Tài liệu Nghiên cứu hóa học và phân lập một vài hợp chất trong phân đoạn ethyl acetat của thổ phục linh (smilax glabra roxb. liliaceae)

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT CỦA THỔ PHỤC LINH (SMILAX GLABRA ROXB. LILIACEAE) Chủ nhiệm đề tài: TS. Phạm Đông Phương Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT CỦA THỔ PHỤC LINH (SMILAX GLABRA ROXB. LILIACEAE) Chủ nhiệm đề tài: TS. Phạm Đông Phương Ký tên Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 . . MỤC LỤC I. ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………...1 II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………...1 2.1. Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất và dụng cụ nghiên cứu……...1 2.2. Phương pháp nghiên cứu………………………………………….2 III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………….4 3.1. Chiết xuất và phân tách các phân đoạn……………………………4 3.2. Phân lập tủa EA……………………………………………………7 3.3. Phân lập cao EA trên SKC nhanh và HPLC………………………7 3.4. Xác định độ tinh khiết các chất phân lập được……………………8 3.5. Xác định cấu trúc………………………………………………...10 III. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………………...19 IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………...20 . . I. ĐẶT VẤN ĐỀ: Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb) được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau không chỉ ở Việt Nam mà còn nhiều nước trên thế giới, nhất là khu vực châu Á để làm thuốc chữa giang mai, đau xương, lợi tiểu, giải độc cơ thể, đặc biệt là nhiều bệnh liên quan tới viêm như: viêm gan, viêm thận, viêm da, chàm..[10], [13], [53]. Mặc dù được dùng rộng rãi tuy nhiên ở Việt Nam, đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Thổ phục linh. Để bổ sung cơ sở khoa học, làm sáng tỏ tác dụng của Thổ phục linh, đề tài “Nghiên cứu phân lập một vài hợp chất trong phân đoạn ethyl acetat của Thổ phục linh Smilax glabra Roxb., Smilacaceae” được tiến hành với các nội dung sau: - Thu mẫu và nghiên cứu thành phần hóa thực vật - Chiết xuất hoạt chất toàn phần bằng EtOH - Phân tách cao cồn thành các phân đoạn đơn giản - Phân lập một vài hợp chất trong phân đọan EtOAc. II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Phần thân rễ Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) được thu hái và định danh. Dược liệu được phơi hoặc sấy ở 50 – 70 oC đến khô. Xay thành bột thô. 2.1.2. Nguyên liệu, dung môi, hóa chất, thiết bị nghiên cứu - Dung môi: cồn 96%, methanol, n-hxan, chloroform, ethylacetat, ether dầu hỏa đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (AR). 2.1.3. Dụng cụ trang thiết bị: - Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Sunfire C18 (12,5 × 4,6 mm; 5 µm). - SKLM dùng bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck, Art. 1.05554). - SKC dùng silica gel hạt vừa (Trung Quốc), cỡ hạt 40- 63µm và silica gel hạt mịn (Merck) cỡ hạt 15- 40µm). Máy cô quay Buchi R300 (Nhật Bản). Bể siêu âm Ultrasonic Bath (Đức). Tủ sấy Gallentkamp (Anh). Nồi cách thủy Memmert WB-14 (Đức). Cột sắc ký và các dụng 1 . . cụ thí nghiệm thông thường trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược liệu và Phòng nghiên cứu hóa các hợp chất tự nhiên thuộc Trung tâm Đào tạo và nghiên cứu phát triển thuốc nguồn gốc tự nhiên – ĐH. Y Dược Tp. HCM. - Máy đo khối phổ (Micromass Quattro microTM API – Waters). - Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) BRUKER - AV - 500, tại Viện hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam - Hà nội. - Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Sunfire C18 (12,5 × 4,6 mm; 5 µm). - Phần mềm EMPOWER truy xuất hình ảnh, số liệu cho định tính, định lượng trên máy HPLC. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Thu hái định danh mẫu: khảo sát đặc điểm hình thái, định danh mẫu, lưu mẫu tại Bộ môn Dược liệu – khoa Dược – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. 2.2.1. Xác định độ tinh khiết - Xác định độ ẩm: Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.6, PL-182 - Xác định tro toàn phần và tro không tan trong HCl: Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.8. và phụ lục 9.7., phương pháp 1. 2.2.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật: Theo phương pháp Ciuley cải tiến 2.2.3. Chiết xuất và phân tách các phân đoạn - Chiết xuất: bột rễ Thổ phục linh được chiết ngấm kiệt với cồn, thu hồi dung môi để được cao lỏng. Lắc phân bố cao lỏng với các dung môi có tính phân cực tăng dần lần lượt là n-hexan, CHCl3, ethyl acetat, n-BuOH và phần còn lại không phân bố vào các dung môi trên. Bay hơi dung môi để thu được các cao tương ứng. - Kiểm tra cao chiết trên SKLM 2.2.4. Phân lập, kết tinh và kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký 2.2.4.1. Phân lập bằng SKC cổ điển Điều kiện SK: - Cột sắc ký: 3 x 40 cm. - Pha tĩnh: 100 g silica gel kích thước hạt hạt 0,040 – 0,063 mm (Merck). 2 . . - Mẫu: 2 g tủa EA - Dung môi khai triển: cloroform-methanol, gradient từ 100-0 đến 95-5. - Thể tích hứng mỗi ống nghiệm: 10 ml - Hệ dung môi cho SKLM kiểm tra các phân đoạn: cloroform –methanol –acid formic (8,5:2:0,5) 2.2.4.2. SKC nhanh cao EtOAc Điều kiện SK: - Cột sắc ký: 9 x 50 cm - Pha tĩnh: silica gel hạt trung bình: (40-63 µm, Merck), khối lượng: 1000 g. - Mẫu: 45 g cao EtOAc. - Dung môi khai triển: ethyl acetat-methanol. Tăng dần tỉ lệ methanol từ 0% - 15%. - Thể tích mỗi lọ hứng: 80 ml - Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM, hệ dung môi: ethyl acetat–methanol–acid acetic 9:0,5:0,5 - Kiểm tra và gộp các phân đoạn: hứng các phân đoạn, kiểm tra trên SKLM, phát hiện bằng đèn UV 254 nm, UV 365 nm và TT VS. Các phân đoạn gần giống nhau được gộp chung lại, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (cô quay chân không). 2.2.4.3. Phân lập bằng HPLC Điều kiện SK: - Hệ thống sắc ký: máy sắc ký điều chế Waters 2767, đầu dò PDA 2996 - Cột sắc ký: cột bán điều chế Sunfire C18 (10 x 150 mm; 5 μm) và tiền cột C18 (10 x 10 mm; 5 μm). - Nhiệt độ cột: 25 oC. - Mẫu thử: tủa phân đọan 2 của cao EtOAc hòa tan trong lượng tối thiểu MeOH, lọc qua màng 0,45μm. - Thể tích tiêm: 150 μL. - Tốc độ dòng: 3,5 ml/phút. - Bước sóng phát hiện: 295 nm - Pha động: nước (A) - methanol (B). - Chương trình rửa giải: nước - methanol (55 : 45) trong thời gian 22 phút. 3 . . - Tinh chế: Các phân đoạn sau khi cô quay được kết tinh hay kết tinh phân đoạn trong lượng tối thiểu dung môi thích hợp (có gia nhiệt). Kiểm tra chất kết tinh trên SKLM với ít nhất 2 hệ dung môi khác nhau. 2.2.5. Kiểm tra độ tinh khiết: 2.2.21. Kiểm tra độ tinh khiết trên SKLM - Thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn với các hệ dung môi sau: - Cloroform-methanol-acid acetic (8:1,5:0,5) - Ethyl acetat-methanol-acid acetic (9:0,5:0,5) - n-Butanol-methanol (8:2) 2.2.5.2. Kiểm tra độ tinh khiết trên UPLC - Mẫu được pha trong dung môi methanol, nồng độ 0,1 mg/ml. - Thiết bị sắc ký: Máy UPLC ACQUITY HCLASS - Waters, đầu dò PDA 2998. Cột UPLC BEH C18 1,7 µm; 2,1 × 5 mm. Nhiệt độ cột: 25 oC. - Thể tích tiêm: 2 µl. Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút. - Pha động: acid formic 0,1% - MeOH (tỉ lệ khởi đầu 95:5 đến kết thúc 0:100). - Thời gian phân tích: 60 phút với mẫu SG01 và SG05, 30 phút với SG02. 2.2.6. Xác định cấu trúc các chất phân lập Chất tinh khiết được phân tích bằng phương pháp phổ khối (MS), HPLC-PDA, NMR, so sánh đối chiếu với các dữ liệu về phổ NMR, MS của các chất tương tự đã công bố trong tài liệu. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy BRUKER – AV – 500, tại Viện hóa học thuộc Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam – Hà nội. Mẫu được hòa tan trong CD3OD hoặc CD3COCD3 với TMS là chất chuẩn nội. Phổ proton (1H-NMR) được đo ở 500 MHz, phổ carbon (13C-NMR) được đo ở 125 MHz. Độ dịch chuyển hóa học được tính theo thang ppm (δTMS = 0) với chuẩn là tín hiệu của TMS. Các hằng số ghép (J) tính bằng Hertz (Hz). III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Chiết xuất và phân tách các phân đoạn 9 kg dược liệu được chiết ngấm kiệt bằng cồn 96%, thu hồi dung môi để được cao lỏng và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, bao gồm: 4 . . ether dầu hỏa, CHCl3, EtOAc, n-butanol và phần còn lại không tan vào 4 dung môi trên. Cô thu hồi dung và thu được các cao tương ứng. Với phân đoạn EtOAc, khi thu bớt dung môi, để nguội có xuất hiện tủa, lọc lấy riêng tủa (gọi là tủa EA), phần dịch lọc cô đến cao để cho ra cao EA. Với phân đoạn không tan vào 4 dung môi trên, bay hơi bớt dung môi và để nguội có xuất hiện tủa, lọc lấy tủa (gọi là tủa N1). Dịch lọc cô đến cao, gọi là cao N2. Kết quả chiết xuất và phân lập đựơc trình bày trong sơ Bảng 3.1 và Hình 3.1 Bảng 0.1. Các cao phân đoạn Thổ phục linh Cao Khối lượng (g) Độ ẩm (%) Ether dầu hỏa Cao ether dầu hỏa 20,4 12,15 Chloroform Cao CF 8,4 13,83 EtOAc Tủa EA 14 7,51 Cao EA 679 15,32 n-butanol Cao n-butanol 130 13,76 Phần còn lại, không tan trong các dung môi trên Cao N1 500 16,5 Cao N2 750 17,5 Dịch chiết 5 . . Dược liệu + EtOH - Chiết ngấm kiệt Dịch chiết cồn 96% - Cô dung môi Cao lỏng - loại ether dầu hỏa + ether dầu hỏa Dịch chiết ether Cao ether Cao lỏng + cloroform - loại cloroform Dịch chiết CF Cao CF Cao lỏng + ethyl acetat - loại ethyl acetat Dịch chiết EA Cao EA và tủa EA Cao lỏng + n-butanol Dịch chiết n-butanol - loại n-butanol Cao n-butanol Tủa Để lắng, lọc Dịch lỏng Cô dung môi Cao nước Hình 0.1 Sơ đồ chiết xuất và phân bố cao cồn 96% 6 . . 3.2. Phân lập tủa EA Tủa EA được tiến hành sắc ký cột cổ điển với điều kiện như trong phần Phương pháp nghiên cứu. Kết quả: Thu được 3 phân đoạn. Ở phân đoạn 3 có xuất hiện kết tinh trắng, đặt tên là SG01 (560 mg). Kiểm tra trên UPLC thấy SG01 vẫn chưa tinh khiết. Tiếp tục tinh chế bằng sắc ký lỏng bán điều chế với điều kiện như trong phần Phương pháp nghiên cứu. Tiến hành chạy lặp lại nhiều lần trên cột HPLC điều chế trong cùng điều kiện. Phân đoạn chứa SG01 được cô chân không, đông khô và kết tinh lại được 20 mg hợp chất SG01 tinh khiết. 3.3. Phân lập cao EA trên SKC nhanh và HPLC. Tiến hành với điều kiện như trong phần Phương pháp nghiên cứu. Kết quả thu được 5 phân đoạn, trong đó phân đoạn 2 khi cô dung môi có xuất hiện tủa, lọc lấy tủa (500 mg). Kiểm tra tủa cho thấy chưa phải là chất tinh khiết nên phân lập tiếp trên HPLC điều chế với điều kiện sắc ký như sau: - Hệ thống sắc ký: máy sắc ký điều chế Waters 2767, đầu dò PDA 2996 - Cột sắc ký: cột bán điều chế Sunfire C18 (10 x 150 mm; 5 μm) và tiền cột C18 (10 x 10 mm; 5 μm). - Nhiệt độ cột: 25 oC. - Mẫu thử: tủa ở phân đoạn 2 của SKC nhanh, hòa tan trong lượng tối thiểu MeOH, lọc qua màng 0,45μm. - Thể tích tiêm: 150 μL. - Tốc độ dòng: 3,5 ml/phút. - Bước sóng phát hiện: 295 nm - Pha động: nước (A) - methanol (B). - Chương trình chạy: isocratic nước - methanol (55 : 45) trong 22 phút. Tiến hành chạy nhiều lần trên cột HPLC điều chế trong cùng điều kiện. Dịch thu được, cô bớt dung môi, đông khô và kết tinh lại, thu được 12 mg hợp chất đặt tên là SG02 và 15 mg hợp chất SG05. 7 . . 3.4. Xác định độ tinh khiết các chất phân lập được • Kiểm tra độ tinh khiết của SG01, SG02 và SG05 trên SKLM với 3 hệ dung môi sau: - Cloroform-methanol-acid acetic (8:1,5:0,5) - Ethyl acetat-methanol-acid acetic (9:0,5:0,5) - n-Butanol-methanol (8:2) Kết luận sơ bộ: Trên SKĐ chỉ cho 1 vết với TT. VS, chứng tỏ SG01, SG02 và SG05 tinh khiết trên SKLM. • Kiểm tra độ tinh khiết trên UPLC - Mẫu được pha trong dung môi methanol, nồng độ 0,1 mg/ml. - Thiết bị sắc ký: Máy UPLC ACQUITY HCLASS - Waters, đầu dò PDA 2998. Cột UPLC BEH C18 1,7 µm; 2,1 × 5 mm. Nhiệt độ cột: 25 oC. - Thể tích tiêm: 2 µl. Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút. - Pha động: acid formic 0,1% - MeOH (tỉ lệ khởi đầu 95:5 đến kết thúc 0:100). - Thời gian phân tích: 60 phút với mẫu SG01 và SG05, 30 phút với SG02. - Thời gian lưu và độ tinh khiết của SG01 như Hình 3.9 và Bảng 3.17 Hình 0.2. Sắc ký đồ SG01 trên UPLC 8 . . Bảng 0.2. Độ tinh khiết SG01 Độ tinh khiết của SG02 bằng HPLC cho kết quả như Hình 3.3 và Bảng 3.3. Hình 0.3. Sắc ký đồ của SG02 Bảng 0.3. Độ tinh khiết của SG02 Kiểm tra độ tinh khiết SG05 trên UPLC cho kết quả như Hình 3.4 và Bảng 3.4. 9 . . Hình 0.4. Sắc ký đồ SG05 Bảng 0. 4. Độ tinh khiết SG05 3.5. Xác định cấu trúc 3.5.1. Xác định cấu trúc SG01 - Phổ UV: SG01 cho đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 205,8 nm và 289,9 nm. Hình 3.5. Phổ UV của SG01 10 . . - Phổ MS: Trên phổ MS (ESI+), SG1 cho phân mảnh chính [M+Na] với m/z 473,1 tương ứng với phân tử khối là 450 đvC. Hình 3.6. Phổ MS của SG01 - Phổ NMR Phổ 13C-NMR (PL-2) kết hợp phổ DEPT (PL-3): có 21 tín hiệu cacbon, trong đó có 8 cacbon bậc IV, 12 cacbon methin (-CH) và 1 nhóm methyl (-CH3). 12 tín hiệu của vòng benzen nằm trong vùng C 96,2 – 168,6 ppm; nhóm cacbonyl (C=O) ở C 195,9 ppm và 2 nhóm oxymethin ở C 83,9 và 78,5 ppm, dự báo khung cấu trúc flavonoid (C6-C3)-C6. Bên cạnh đó cũng thấy dấu hiệu của đường rhamnose (1 nhóm methyl ở vùng trường cao C 17,8 ppm, 4 carbon CH-O quanh C 70 ppm, 1 carbon anome ở C 102,1 ppm chỉ ra C-1” của đường bị glycosid hóa). Trên phổ proton 1H-NMR (PL-1) của SG01, kết hợp với phổ COSY (PL-6), HSQC (PL-4): có sự hiện diện của 5 proton của 2 vòng benzen. Tín hiệu proton benzen tại δH 5,94 ppm (d; J = 2,5 Hz) ghép cặp meta với proton benzen tại δH 5,92 ppm (d; J = 2 Hz). Tín hiệu proton benzen tại δH 6,87 ppm (dd J =2 và 8 Hz) ghép cặp meta với proton benzen δH 4,08 ppm (d; J = 1,5 Hz) và ghép cặp ortho với proton benzen tại δH 46,83 ppm (d J = 8 Hz). Tín hiệu của các proton H-2, H-3 là các doudlet ở δH 5,09 ppm (d, J = 10,5; 1H) và δH 4,59 ppm (d, J = 11 Hz), với hằng số tương tác lớn thể hiện 2 proton này ở vị trí khác phía so với mặt phẳng phân tử. H-1” trên HMBC (PL-5) quan sát thấy C-3, do đó đường đã tạo liên kết glycosid với OH tại C-3; H1” J = 1,5 Hz, hằng số tương tác nhỏ chứng tỏ H-1” và H-2” là liên kết equatorial còn OH-1” và OH-2” là liên kết axial. Cũng trên HMBC, H-2’ và H-6’ quan sát thấy C-2, do đó vòng B gắn vào C-2. Từ thực nghiệm đối chiếu tài liệu tham khảo, xác định SG01 là astilbin. 11 . . Hình 0.7. Cấu trúc SG01 Bảng 0.7. Các dữ liệu phổ NMR của SG01 SG01 Astilbin (CD3OD, 500 MHz) (CD3OD, 500 MHz) [43] Stt C (ppm) H (ppm) COSY HMBC C (ppm) H (ppm) 2 83,9 5,09 d (10,5), 1H H3 4, 1’, 6’, 3, 2’ 83,9 5,10 d (10,5), 1H 3 78,5 4,59, d (11), 1H H2 4, 1’, 2, 1” 78,5 4,60 d (10,5), 1H 4 195,9 - - - 195,9 - 5 165,5 - - - 165,5 - 6 97,3 5,94, d (2,5), 1H - 8, 7, 5, 10 97,4 5,94 d (2), 1H 7 168,6 - - - 168,5 - 8 96,2 5,92 d (2), 1H - 6, 7, 9, 10 96,2 5,92 d (2), 1H 9 164,1 - - - 164,1 - 10 102,5 - - - 102,5 - 1’ 129,1 - - - 129,2 - 2’ 115,5 6,97, d (2), 1H - 2, 6’, 4’ 115,5 6,98 d (2), 1H 3’ 146,5 - - - 146,5 - 12 . . 4’ 147,3 - - - 147,3 - 5’ 116,3 6,83, d (8), 1H - 1’, 3’ 116,3 6,83 d (8), 1H 6’ 120,4 6,87 dd (2; 8), 1H - 1’, 4’, 2’, 2 120,5 6,86 dd (2; 8), 1H 1” 102,1 4,08, d (1.5), 1H H2” 3, 5”, 2”, 3” 102,1 4.07 d (1,5), 1H 2” 71,7 3,56, m, 1H H3”, H1” 3” 71,7 3,56 dd (1,5; 3), 1H 3” 72,1 3,68, dd (3; 9,5) 1H H4”, H2” 4” 72,1 3,68 dd (3; 9,6), 1H 4” 73,8 3,33, m, 1H H5”, H3” 2”, 3” 73,8 3,30 m, 1H 5” 70,5 4,28, m, 1H H6”, H4” 1” 70,5 4,28 dq (6; 9,6), 1H 6” 17,8 1,21, d (6), 3H H5” 5”, 4” 17,8 1,21 d ( 6), 3H 3.5.2. Xác định cấu trúc SG02 - Phổ UV: trên phổ UV, SG02 cho hấp thu cực đại ở 199 và 295 nm. Hình 0.8. Phổ UV của SG02 - Phổ MS: Trên phổ MS (ESI+), SG02 cho phân mảnh chính [M+Na] với m/z 457,1 tương ứng với phân tử khối là 434 đvC. Hình 0.9. Phổ MS của SG02. 13 . . - Phổ NMR Phổ 13C-NMR (PL-8) và phổ DEPT (PL-9) cho biết có tổng số 19 tín hiệu carbon, nhưng 2 tín hiệu tại C 130,0 và 116,4 ppm có cường độ tăng gấp đôi so với các tín hiệu cacbon khác thể hiện có sự đối xứng trong cấu trúc phân tử, do đó kết luận có tổng số 21 carbon, gồm 7 cacbon bậc 4, 13 nhóm methin (-CH), 1 nhóm methyl (CH3). 12 tín hiệu carbon benzen nằm trong vùng C 95,1 – 167,1 ppm; nhóm cacbonyl (-C=O) ở C 192,8 ppm và 2 nhóm oxymethin ở C 80 và 73 ppm, dự báo khung cấu trúc flavonoid (C6-C3)-C6. 2 tín hiệu carbon đối xứng cách nhau 13,6 ppm, thể hiện vòng B chỉ có 1 nhóm thế. Bên cạnh đó cũng thấy dấu hiệu của đường rhamnose (1 nhóm methyl ở vùng trường cao C 17,6 ppm, 4 carbon CH-O quanh C 70 ppm, 1 carbon anome ở C 98,5 ppm chỉ ra C-1” của đường bị glycosid hóa). Trên phổ proton 1H-NMR (PL-7) của SG02, kết hợp với phổ COSY (PL-12), HSQC (PL-10): có sự hiện diện của 6 proton của 2 vòng benzen. Tín hiệu proton benzen tại δH 5,95 ppm (d; J = 2 Hz) ghép cặp meta với proton benzen tại δH 5,92 ppm (d; J = 2 Hz). Tín hiệu 2 proton benzen tại δH 6,75 ppm (d J =2 Hz; 2H) ghép cặp meta với proton benzen δH 7,25 ppm (d; J = 2Hz; 2H). Tín hiệu của các proton H-2, H-3 là các doudlet ở δH 5,61 ppm (d, J = 10,5; 1H) và δH 4,17 ppm (d, J = 11 Hz), với hằng số tương tác bé thể hiện 2 proton này ở vị trí cùng phía so với mặt phẳng phân tử. H-1” trên HMBC (PL-11) quan sát thấy C-3, do đó đường đã tạo liên kết glycosid với OH tại C-3; H-1” J = 1,5 Hz, hằng số tương tác nhỏ chứng tỏ H-1” và H-2” là liên kết equatorial còn OH-1” và OH-2” là liên kết axial. Cũng trên HMBC, H-2’ và H-6’ quan sát thấy C-2, do đó vòng B gắn vào C-2. Từ thực nghiệm, đối chiếu tài liệu tham khảo [26], [46], xác định được SG02 là isoengeletin. 14 . . Hình 0.10. Cấu trúc SG02 Bảng 0.8. Phổ NMR của SG02 Isoengeletin SG02 (DMSO-d6, 300 MHz) [26], [46] (DMSO-d6, 500 MHz) Stt C (ppm) H (ppm) COSY HMBC C (ppm) H (ppm) 2 80,0 5,61 d (2,5) 1H H-3 C-2’, C-6’, C-1’ 80,1 5,60 br s 3 73,0 4,17 d (2,5), 1H H-2 C-4, C-1” 73,2 4,16 br s 4 192,8 - - - 192,9 - 5 164,0 - - - 164,1 - 6 96,2 5,92 d (2,0) 1H - C-7; C-5, C10, C8 96,3 5,92 d (2) 7 167,1 - - - 167,2 - 8 95,1 5,95 d (2,0) 1H - C-7, C-9, C10, C6 95,3 5,94 d (2) 9 162,6 - - - 162,7 - 10 100,1 - - - 100,3 - 1’ 125,8 - - - 125,9 - 2’ 127,8 7,25 d (8,5) 2H H3’ C-2, C-6’, C-4’ 127,9 7,24 d (8,3) 3’ 114,8 6,75 d (8,5), 2H H2’ C-4’, C-1’, C-5’ 114,9 6,74 d (8,3) 4’ 157,2 - - - 157,3 - 15 . . 5’ 114,8 6,75 d (8,5), 2H H6’ C-4’, 1’, C-3’ 114,9 6,74 d (8,3) 6’ 127,8 7,25 d (8,5) 2H H5’ C-2, C-2’, C-4’ 127,9 7,24 d (8,3) 1” 98,5 4,75 d (1,5), 1H H-2” C-5”, C-3 98,7 4,78 d (1,5) 2” 70,22 3,45 m 1H H-1”, H-3” - 3” 70,15 3,17 m 1H H-4”, H-2” - 4” 71,11 3,03 m 1H H-5”, H-3” - 5” 68,91 2,34 m 1H H-4”, H-6” - 6” 17,6 0,80 d (6,5) 3H H-5” - Ghi chú: Có nhưng không được tác giả trình bày trong tài liệu tham khảo 3.5.3. Xác định cấu trúc SG05 Phổ UV: SG05 cho hấp thu ở 205 và 294 nm Hình 0.11. Phổ UV của SG05 - Phổ MS: Trên phổ MS (ESI+), SG05 cho phân mảnh chính [M-Na]+ với m/z 473,1 tương ứng với PTK là 450 đvC. Hình 0.22. Phổ MS của SG05 16 . . - Phổ NMR Phổ 13C-NMR (PL-14) kết hợp phổ DEPT (PL-15): có 21 tín hiệu cacbon, trong đó có 8 cacbon bậc IV, 12 cacbon methin (-CH) và 1 nhóm methyl (-CH3). 12 tín hiệu của vòng benzen nằm trong vùng C 95,1 – 167,04 ppm; nhóm cacbonyl (C=O) ở C 193,05 ppm và 2 nhóm oxymethin ở C 73,3 và 79,9 ppm, dự báo khung cấu trúc flavonoid (C6-C3)-C6. Bên cạnh đó cũng thấy dấu hiệu của đường rhamnose (1 nhóm methyl ở vùng trường cao C 17,5 ppm, 4 carbon CH-O quanh C 70 ppm, 1 carbon anome ở C 98,8 ppm chỉ ra C-1” của đường bị glycosid hóa). Trên phổ proton 1H-NMR (PL-13) của SG02, kết hợp với phổ HSQC (16): có sự hiện diện của 5 proton của 2 vòng benzen. Tín hiệu proton benzen tại δH 5,94 ppm (d; J = 2 Hz) ghép cặp meta với proton benzen tại δH 5,91 ppm (d; J = 2 Hz). Tín hiệu proton benzen tại δH 6,73 ppm (dd J =2 và 8 Hz) ghép cặp meta với proton benzen δH 4,75 ppm (d; J = 1,5 Hz) và ghép cặp ortho với proton benzen tại δH 6,71 ppm (d J = 8,5 Hz). Tín hiệu của các proton H-2, H-3 là các doudlet ở δH 5,54 ppm (d, J = 2,5 Hz) và δH 4,21 ppm (d, J = 2,5 Hz), với hằng số tương tác bé thể hiện 2 proton này ở vị trí cùng phía so với mặt phẳng phân tử. H-1” trên HMBC (PL-17) quan sát thấy C-3, do đó đường đã tạo liên kết glycosid với OH tại C-3; H-1” J = 1,5 Hz, hằng số tương tác nhỏ chứng tỏ H-1” và H-2” là liên kết equatorial còn OH1” và OH-2” là liên kết axial. Cũng trên HMBC, H-2’ và H-6’ quan sát thấy C-2, do đó vòng B gắn vào C-2. Từ thực nghiệm đối chiếu với tài liệu tham khảo, xác định được SG05 là isoastilbin. Bảng 0.9. Phổ NMR của SG05 (SG05 DMSO-d6, 500 MHz) Isoastilbin, DMSO-d6 400 MHz [37] Stt C (ppm) H (ppm) HMBC C (ppm) H (ppm) 2 79,9 5,54 d (2,5) 1H 9, 1’, 6’, 2’ 79,9 5,53 d (2,6) 3 73,3 4,21 d (2,5) 1H 4, 1” 73,3 4,22 d (2,6) 4 193,0 - - 192,6 - 5 163,9 - - 163,7 - 17 .