kháng sâu khoang (spodoptera litura) hại rau lang của tinh dầu từ một số loài thực vật ở bình dương

TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG SÂU KHOANG (SPODOPTERA LITURA) HẠI RAU LANG CỦA TINH DẦU TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT Ở BÌNH DƢƠNG Mã số: Xác nhận của đơn vị chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài ThS. Trần Thanh Hùng Bình Dƣơng, 06/2019 1 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI TT Họ và tên Đơn vị công tác và lĩnh vực chuyên môn - Khoa Khoa học Tự 1 Trần Thanh Hùng nhiên - Chuyên môn: Công nghệ Sinh học Nội dung nghiên cứu cụ thể đƣợc giao Chữ ký Chủ nhiệm đề tài, viết thuyết minh đề cƣơng, thực hiện các thí nghiệm và viết báo cáo tổng kết đề tài. 2 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... 04 DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. 05 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................ 06 MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 11 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 11 2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................... 12 3. Đối tƣợng nghiên cứu....................................................................................... 13 4. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................... 13 5. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 13 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 14 1.1. Tinh dầu ....................................................................................................... 14 1.2. Đặc điểm của các loài thực vật đƣợc sử dụng trong đề tài ........................... 19 1.3. Đặc điểm của Sâu khoang (Spodoptera litura) ............................................. 25 1.4. Các nghiên cứu hoạt tính trừ Sâu khoang (Spodoptera litura) tinh dầu ....... 26 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 29 2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 29 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 30 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 36 3.1. Hiệu suất tinh dầu của các mẫu vật nghiên cứu ...................................... 36 3.2. Vòng đời của Sâu khoang hại Rau lang trong điều kiện phòng thí nghiệm ................................................................................... 37 3.3. Hoạt tính kháng Sâu khoang của các tinh dầu trong điều kiện phòng thí nghiệm........................................................................................... 39 3.4. Hiệu lực trừ Sâu khoang của tinh dầu Tía tô dại trong điều kiện vƣờn ƣơm 48 3.5. Thành phần hóa học của tinh dầu Tía tô dại (Hyptis suaveolens) ................ 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 55 1. Kết luận ........................................................................................................... 55 2. Kiến nghị .......................................................................................................... 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 57 PHỤ LỤC 3 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Hiệu suất tinh dầu thu đƣợc từ các mẫu thực vật nghiên cứu .................. 36 Bảng 3.2. Thời gian phát triển, kích thƣớc và khối lƣợng cá thể ở các giai đoạn phát triển của Sâu khoang (S. litura) trong điều kiện phòng thí nghiệm ................. 37 Bảng 3.3. Độc tính của các tinh dầu đối với ấu trùng Sâu khoang (S. litura) sau 24 giờ tiếp xúc ........................................................................................... 47 Bảng 3.4. Tỉ lệ lá khoai lang bị hại bởi ấu trùng Sâu khoang (Spodoptera litura) trong điều kiện vƣờn ƣơm ............................................................................... 49 Bảng 3.5. Tỉ lệ chết của ấu trùng Sâu khoang (Spodoptera litura) qua các khoảng thời gian theo dõi ............................................................................................. 50 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của tinh dầu Tía tô dại đến tỉ lệ hoá nhộng và vũ hoá Sâu khoang (Spodoptera litura) .............................................................................. 51 Bảng 3.7. Thành phần của tinh dầu lá Tía tô dại đƣợc phân tích bằng GC-MS ...... 53 4 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Mô hình bộ thiết bị chƣng cất tinh dầu Clevenger Apparatus.................. 15 Hình 1.2. Sơ đồ dây chuyền chiết xuất dƣợc liệu bằng CO2 lỏng ............................ 16 Hình 1.3. Cúc leo (Makania cordata) ...................................................................... 19 Hình 1.4. Cỏ lào (Chromolaena odorata) ............................................................... 21 Hình 1.5. Ngũ sắc (Lantana camara) ....................................................................... 22 Hình 1.6. Cúc bò (Wedelia trilobata) ....................................................................... 23 Hình 1.7. Tía tô dại (Hyptis Suaveolens) .................................................................. 24 Hình 1.8. Vòng đời của Sâu khoang (Spodoptera litura) Hình 3.1. Các đoạn phát triển khác nhau của Sâu khoang (S. litura) ...................... 39 Hình 3.2. Hoạt tính kháng ăn của các tinh dầu đối với ấu trùng sâu khoang (S. litura) trong thí nghiệm có sự chọn lọc thức ăn ......................................... 42 Hình 3.3. Hoạt tính kháng ăn của các tinh dầu đối với ấu trùng sâu khoang (S. litura) trong thí nghiệm không có sự chọn lọc thức ăn .............................. 43 Hình 3.4. Tác động của các tinh dầu lên sự phát triển nhộng của Sâu khoang (S. litura). ........................................................................................................ 45 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của các tinh dầu đến sự hình thành nhộng và vũ hóa của Sâu khoang (S. litura). ............................................................................................ 46 5 TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Đơn vị: Khoa Khoa học Tự nhiên THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: ―Nghiên cứu hoạt tính kháng Sâu khoang (Spodoptera litura) hại rau lang của tinh dầu từ một số loài thực vật ở Bình Dƣơng‖ - Mã số: - Chủ nhiệm: ThS. Trần Thanh Hùng - Đơn vị chủ trì: Khoa Khoa học Tự nhiên, Trƣờng Đại học Thủ Dầu Một. - Thời gian thực hiện: 12 tháng (từ 01/2018 đến 01/2019) 2. Mục tiêu: - Đánh giá hoạt tính gây kháng ăn, tiêu diệt, ức chế phát triển và độc tính của tinh dầu từ một số loài thực vật ở Bình Dƣơng đối với sâu khoang hại khoai lang trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Đánh giá hiệu lực kháng sâu khoang của tinh dầu có hoạt tính mạnh nhất trong điều kiện vƣờn ƣơm. 3. Tính mới và sáng tạo: Nghiên cứu về hoạt tính trừ sâu hại của tinh dầu thực vật là một hƣớng nghiên cứu mới ở Việt Nam. Hoạt tính trừ sâu khoang của tinh dầu từ các loài thực vật nhƣ Cúc leo (Mikania cordata), Cỏ lào (Chromolaena odorata), ngũ sắc (Lantana camara), Cúc bò (Wedelia trilobata) và Tía tô dại (Hyptis suaveolens) vẫn chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu mặc dù chúng đƣợc chứng tỏ có hoạt tính sinh học cao đối với các loài nấm, vi khuẩn và một số loài côn trùng khác. 4. Kết quả nghiên cứu: - Trong điều kiện phòng thí nghiệm, tinh dầu Tía tô dại (H. suaveolens) biểu hiện hoạt tính kháng ăn, ức chế phát triển và độc tính mạnh nhất đối với ấu trùng Sâu khoang (S. litura). Ở nồng độ 1,5 – 2,5%, tinh dầu Tía tô dại có hoạt tính kháng ăn mạnh với chỉ số kháng ăn (AI, tính theo Caasi (1983)) đạt từ 79,46 - 89,86 trong thí nghiệm có chọn lọc thức ăn và từ 85,99 – 96,30 trong thí nghiệm không có chọn lọc thức ăn. Tinh dầu tía tô dại, nồng độ 1,2 mg/ấu trùng, diệt 93,33 % ấu trùng và 6 ức chế hoàn toàn sự hình thành bƣớm trƣởng thành. Độc tính tiếp xúc của tinh dầu Tía tô dại sau 24 giờ xử lý cao hơn có ý nghĩa thống kê so với các tinh dầu còn lại, với giá trị LD50 là 0,16 mg/ấu trùng. - Trong điều kiện vƣờn ƣơm, tinh dầu Tía tô dại cũng biểu hiện hoạt tính kháng ăn, hiệu lực tiêu diệt và ức chế phát triển mạnh đối với ấu trùng Sâu khoang. Tinh dầu Tía tô dại nồng độ 8 - 32% biểu hiện hiệu lực kháng ăn mạnh sau 24 giờ xử lý với tỷ lệ lá bị hại chỉ dao động từ 4,44 – 13,26%. Ở nồng độ 8 – 32%, tỷ lệ sâu chết đạt từ 46,67 – 86,67% sau 48 giờ xử lý. Tinh dầu tía tô dại ức chế mạnh đến sự tăng trƣởng của ấu trùng và nhộng, dẫn đến giảm tỷ lệ nhộng thành bƣớm của Sâu khoang với tỷ lệ vũ hóa giảm từ 23,33 - 0,00 % khi xử lý tinh dầu từ với nồng độ tăng dần từ 4 – 32%. 5. Sản phẩm: - Sản phẩm khoa học: 01 bài báo khoa học đăng trên Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Thủ Dầu Một. 01 bài báo khoa học đăng trên Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. - Sản phẩm đào tạo: 02 đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên 01 đề tài khóa luận tốt nghiệp. - Các sản phẩm khác: 01 Thuyết minh đề cƣơng đề cƣơng đề tài 01 Báo cáo tổng kết đề tài 6. Hiệu quả, phƣơng thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng: - Đề tài góp phần đào tạo sinh viên thông qua hƣớng dẫn nghiên cứu khoa học và khóa luận tốt nghiệp - Báo cáo tổng kết của đề tài là nguồn tài liệu tham khảo cho giảng viên và sinh viên trƣờng Đại học Thủ Dầu Một. 7 - Đề tài cung cấp cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm trừ sâu có nguồn gốc thảo mộc. Từ đó góp phần vào việc làm giảm tác động có hại đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời của việc lạm dụng thuốc trừ sâu hóa học. - Kết quả nghiên cứu đƣợc chuyển giao cho trƣờng Đại học Thủ Dầu Một. Đơn vị chủ trì Ngày 24 tháng 04 năm 2019 Chủ nhiệm đề tài Trần Thanh Hùng XÁC NHẬN CỦA CƠ QUAN 8 INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information: - Project title: ―Insecticidal activity of the essential oils from different plants in Binh Duong against Spodoptera litura Fab. (Lepidoptera: Noctuidae)‖ - Code number: - Coordinator: Tran Thanh Hung - Implementing institution: Faculty of Natural Science, Thu Dau Mot University - Duration: from January 2018 to January 2019 2. Objective(s): The aim of the current study was to evaluate the insecticidal activity of essential oils extracted from different plants in Binh Duong, including Hyptis suaveolens, Chromolaena odorata, Lantana camara, Mikania cordata and Wedelia trilobata, against Spodoptera litura under the laboratory conditions. The dominant essential oil was assessed the insecticidal properties under the nursery conditions. 3. Creativeness and innovativeness: Studying the insecticidal activity of essential oils is one of new research directions in Vietnam. Despite the fact that the essential oils from Hyptis suaveolens, Chromolaena odorata, Lantana camara, Mikania cordata and Wedelia trilobata were demonstrated to possess the high bioactivity against a wide range of fungi, bacteria, and insects, their activities against Spodoptera litura have not been studied yet. 4. Research results: - In the laboratory conditions, the results indicated that H. suaveolens essential oil had a strong antifeedant effect on the larvae with antifeedant index (AI) of 79.46 – 89.86 in choice test and of 85.99 – 96.30 in no-choice test when leaf disks of Ipomoea batatas were treated with the essential oil at concentration of 1.5 – 2.5%. Pupation and adult emergence of the larvae were totally inhibited when the larvae were topical treated with H. suaveolens essential oil at 1.2 mg/larva. 9 Larvicidal activity of H. suaveolens essential oil (LD50=0.16 mg/larva) was stronger than those of the other test essential oils after 24 hour of treatment. - In the nursery conditions, the H. suaveolens essential oil at concentration of 8 - 32% exhibited a strong antifeedant impact on the larvae with the percentage of damaged leaves of 4.44 – 13.26%. The concentrations also caused the mortality rate of 46.67 – 86.67% for the larvae. The essential oil had a strong inhibition on the development of the larvae, leading to a considerable reduction of adult emergence. The proportion of adults decreased from 23,33 to 0% when the concentration increased from 4 to 32%. 5. Products: - Scientific products: 01 article published on the Scientific Journal of Thu Dau Mot University. 01 article published on the Proceedings of the 7th National Scientific Conference on Ecology and Biological Resources. - Training products: 01 bachelor’s thesis 02 student research project - Other products: Research proposal Research report 6. Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability: - The project contributed in training students via the bachelor’s thesis and the student research project. - The research report of project is a reliable reference for lecturers and students in Thu Dau Mot University. - The project makes a scientific foundation for further studies to use the essential oils as bio-insecticides for control of S. litura. - The project is applied in Thu Dau Mot University. 10 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Sâu khoang (Spodoptera litura) thuộc chi Spodoptera, họ Noctuidae. Đây là một loài sâu ăn lá, đa thực, có thể phá hại trên các loài cây trồng thuộc hơn 40 họ thực vật khác nhau (Brown & Dewhurst, 1975) và gây ảnh hƣởng lớn đến năng suất của nhiều loại cây trồng kinh tế quan trọng (Patel et al., 1971; Srivastava et al., 1972; Nakasuji & Matsuzaki, 1977). Sử dụng thuốc trừ sâu hóa học để kiểm soát sâu hại nói chung và sâu khoang (Spodoptera litura) nói riêng đã và đang là biện pháp chủ yếu trong nông nghiệp. Đây là biện pháp từng đƣợc xem là hiệu quả cao trong diệt trừ sâu hại, tuy nhiên trong những năm gần đây đã phát sinh những vấn đề đáng lo ngại. Các hợp chất hóa học thành phần của thuốc trừ sâu tổng hợp thƣờng khó phân hủy, tồn dƣ trong thực phẩm và môi trƣờng, do đó có nhiều tác động xấu đến các hệ sinh thái tự nhiên và sức khỏe của con ngƣời. Hơn nữa, hiệu lực của các loại thuốc hóa học đang áp dụng ngày càng giảm do hiện tƣợng phát sinh ngày càng nhiều các quần thể kháng thuốc của nhiều loài sâu hại, trong đó có sâu khoang (Armes et al., 1997; Kranthi et al., 2001; Saleem et al., 2008; Tong et al., 2013). Việc tăng liều lƣợng thuốc trừ sâu tổng hợp để diệt trừ các quần thể sâu kháng thuốc đã làm tăng thêm nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng và hủy hoại sức khỏe con ngƣời. Trƣớc thực tế đó, việc tìm ra những hợp chất thiên nhiên có khả năng kiểm soát hiệu quả sâu hại vừa không có tác động tiêu cực đến môi trƣờng tự nhiên và con ngƣời là thực sự cần thiết. Nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ tinh dầu của thực vật có hoạt tính sinh học chống lại các loài côn trùng gây hại, trong đó có sâu khoang (Bouda et al., 2001; Isman et al., 2001; Zhang et al., 2003; Yi et al., 2007; Loh et al., 2011; Koul et al., 2013; Huang et al., 2014; Vasantha-Srinivasan et al., 2016). Khác với các loại thuốc trừ sâu tổng hợp, tinh dầu tác động lên côn trùng ở nhiều đích khác nhau nhƣ hệ thần kinh, các hệ thống hormone và pheromone, các hệ vận chuyển điện tử hô hấp (Enan, 2001; Tsao & Coats, 1995; Ahmed et al., 2001; Emekci et al., 2004). Từ đó, tinh dầu thể hiện nhiều hoạt tính nhƣ tiêu diệt, ức chế phát triển, ức chế sinh sản, gây kháng ăn và xua đuổi đối với nhiều loài côn trùng. Chính vì vậy, việc sử dụng tinh dầu trong trừ sâu hại sẽ ít hoặc không làm xuất hiện của các quần thể sâu kháng 11 thuốc. Bên cạnh đó, tinh dầu đã đƣợc chứng tỏ là an toàn đối với môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời. Đích tác động chính của tinh dầu lên côn trùng là các thụ thể octopamine chỉ có ở hệ thần kinh của côn trùng mà không có ở động vật có xƣơng sống, chứng tỏ tác động chọn lọc của tinh dầu (Enan, 2001). Tinh dầu cũng đƣợc chứng tỏ là không tồn tại trong nƣớc và đất (Misra & Pavlostathis, 1997). Hơn nữa, từ lâu tinh dầu đã đƣợc sử dụng trong việc tạo hƣơng vị cho thực phẩm và nhiều tinh còn đƣợc dùng làm dƣợc liệu (Margaris et al., 1982; Baris et al., 2006; Wei & Shibamoto, 2010; Carson & Hammer, 2011; Djilani & Dicko, 2012; Lawless, 2013). Cúc leo (Mikania cordata), Cỏ lào (Chromolaena odorata), ngũ sắc (Lantana camara), Cúc bò (Wedelia trilobata) và Tía tô dại (Hyptis suaveolens Poit.) là những loài thực vật mọc hoang dại ở tỉnh Bình Dƣơng (Trần Thanh Hùng & cs., 2014; Trần Thanh Hùng, 2015; Trần Thanh Hùng & Yến Thanh Tâm, 2016; Lê Huy Bá, 2010). Thành phần hóa học của tinh dầu chiết xuất từ lá của những loài thực vật này đã đƣợc nghiên cứu ở nhiều nƣớc trên thế giới (Van Hac et al., 1996; Li et al., 2012; Bedi et al., 2003; Bouda et al., 2001). Các loại tinh dầu này đƣợc chứng tỏ rằng có hoạt tính sinh học cao đối với các loài nấm, vi khuẩn và một số loài côn trùng (Iwu et al., 1990; Bouda et al., 2001; Malele et al., 2003; Moreira et al., 2010). Điều này cho thấy tiềm năng của việc sử dụng tinh dầu từ các loài thực vật này trong việc quản lí côn trùng gây hại. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius) của tinh dầu từ năm loài thực vật ở Bình Dƣơng, gồm Cúc leo (Mikania cordata), Cỏ lào (Chromolaena odorata), ngũ sắc (Lantana camara), Cúc bò (Wedelia trilobata) và Tía tô dại (Hyptis suaveolens Poit.) nhằm tìm ra một hợp chất thiên nhiên mới có hiệu quả trong việc phòng trừ sâu hại và không có tác động xấu đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời. 2. Mục tiêu của đề tài - Đánh giá hoạt tính gây kháng ăn, tiêu diệt, ức chế phát triển và độc tính của tinh dầu từ một số loài thực vật ở Bình Dƣơng đối với sâu khoang hại khoai lang trong điều kiện phòng thí nghiệm. 12 - Đánh giá hiệu lực kháng sâu khoang của tinh dầu có hoạt tính mạnh nhất trong điều kiện vƣờn ƣơm. 3. Đối tƣợng nghiên cứu Hoạt tính kháng sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius) hại rau lang của tinh dầu từ một số loài thực vật ở Bình Dƣơng 4. Phạm vi nghiên cứu - Các loài thực vật đƣợc thu hái ở địa bàn thành phố Thủ Dầu Một và các vùng phụ cận thuộc tỉnh Bình Dƣơng, sau đó đƣợc dùng làm nguyên liệu để chiết xuất tinh dầu ở phòng thí nghiệm. - Sâu khoang đƣợc thu nhận từ các vƣờn rau của nông dân ở địa bàn thành phố Thủ Dầu Một và các vùng phụ cận, sau đó đƣợc nuôi và nhân giống trong phòng thí nghiệm. - Các thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng sâu khoang của tinh dầu đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học trƣờng Đại học Thủ Dầu Một, vƣờn ƣơm của ngƣời dân tại thành phố Thủ Dầu Một. - Đề tài đƣợc tiến hành trong thời gian 12 tháng 5. Nội dung nghiên cứu - Thu hái, chiết xuất và phân tích thành phần hóa học tinh dầu của các loài thực vật - Thu bắt và nhân giống sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius) - Khảo sát hoạt tính kháng ăn, ức chế tăng trƣởng và độc tính của tinh dầu từ một số loài thực vật ở Bình Dƣơng đối với sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Khảo sát hiệu lực kháng sâu khoang của tinh dầu có hoạt tính mạnh trong điều kiện vƣờn ƣơm. 13 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tinh dầu 1.1.1. Định nghĩa tinh dầu Tinh dầu là những hợp chất bay hơi và có mùi, đƣợc tìm thấy chỉ trong 10% của giới thực vật và đƣợc dự trữ trong các cấu trúc tiết đặc trƣng của thực vật nhƣ tuyến tiết, lông tiết, và ống tiết. Hầu hết tinh dầu là chất lỏng không màu hoặc có màu vàng nhạt, tỷ trọng thấp hơn nƣớc, có tính chất kị nƣớc, có thể tan trong cồn, những dung môi không phân cực hoặc phân cực yếu, sáp và dầu, nhƣng rất ít tan trong nƣớc. Về thành phần hóa học, tinh dầu chứa nhiều hợp chất khác nhau, bao gồm: Hydrocarbon, ester, oxide, lactone, alcohol, phenol, aldehyde và ketone. Tinh dầu có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau nhƣ kháng ung thƣ, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virus, và trừ sâu (Djilani et al., 2012). 1.1.2. Các phương pháp chiết xuất tinh dầu Tinh dầu có thể đƣợc chiết xuất bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau. Tuy nhiên, bốn phƣơng pháp thƣờng dùng để thu tinh dầu từ các nguyên liệu thực vật là phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn tinh dầu bằng hơi nƣớc, phƣơng pháp chiết xuất bằng dung môi, phƣơng pháp ép và phƣơng pháp ƣớp (Bộ Y tế, 2005; Viện Dƣợc liệu, 2006). Trong số các phƣơng pháp này, phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn tinh dầu bằng hơi nƣớc đƣợc sử dụng phổ biến nhất ở quy mô thí nghiệm cũng nhƣ quy mô công nghiệp. Phương pháp chưng cất lôi cuốn tinh dầu bằng hơi nước dựa trên nguyên tắc chƣng cất một hỗn hợp 2 chất lỏng bay hơi đƣợc không trộn lẫn vào nhau (nƣớc và tinh dầu). Khi áp suất hơi bão hoà bằng áp suất khí quyển, hỗn hợp bắt đầu sôi và hơi nƣớc kéo theo hơi tinh dầu. Thiết bị sử dụng trong phƣơng pháp này nhìn chung có ba bộ phận gồm: nồi cất, bộ phân ngƣng tụ và bộ phận phân lập. Nồi cất là nơi chứa nƣớc và nguyên liệu chứa tinh dầu. Bộ phận ngƣng tụ có nhiệm vụ hoá lỏng hơi nƣớc và hơi tinh dầu từ nồi cất chuyển sang, gồm hai bộ phận: ống dẫn hơi và bộ phận làm lạnh. Bộ phận phân lập có nhiệm vụ hứng chất lỏng là nƣớc và tinh dầu, đồng thời tách riêng tinh dầu ra khỏi nƣớc. Tuỳ theo mục đích sử dụng tinh dầu 14 mà có thể chọn các loại thiết bị chƣng cất khác nhau. Trong các thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học của tinh dầu, bộ thiết bị chƣng cất tinh dầu Clevenger Apparatus thuỷ tinh đƣợc sử dụng để chiết xuất tinh dầu (Kalpoutzakis et al., 2001; Tzakou & Skaltsa, 2003; Chutia et al., 2009, Hieu et al., 2014). Hình 1.1. Mô hình bộ thiết bị chưng cất tinh dầu Clevenger Apparatus (Samadi et al., 2017) Phương pháp chiết xuất bằng dung môi thƣờng đƣợc dùng để chiết tinh dầu của hoa hoặc chiết xuất một thành phần nhất định nào đó. Dung môi thƣờng đƣợc dùng là ether dầu hoả và xăng công nghiệp. Sau khi chiết, cất dƣới áp lực giảm để thu hồi dung môi, sản phẩm thu đƣợc là tinh dầu có lẫn sáp và một số tạp chất khác. Dùng alcohol để thu tinh dầu và loại alcohol bằng cách cất dƣới áp lực giảm. Phương pháp ướp cũng thƣờng đƣợc dùng để chiết xuất tinh dầu của hoa. Phƣơng pháp này thƣờng dùng các khuôn gỗ có kích thƣớc 58 x 80 x 5 cm, ở giữa có đặt tấm thuỷ tinh đƣợc bôi mỡ lợn ở cả hai mặt, mỗi lớp dày khoảng 3mm. Một lớp lụa mỏng đƣợc đặt lên trên bề mặt lớp mỡ và rải trên đó 50 – 80g hoa tƣơi đã làm sạch. Khoảng 35 – 40 khuôn gỗ nhƣ vậy đƣợc xếp chồng lên nhau rồi để trong phòng kín. Các lớp hoa mới đƣợc thay vào định kì 24 – 72 giờ cho đến khi lớp chất béo bão hoà tinh dầu. Dùng alcohol để chiết tinh dầu từ chất béo, sau đó tách tinh dầu ra khỏi alcohol bằng cách cất dƣới áp lực giảm. 15 Phương pháp ép là phƣơng pháp sử dụng lực cơ học tác động vào nguyên liệu thu tinh dầu. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là giữ đƣợc hƣơng vị tự nhiên của tinh dầu. Vì thế, phƣơng pháp ép thƣờng đƣợc sử dụng để tách chiết tinh dầu của các loài thuộc chi Citrus với mục đích sử dụng trong kỹ nghệ sản xuất đồ uống. Hơn nữa, ở các loài thuộc chi Citrus, các túi tiết tinh dầu nằm ngay ở lớp vỏ ngoài của vỏ quả nên rất thuận lợi để áp dụng phƣơng pháp ép. Hình 1.2. Sơ đồ dây chuyền chiết xuất dược liệu bằng CO2 lỏng (Viện Dƣợc liệu, 2006). Chú thích: 1. Nồi phản ứng; 2. Bình trữ CO2 lỏng; 3. Thiết bị làm bay hơi; 4. Lọc dịch chiết; 5. Bộ phận làm lạnh; 6 máy nén; 7. Thiết bị điều áp; 8. Bình đựng sản phẩm chiết ra. Ngoài bốn phƣơng pháp truyền thống trên, một số phƣơng pháp khác cũng đƣợc sử dụng để chiết xuất tinh dầu. Đầu tiên là phƣơng chƣng cất bằng hơi nƣớc trong chân không với tác động của sóng cực ngắn. Trong phƣơng pháp này, dƣợc liệu tƣơi đƣợc đặt trong một thiết bị chân không và đƣợc đốt nóng một cách chọn lọc bằng sóng cực ngắn. Tinh dầu tách ra khỏi dƣợc liệu cùng với nƣớc của chính dƣợc liệu đó. Quá trình chƣng cất diễn ra rất nhanh và tốn rất ít năng lƣợng. Một phƣơng pháp khác là phƣơng pháp chiết bằng khí hoá lỏng (khí ở trạng thái siêu tới hạn). Khí thƣờng đƣợc dùng trong phƣơng pháp này là carbon dioxide (CO 2). Hệ thống chiết xuất hoạt động theo nguyên tác tuần hoàn khép kín. CO 2 lỏng đƣợc bơm cao áp đƣa tới cột trao đổi nhiệt với áp lực theo yêu cầu của công nghệ chiết xuất. Khi đạt đƣợc nhiệt độ theo yêu cầu, nó đƣợc đƣa tới cột chiết chƣa nguyên liệu và 16 quá trình chiết tại đây diễn ra rất nhanh. CO2 lỏng mang theo tinh dầu đƣợc tách ra ở cột phân li dƣới tác dụng của sự thay đổi nhiệt và áp suất. CO2 lại trở về cột trao đổi nhiệt hoá lỏng rồi đƣợc chuyển về bình chứa ban đầu để sử dụng tuần hoàn (Hình 1.2). 1.1.3. Vai trò của tinh dầu đối với đời sống thực vật Tinh dầu có vai trò quan trọng trong đời sống của thực vật, giúp thực vật có khả năng thích nghi tốt với môi trƣờng sống của chúng. Tinh dầu có khả năng thu hút các tác nhân thụ phấn, các tác nhân phát tán hạt giống (Dudareva & Pichersky, 2008), tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sinh sản và mở rộng khu phân bố của các loài thực vật. Trong tự nhiên, nhiều thực vật chứa tinh dầu có khả năng ƣu thế hơn trong cạnh tranh, sinh trƣởng và phát triển mạnh hơn các loài khác nhờ tinh dầu chúng tiết ra đóng vai trò nhƣ là chất ức chế cảm nhiễm (Sharifi-Rad et al., 2017). Các hợp chất bay hơi này còn giúp cho thực vật đáp ứng tốt với các điều kiện stress của môi trƣờng, chẳng hạn tinh dầu có thể bảo vệ bộ máy quang hợp, giúp nó duy trì đƣợc hoạt động quang hợp trong điều kiện nhiệt độ cao (trên 40oC) bằng cách ổn định màng thylakoid (Pichersky & Gershenzon, 2002). Tinh dầu đóng vai trò quan trọng trong tính đề kháng của thực vật với các sâu bệnh hại (Dudareva & Pichersky, 2008; War ey al., 2012; Sharifi-Rad et al., 2017). Các hợp chất tinh dầu có khả năng xua đuổi, gây độc, hoặc gây kháng ăn, làm giảm khả năng tiêu hóa, sinh trƣởng và sinh sản của các sinh vật gây hại. Ngoài ra, tinh dầu cũng có tác động gián tiếp làm hạn chế tác hại của côn trùng có hại bằng cách thu hút các thiên địch của chúng. Các hợp chất bay hơi nhƣ methyl salicylate, jasmonic acid, và (Z)-3-hexenyl acetate đóng vai trò nhƣ là các tín hiệu trong giao tiếp ở thực vật (Dudareva & Pichersky, 2008; Fürstenberg-Hägg, 2013), giúp tăng khả năng đề kháng thích ứng của thực vật chống lại các sinh vật gây hại. 1.1.4. Tầm quan trọng của tinh dầu đối với con người Từ lâu, tinh dầu thực vật đã đƣợc con ngƣời khai thác và sử dụng để phục vụ các nhu cầu trong cuộc sống nhƣ làm thuốc, chất thơm, và gia vị (Lã Đình Mỡi và cs., 2001). Ngày nay, với sự phát triển khoa học và kỹ thuật, con ngƣời đã hiểu rõ về bản chất và hoạt tính sinh học của các tinh dầu. Nhờ đó, tinh dầu đã và đang trở thành nguồn nguyên liệu không thể thiếu trong nhiều ngành công nghiệp, và sản 17 phẩm của tinh dầu cũng ngày càng đa dạng, càng hoàn thiện trên nhiều lĩnh vực nhƣ dƣợc liệu, thực phẩm, và mỹ phẩm (Lã Đình Mỡi và cs., 2001). Tinh dầu có tác động sinh lý rõ rệt đối với cơ thể, tác động đến hoạt động của hệ tuần hoàn, hệ hô hấp và hệ thần kinh của con ngƣời. Hơn nữa, tinh dầu còn có khả năng sát trùng và kháng khuẩn mạnh. Các kết quả nghiên cứu trƣớc cho thấy rằng tinh dầu có khả năng ức chế sinh trƣởng và tiêu diệt đối với nhiều loài vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng khác nhau nhƣ Escherichia coli, Listeria monocytogenes, aeruginosa, Staphylococcus Staphylococcus aureus, epidermidis, Salmonella Pseudomonas spp., Pseudomonas putida, Klebsiella pneumoniae, Campylobacter jejuni, Helicobater pylori (Carson & Hammer, 2011; Hammer & Carso, 2011; Oliveira et al., 2014). Tinh dầu còn đƣợc chứng tỏ có hoạt tính kháng ung thƣ thông qua nhiều cơ chế khác nhƣ gây ra opoptosis bằng cách tăng sản sinh ROS, ức chế protein kinase B, và phosphoryl hóa Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) (Sharifi-Rad et al., 2017). Do đó, thực vật chứa tinh dầu và tinh dầu đã đƣợc sử dụng trong việc chữa trị nhiều loại bệnh nhƣ cảm, bệnh đƣờng hô hấp, tuần hoàn, tiêu hóa, đau bụng, nhức đầu, cảm lạnh, xoa bóp các chỗ đau, giảm mệt mỏi, kích thích hoạt động của cơ bắp, và hỗ trợ điều trị ung thƣ. Do tác dụng chữa bệnh khá rộng và hiệu quả nên nhiều loại tinh dầu đƣợc coi là nguồn nguyên liệu không thể thiếu trong công nghiệp dƣợc liệu. Tinh dầu cũng đóng vai trò quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm và mỹ phẩm. Tinh dầu góp phần tạo hƣơng vị cho các sản phẩm thực phẩm, giúp chúng trở nên ngon hơn, và hấp dẫn hơn. Trong lĩnh vực sản xuất mỹ phẩm, tinh dầu là nguồn nguyên liệu tất yếu và luôn luôn có nhu cầu với một khối lƣợng lớn. Chúng đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để chế biến và sản xuất các loại hƣơng liệu cho công nghiệp nƣớc hoa, kem đánh rang, xà phòng thơm, các loại kem dƣỡng da, kem chống nắng, son môi, và dầu gội đầu. Bên cạnh đó, nhiều tinh dầu thực vật còn biểu hiện hoạt tính kháng các côn trùng và nấm gây hại cây trồng với nhiều cơ chế khác nhau nhƣ diệt sâu, gây kháng ăn, chống đẻ trứng, và ức chế sinh trƣởng (Koul et al., 2008). Vì vậy, tinh dầu thực vật cùng đƣợc sử dụng trong việc kiểm soát côn trùng và nấm hại, bảo vệ cây trồng và các nông sản sau thu hoạch. 18 1.2. Đặc điểm của các loài thực vật đƣợc sử dụng trong đề tài 1.2.1. Cúc leo (Mikania cordata) Cúc leo (Mikania cordata) là một loài thực vật thuộc họ Cúc (Asteraceae). Ở nƣớc ta loài này phân bố ở các tỉnh nhƣ Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Hòa Bình, Ninh Bình vào Kon Tum, Đăk Lăk, Bình Dƣơng, Đồng Nai (Võ Văn Chi, 2012). Loài này đƣợc ghi nhận mọc ven bờ sông Sài Gòn đoạn qua Thị xã Thuận An, tỉnh Bình Dƣơng bởi Trần Thanh Hùng (2015). A B C D E Hình 1.3. Cúc leo (Makania cordata) (A. Dạng chung ngoài tự nhiên; B. Một cành mang hoa; C. Lá; D: Hoa; E: Quả) Cúc leo có thân leo quấn, nhánh mảnh, màu xanh, thân hình trụ đặc, thiết diện ngang hình tròn, có lông thƣa, ngắn. Lá mọc đối, có phiến hình tim, không có lông ở cả hai mặt, gân từ đáy 3, mép lá có răng cƣa to, cuống lá dài 3 – 4 cm. Mỗi gié hoa có từ 3 – 5 cụm hoa, cụm hoa hình đầu tập trung thành dạng tản phòng (gần giống tán, song hoa gắn dài trên một trục thay vì một điểm) ở nách lá. Mỗi cụm hoa 19 đầu có tổng bao là một hàng gồm 5 lá bắc thon dài, không lông, đế cụm hoa bằng, có 4 hoa trong một cụm hoa. Hoa đều, lƣỡng tính, hình ống, đài hoa là một chùm lông tơ, tràng hoa hình ống có 5 thùy màu trắng, bộ nhị gồm 5 nhị rời có các bao phấn màu nâu dính nhau bao quanh vòi nhụy, bộ nhụy gồm 2 lá noãn dính nhau thành bầu dƣới 1 ô, 2 vòi và 2 đầu nhụy. Quả bế nhẵn, dài 3-4mm, có mào lông trắng. Cúc leo đƣợc dùng hỗ trợ điều trị gãy xƣơng đứt gân, dùng trong tiêu chảy, rắn cắn, bò cạp đốt, điều trị ngứa ngoài da, băng bó vết thƣơng (Võ Văn Chi, 2012). Tinh dầu của Cúc leo chứa những thành phần có hoạt tính trừ sâu (Bedi et al., 2003). Điều này cho thấy tiềm năng của việc sử dụng tinh dầu Cúc leo trong kiểm soát sâu hại cây trồng. 1.2.2. Cỏ lào (Chromolaena odorata) Cỏ lào (Chromolaena odorata) thuộc họ Cúc (Asteraceae). Đây là một loài cây của Nam châu Mỹ, đƣợc truyền bá vào nƣớc ta, gặp nhiều ở các vùng đồi núi (Võ Văn Chi, 2012). Loài thực vật này đƣợc ghi nhận mọc phổ biến ở Bình dƣơng (Lê Huy Bá, 2010; Trần Công Luận, 2011; Trần Thanh Hùng, 2015). Đây là loài thực vật thân thảo, màu xanh vài chỗ màu tím nhạt, hình trụ thẳng cao từ 1 – 2 m, thiết diện ngang hình tròn, có nhiều lông ngắn, phân thành nhiều nhánh. Lá mọc đối, có phiến xoan thon, có lông thƣa ở cả 2 mặt, mép lá có răng cƣa to, có 3 gân chính nổi rõ ở mặt sau, cuống lá dài từ 1 – 2 cm. Mỗi gié hoa có 10 cụm hoa, cụm hoa hình đầu tập trung thành dạng tản phòng (gần giống tán, song hoa gắn dài trên một trục thay vì một điểm) ở ngọn. Mỗi cụm hoa đầu có các lá bắc xếp thành nhiều vòng bao quanh cụm hoa, đế cụm hoa bằng, có khoảng 27 hoa hình ống. Hoa đều, lƣỡng tính, đài hoa là một chùm lông tơ, tràng hoa hình ống có 5 thùy màu tím rất nhạt, bộ nhị gồm 5 nhị rời bao quanh vòi nhụy, bộ nhụy gồm 2 lá noãn dính nhau thành bầu dƣới 1 ô, 2 vòi và 2 đầu nhụy. Lá tƣơi Cỏ lào thƣờng đƣợc dùng để cầm máu các vết thƣơng, chữa bệnh lị cấp tính và bệnh tiêu chảy ở trẻ em, chữa viêm đại tràng, đau nhức xƣơng, viêm răng lợi, chữa ghẻ lở, nhọt độc (Võ Văn Chi, 2012). Cỏ lào cũng là một loài thực vật chứa tinh dầu. Tinh dầu cỏ lào đã đƣợc chứng tỏ có hoạt tính kháng khuẩn, 20