Tài liệu Nghiên cứu cải thiện độ tan cao khổ qua và ứng dụng điều chế viên nang có tác dụng hạ glucose huyết

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -------------------- NGUYỄN THỊ MAI NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN ĐỘ TAN CAO KHỔ QUA VÀ ỨNG DỤNG ĐIỀU CHẾ VIÊN NANG CÓ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ------------------ NGUYỄN THỊ MAI NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN ĐỘ TAN CAO KHỔ QUA VÀ ỨNG DỤNG ĐIỀU CHẾ VIÊN NANG CÓ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT Ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc Mã số: 8720202 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Trần Anh Vũ PGS.TS. Nguyễn Thiện Hải Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Nguyễn Thị Mai . . Tóm Tắt Luận văn Thạc sĩ Dược học. Khóa 2017 – 2019 NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN ĐỘ TAN CAO KHỔ QUA VÀ ỨNG DỤNG ĐIỀU CHẾ VIÊN NANG CÓ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT Nguyễn Thị Mai Thầy hướng dẫn: PGS.TS. Trần Anh Vũ, PGS.TS. Nguyễn Thiện Hải Mở đầu Cao đặc quả khổ qua rừng (cao đặc khổ qua G) được chiết với dung môi ethanol 70% khó tan trong nước thấp, vì vậy việc cải thiện độ tan trong nước của cao nhằm tăng độ hấp thu và giảm liều của thuốc là điều cần thiết. Cao khổ qua cải thiện (CT) được xây dựng TCCS. Dùng làm nguyên liệu chính cho viên nang khổ qua rừng và chế phẩm này được thử tác dụng hạ đường huyết trên in vitro và in vivo cho kết quả tốt. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Cao đặc khổ qua G được kiểm tra đạt TCCS. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp trộn vật lý cao khổ qua G với chất diện hoạt, khảo sát theo tỷ lệ và thời gian khuấy trộn phù hợp thu được cao khổ qua CT. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng charantin trong dịch thử độ hòa tan của cao khổ qua thông qua chất chỉ điểm là charantin bằng hệ thống HPLC, xây dựng TCCS cao khổ qua CT và dùng làm nguồn nguyên liệu chính trong công thức viên nang, xây dựng công thức và quy trình điều chế viên nang khổ qua rừng, xây dựng TCCS cho viên nang, đồng thời thử độc tính cấp và tác dụng hạ glucose huyết trên chuột. Kết quả Với tỷ lệ cao đặc khổ qua G: chất diện hoạt kolliphor RH 40 (1 : 0,08) và thời gian khuấy trộn khoảng 37,5 phút cải thiện độ tan tốt nhất, theo quy trình trên điều chế 2 kg cao khổ qua CT cho hàm lượng charantin hòa tan tăng lên khoảng 35 lần. Đã xây dựng TCCS cho cao khổ qua CT gồm: mô tả, mất khối lượng do làm khô, định tính, định lượng, giới hạn độ nhiễm khuẩn. Đã xây dựng công thức và quy trình điều chế viên nang khổ qua rừng, tiêu chuẩn kỹ thuật và các phương pháp kiểm nghiệm của viên nang khổ qua rừng đã được xây dựng. Kết quả thử độc tính cấp và tác dụng hạ glucose huyết trên chuột: Với liều tối đa có thể cho chuột uống được mà không gây chết Dmax cao = 20g/kg, Dmax cốm viên nang = 10 g/kg. Viên nang khổ qua rừng liều 0,55 g/kg cho tác dụng hạ glucose huyết tương đương thuốc chứng glibenclamid liều 5 mg/kg. Kết luận Đã nghiên cứu cải thiện độ tan cao đặc qủa khổ qua rừng và ứng dụng điều chế viên nang khổ qua rừng có tác dụng hạ glucose huyết tốt. . . i THE ABSTRACT Master's thesis of pharmacy. Academic course 2017 – 2019 Study on solubility improvement of the condensed extracts of Momordica charantia L and the application as the main material for capsules that effect on hypoglycemic Nguyen Thi Mai Supervivor: Associate Professor: Tran Anh Vu - Associate Professor: Nguyen Thien Hai Introduction: The concentrated fruit of Momordica charantia L was extracted with ethanol solvent. This concentrated extract has low water solubility that may cause difficulties in formulation and therapy. Therefore, in order to enhance the absorbability and therapeutic effect of Momordica charantia concentrated extract, it is necessary to improve the water solubility of this concentrated extract. The post-improvement concentrated extract was initially developed and validated. This extract can be used as a main ingredient for capsules that has been tested for hypoglycemic effects on in vitro, in vivo for good results. Subject and method: Subject: The concentrated fruit of Momordica charantia L was tested and meet the inhouse standards. Method: Using the physical mixing method to mix the standard concentrated Momordica charantia with the surfactant; investigating the suitable ratio and stirring time for the preparation of the post-improvement concentrated extracts. The solubility of these concentrated extracts was evaluated using HPLC method, based on the charantin quantification process. Establishing specification standards for the postimprovement concentrated extract. Using the extract as a main ingredient to develop the capsule formulation and manufacturing process. The capsule was developed, validated; and tested for hypoglcemic effects and acute oral toxicity on mouse. Result: The combination of concentrated Momordica charantia and the surfactant kolliphore RH 40 with the ratio of 1: 0.08 and stirring time of approximately 37.5 minutes proved to be the best preparation condition. As a result, the solubility of charantin in 2 kg of concentrated Momordica charantia after being improved was 35 times higher than the former one. The post-improvement, concentrated extract was developed and validated the appearance, moisture, bacteria limit, qualitative and quantitative specifications. The formulation had suitable physical properties for the capsule, technical specifications and characterization method of Momordica charantia capsule was established. The results of acute oral toxicity on mouse showed that LD50 cannot be found and D max of granules is 10 g/kg b.w. and D max of concentrated is 20 g/kg b.w. Moreover, STZ-induced diabetic mice’s blood glucose levels in the test groups, at the dose of 0.55 g/kg/day b.w. were not significantly different (p>0,05) compared to those in the glibenclamide treated group, at the dose of 5 mg/kg/day after 15-day treatment. Conclusion This study successfully improved solubility of the condensed fruit extracts of Momordica charantia L and used this extract the main material for capsules that effect on hypoglycemic. . . MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... vi DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................... vii DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... viii Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU KHỔ QUA......................................................... 3 1.1.1.Thành phần hóa học ................................................................................................ 3 1.1.2.Tác dụng dược lý .................................................................................................... 4 1.1.3.Charantin ................................................................................................................. 5 1.1.4.Công dụng ............................................................................................................... 6 1.1.5.Một số thành phẩm từ dược liệu khổ qua ............................................................... 6 1.1.6.Cao đặc khổ qua G và chế phẩm ............................................................................. 7 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI THIỆN ĐỘ TAN VÀ ĐỘ HÒA TAN CỦA CÁC THÀNH PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU .................................................................................. 8 1.2.1.Một số phương pháp cải thiện độ tan thành phẩm từ dược liệu.............................. 8 2.2.2. Nghiên cứu cải thiện độ hòa tan của các thành phẩm từ dược liệu ..................... 13 1.3. KỸ THUẬT BÀO CHẾ THUỐC NANG DƯỢC LIỆU ...................................... 14 1.3.1.Khái niệm .............................................................................................................. 14 1.3.2.Kỹ thuật bào chế ................................................................................................... 15 1.3.3.Yêu cầu chất lượng viên nang............................................................................... 17 1.4. CÁC MÔ HÌNH THỬ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT ............................ 18 1.4.1.Khảo sát tác dụng hạ glucose huyết trên mô hình chuột ...................................... 18 1.4.2.Khảo sát tác dụng hạ glucose huyết in vitro ......................................................... 19 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 21 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ ...................................... 21 2.1.1.Nguyên liệu ........................................................................................................... 21 2.1.2.Hóa chất, tá dược, dung môi ................................................................................. 21 2.1.3.Trang thiết bị ......................................................................................................... 23 2.1.1.Nơi tiến hành ......................................................................................................... 23 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 24 . . 2.2.1.Cải thiện độ tan cao khổ qua G ............................................................................. 24 2.2.2.Nghiên cứu bào chế viên nang và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở .............................. 35 2.2.3.Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 38 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................... 43 3.1. CẢI THIỆN ĐỘ TAN CAO KHỔ QUA G .......................................................... 43 3.1.1.Kiểm tra cao khổ qua G theo tiêu chuẩn cơ sở ..................................................... 43 3.1.2.Cải thiện độ tan cao khổ qua G (cao khổ qua CT) ................................................ 50 3.1.3.Phương pháp điều chế cao khổ qua CT ................................................................ 61 3.1.4.Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao khổ qua CT .................................................. 62 3.1.5.So sánh cao và cốm khổ qua G và CT .................................................................. 63 3.2. NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NANG VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ ............................................................................................................................... 67 3.2.1.Xây dựng công thức .............................................................................................. 67 3.2.2.Xây dựng quy trình bào chế .................................................................................. 71 3.2.3.Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho viên nang ............................................................ 73 3.2.4.Nâng cấp cỡ lô nghiên cứu. .................................................................................. 74 3.2.5.Sơ bộ đánh giá độ ổn định của thành phẩm .......................................................... 76 3.3. THỬ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE CỦA THÀNH PHẨM78 3.3.1.Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết trên in vitro.................................................. 78 3.3.2.Thử độc tính cấp và tác dụng hạ glucose huyết của thành phẩm trên in vivo....... 79 Chương 4. BÀN LUẬN ................................................................................................. 91 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 97 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN TÀI LIỆU THAM KHẢO . i. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt Cao G Cao khổ qua gốc (chưa cải Cao khổ qua gốc (chưa cải thiện) Cao CT thiện) Cao khổ qua cải thiện Cao khổ qua cải thiện DĐVN Dược điển Việt Nam Dược điển Việt Nam HPTR Hệ phân tán rắn Hệ phân tán rắn IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thí nghiệm ICH International Conference on Hội nghị quốc tế về hài hòa Harmonization KQR Khổ qua rừng LD0 Lethal dose 0% LD50 Lethal dose 50% OD Optical density Mật độ quang PDA Photo Diode Array (Đầu dò) dãy diod quang RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SKLM Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng STZ Streptozotocin TCCS Tiêu chuẩn cơ sở Tiêu chuẩn cơ sở USP United State Pharmacopoeia Dược điển Mỹ . Khổ qua rừng Liều làm chết 0% số con vật thí nghiệm Liều làm chết 50% số con vật thí nghiệm . i DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Khổ qua rừng tươi và khô................................................................................ 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo hóa học của charantin ........................................................ 6 Hình 1.3. Một số thành phẩm từ khổ qua trên thị trường ................................................ 7 Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng thủy phân pNPG của α-glucosidase .................................... 20 Hình 3.1. Sắc ký đồ tính đặc hiệu.................................................................................. 45 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa nồng độ và diện tích pic của charantin 45 Hình 3.3. Kết quả định tính cao khổ qua bằng SKLM .................................................. 49 Hình 3.4. Sắc ký đồ tính đặc hiệu.................................................................................. 52 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa nồng độ và diện tích pic của charantin 53 Hình 3.6. So sánh độ tan của charantin trong cao, cốm khổ qua G và CT.................... 65 Hình 3.7. So sánh khả năng ức chế enzym α-glucosidase trong cao, cốm khổ qua G và CT................................................................................................................................... 66 Hình 3.8. Viên nang khổ qua rừng ................................................................................ 73 Hình 3.9. Đường huyết trung bình của 3 lô chuột ở ngày 0, 5, 10 và 15 ...................... 81 Hình 3.10. Đường huyết trung bình của 3 lô chuột đái tháo đường trước (ngày 0) ...... 82 Hình 3.11. Đường huyết trung bình của 4 lô chuột vào các ngày 0, 5, 10 và 15 .......... 86 Hình 3.12. Đường huyết trung bình của 4 lô chuột đái tháo đường trước (ngày 0) ...... 87 Hình 3.13. Trọng lượng trung bình của 4 lô chuột đái tháo đường trước, sau khi tiêm STZ và sau 14 ngày điều trị. .......................................................................................... 89 . . ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Danh mục các nguyên liệu dùng trong nghiên cứu và bào chế..................... 21 Bảng 2.2. Danh mục các hóa chất dùng trong kiểm nghiệm ......................................... 22 Bảng 2.3. Danh mục thiết bị dùng trong nghiên cứu ..................................................... 23 Bảng 2.4. Thành phần các chất trong các mẫu thử nghiệm trên đĩa 96 giếng ............... 30 Bảng 2.5. Thứ tự thực hiện thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase ........... 30 Bảng 2.6. Khảo sát phương pháp và chất trợ tan ........................................................... 32 Bảng 2.7. Đặt kế hoạch thử nghiệm .............................................................................. 33 Bảng 2.8. Lịch trình lấy mẫu thử độ ổn định ................................................................. 38 Bảng 3.1. Kết quả tính tương thích hệ thống ................................................................. 43 Bảng 3.2. Số liệu tính tuyến tính của quy trình hồi quy định lượng charantin ............. 45 Bảng 3.3. Kết quả xác định độ chính xác của mẫu cao và cốm khổ qua....................... 46 Bảng 3.4. Kết quả xác định độ đúng mẫu cao ............................................................... 47 Bảng 3.5. Kết quả xác định độ đúng mẫu cốm .............................................................. 48 Bảng 3.6. Kết quả mất khối lượng do làm khô của cao khổ qua G ............................... 48 Bảng 3.7. Kết quả định lượng cao khổ qua G ............................................................... 49 Bảng 3.8. Kết quả tính tương thích hệ thống ................................................................. 51 Bảng 3.9. Số liệu đường tuyến tính của quy trình định lượng charantin....................... 53 Bảng 3.10. Kết quả xác định độ chính xác của mẫu cao, cốm khổ qua CT .................. 54 Bảng 3.11. Kết quả xác định độ đúng mẫu cao khổ qua CT ......................................... 55 Bảng 3.12. Kết quả xác định độ đúng mẫu cốm khổ qua CT ........................................ 55 Bảng 3.13. Tỷ lệ phần trăm ức chế (I%) các lần thử hoạt tính acarbose ....................... 56 Bảng 3.14. Kết quả thăm dò T% truyền qua và độ hấp thụ A ....................................... 57 Bảng 3.15. Kết quả định lượng charantin trong dịch thử độ hòa tan của cao và cốm... 58 Bảng 3.16. Kết quả khả năng ức chế (I%) của các mẫu cao và cốm ............................. 59 Bảng 3.17. Điều kiện phù hợp để cải thiện độ tan......................................................... 60 Bảng 3.18. Ma trận bố trí thí nghiệm và kết quả ........................................................... 60 Bảng 3.19. Các thí nghiệm ở mức cơ bản ..................................................................... 61 Bảng 3.20. Kết quả tối ưu theo phương pháp Box-Wilson ........................................... 61 Bảng 3.21. Kết quả mất khối lượng do làm khô của cao CT ........................................ 62 . . Bảng 3.22. Kết quả định lượng charantin trong cao đặc khổ qua CT ........................... 62 Bảng 3.23. Tiêu chuẩn cao đặc khổ qua CT .................................................................. 63 Bảng 3.24. Kết quả định lượng charantin trong dịch thử độ hòa tan của cao, cốm khổ qua G và CT ................................................................................................................... 64 Bảng 3.25. So sánh độ tan của charantin trong cao, cốm khổ qua G và CT ................. 64 Bảng 3.26. Kết quả thử ức chế enzym α-glucosudase của cao, cốm khổ qua G và CT 66 Bảng 3.27. Các công thức thăm dò hàm lượng cao ....................................................... 67 Bảng 3.28. Kết quả thăm dò hàm lượng cao ................................................................. 67 Bảng 3.29. Công thức thiết kế lựa chọn tá dược hút ..................................................... 68 Bảng 3.30. Kết quả thăm dò hàm lượng tá dược hút ..................................................... 68 Bảng 3.31. Công thức thiết kế lựa chọn tá dược độn .................................................... 68 Bảng 3.32. Kết quả đánh giá các công thức lựa chọn tá dược độn................................ 69 Bảng 3.33. Thiết kế các công thức để lựa chọn tỷ lệ tá dược độn ................................. 69 Bảng 3.34. Kết qủa đánh giá các công thức lựa chọn tỷ lệ tá dược độn........................ 70 Bảng 3.35. Thành phần công thức cho 100 g bột cốm đóng nang ................................ 70 Bảng 3.36. Kết quả đánh giá chất lượng bột cốm đóng nang ........................................ 71 Bảng 3.37. Kết quả định lượng charantin trong cốm đóng nang ................................... 72 Bảng 3.38. Tiêu chuẩn cơ sở viên nang khổ qua rừng .................................................. 74 Bảng 3.39. Công thức bào chế cho 1 lô 2000 viên nang khổ qua rừng ......................... 74 Bảng 3.40. Kết qủa kiểm tra 3 lô thành phẩm ............................................................... 75 Bảng 3.41. Điều kiện bảo quản và thời gian biểu lấy mẫu ............................................ 76 Bảng 3.42. Kết quả thử sơ bộ độ ổn định của 3 lô thành phẩm. .................................... 77 Bảng 3.43. Khả năng ức chế enzym α-glucosidase của thành phẩm............................. 78 Bảng 3.44. Đường huyết trung bình của 3 lô chuột ở các ngày 0, 5, 10 và 15 ............. 80 Bảng 3.45. Kết quả trọng lượng lô chuột chứng sinh lý thử nghiệm dò liều ................ 82 Bảng 3.46. Kết quả theo dõi trọng lượng các lô chuột .................................................. 83 Bảng 3.47. Đường huyết trung bình của 5 lô chuột ở ngày 0, 5, 10 và 15 .................... 85 Bảng 3.48. Kết quả Trọng lượng lô chuột chứng sinh lý thử nghiệm chính thức ......... 88 Bảng 3.49. Trọng lượng chuột trước, sau tiêm STZ và sau 14 ngày điều trị ................ 88 . . LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và trân trọng nhất đến với Cô PGS.TS. Trần Anh Vũ và Thầy PGS.TS. Nguyễn Thiện Hải đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức quý báu, giúp em hoàn thành tốt luận văn. Em xin chân thành cảm ơn hội đồng chấm bảo vệ luận văn, cảm ơn quý Thầy Cô đã dành thời gian đọc và góp ý chân thành giúp luận văn em được hoàn thành tốt hơn. Em xin gửi lời cám ơn đến Th.S Hoàng Thái Phượng Các, Th.S Cao Thị Cẩm Tú cùng với các bạn Hồng, Diễm, Vũ, Trang, Hà, Hợp ở khoa Dược lý, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. HCM và các anh chị tổ vô nang công ty cổ phần dược phẩm Phong Phú đã hỗ trợ em thực hiện đề tài. Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm khoa Dược, bộ môn Bào chế, gia đình và bạn bè đã hết lòng tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Nguyễn Thị Mai . . MỞ ĐẦU Đái tháo đường là bệnh lý mạn tính, có xu hướng ngày càng gia tăng trong xã hội hiện đại. Theo số liệu ước tính của liên đoàn đái tháo đường thế giới (IDF), tính đến năm 2017 trên toàn thế giới có khoảng 425 triệu người mắc bệnh đái tháo đường, trong đó có khoảng 327 triệu người đang độ tuổi làm việc chiếm hơn 2/3, điều đáng chú ý là số tuổi người bệnh ngày càng trẻ hóa [33]. Thuốc được dùng trong điều trị đái tháo đường hiện nay đa phần có nguồn gốc hóa dược, chỉ có một số bài thuốc gia truyền có thể dùng để hỗ trợ kiểm soát đường huyết như viên nang Thanh Đường An hay viên nang hạ đường GLUGAZ nhưng số lượng còn rất hạn chế, người bệnh dùng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu thường nhằm mục đích hỗ trợ giảm liều thuốc hóa dược hay ngăn ngừa các biến chứng do bệnh và thuốc gây ra. Một số công ty ở Việt Nam cũng có nhu cầu lớn trong việc nghiên cứu và sản xuất những chế phẩm thuốc dược liệu để hỗ trợ điều trị đái tháo đường như: công ty cổ phần Đức Thành Food Tây Ninh, công ty TNHH Giai Cảnh hay công ty cổ phần dược phẩm HEBIPAR. Với dược liệu khổ qua rừng (Momordica charantia Linn. var. abreviata Seringe., Cucurbitaceae) có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước chứng minh tác dụng hạ glucose huyết trên in vitro, in vivo và cả trên lâm sàng, cũng đã chứng minh một trong những hợp chất saponin chính của quả khổ qua rừng có tác dụng hạ đường huyết là charantin, với cơ chế làm tăng tiết insulin, kích thích sử dụng glucose ở cơ xương và ngoại vi, ức chế hấp thu glucose ở ruột [9], [56], [61], [63]. Cao khổ qua trước đây đã được nhóm nghiên cứu khoa Dược trường Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu chiết xuất với điều kiện được chọn là ethanol 70% đã được xây dựng tiêu chuẩn cơ sở với hàm lượng charantin ≥ 0,7% và được thử tác dụng dược lý tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành Phố Hồ Chí Minh cho tác dụng hạ glucose huyết tốt, tuy nhiên cao này khó tan trong nước nên khả năng hấp thu qua đường uống kém, để có tác dụng trị liệu cần phải sử dụng một lượng lớn gây bất tiện cho người dùng và khó khăn trong bào chế sản phẩm. Việc . . cải thiện độ tan của cao nhằm giúp cơ thể hấp thu thuốc tốt hơn, giảm lượng dùng mà vẫn có hiệu quả điều trị tốt. Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu cải thiện độ tan cao khổ qua (Momordica charantia Linn. var. abreviata Seringe., Cucurbitaceae) và ứng dụng điều chế viên nang có tác dụng hạ glucose huyết” được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu một dạng bào chế chứa cao dược liệu khổ qua rừng có độ tan cao, nhằm hỗ trợ điều trị bệnh nhân đái tháo đường type 2. Để giải quyết mục tiêu đề ra, các nội dung cần thực hiện - Nghiên cứu cải thiện độ tan cao khổ qua và dùng làm nguồn nguyên liệu cho chế phẩm viên nang. - Nghiên cứu bào chế viên nang và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở. - Khảo sát độc tính cấp và tác dụng hạ glucose huyết của thành phẩm trên in vitro và in vivo. . . Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU KHỔ QUA Tên thường gọi : khổ qua rừng. Tên khác: mướp đắng dại, ổ qua rừng. Tên khoa học: Momordica charantia L. var. abreviata Ser., họ Bầu bí (Cucurbitaceace) Tên nước ngoài: wild bitter melon, wild bitter squash. Trên thế giới, khổ qua có mặt ở hầu hết các nước nhiệt đới từ châu Phi sang châu Á và châu Mỹ. Ở nước ta khổ qua được trồng từ các tỉnh đồng bằng đến miền núi. Bộ phận dùng: Quả, lá, hạt. Quả thu hái khi có màu xanh lục dùng tươi hay khô. Hạt lấy ở quả chín, phơi khô. Lá và rễ thu hái quanh năm dùng tươi [1]. Hình 1.1. Khổ qua rừng tươi và khô 1.1.1. Thành phần hóa học Quả khổ qua chứa saponin, glycosid, alkaloid, đường khử, resin, các hợp chất phenolic, dầu béo, acid béo... Có nhiều hợp chất cucurbitane triterpenoids đã được phân lập từ quả khổ qua như charantin, charine, chitinase, daucosterol, kakara, kakara Ib, kakara IIIa1, kakara IIIb1, momordicin, momordicinin, momordicilin, momordenol, momordol, momordin, momordica agglutinin, momordicosid momordicosid F1, momordicosid F2, momordicosid G, momordicosid I, momordicosid L,K,M,N,O,P [21], [38], [61]. Hạt khổ qua giàu acid béo, acid amin, sterol glycosid và nhiều chất khác. Acid béo chính trong hạt được tìm thấy là acid eleostearic (ESA), ngoài ra có các acid béo khác như: palmitic, palmitoleic, stearic, oleic, linoleic, linolenic…. Các sterol glycosid và một số hợp chất khác đã được phân lập từ hạt khổ qua: momordicosid . . A, momordicosid B, momordicosid C, momordicosid D, momordicosid E, βSitosterol-β-D-glucosid, acid stearic, vicin, zeatin, zeatin ribosid, momorcharin I, momorcharin II. Hầu hết các acid amin cần thiết đều có trong hạt [21]. Jiayin Yue và cộng sự (2017) đã xác định tổng cộng 21 loại triterpenoids dạng cucurbitane được phân lập từ dịch chiết xuất của quả Momordica charantia L., trong đó có hai loại glycosid mới được phát hiện có tên là charantoside IX và X [37]. 1.1.2. Tác dụng dược lý Một số nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy các chất phân lập từ khổ qua có tác dụng hạ đường huyết và khả năng ức chế enzym α-glucosidase tốt, một trong những chất đó là charatin. Tác dụng hạ glucose huyết Các hợp chất chính được phân lập từ khổ qua và xác định có tác dụng hạ glucose huyết gồm: charantin, polypeptid-p và vicin [31], [34]. Hiện nay, có khoảng 140 nghiên cứu khác nhau trên thế giới nghiên cứu về tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết và các thành phần khổ qua trên cả mô hình động vật và trên người [20]. Một số nghiên cứu trên động vật cho thấy hiệu quả hạ glucose huyết được so sánh với các thuốc đường uống như tolbutamid, chlorpropamid và glibenclamid [46], [63]. Cao cồn khổ qua cho chuột cống trắng uống 500 mg/kg làm giảm mức glucose huyết từ 10 - 16% sau 1 giờ và 6% sau 2 giờ (ở chuột bình thường) và 26% sau 3,5 giờ ở chuột gây đái tháo đường với streptozotocin, cao cồn khổ qua làm tăng tốc độ tổng hợp glycogen từ 14 C - glucose trong gan của chuột được cho ăn chế độ bình thường gấp 4 - 5 lần, điều đó gợi ý rằng cao cồn có tác dụng một phần do làm tăng sử dụng glucose ở gan, các kết quả trên cho thấy rằng khổ qua có tác dụng tốt trong điều trị đái tháo đường [23], [59], [64]. Ở Việt Nam, nhóm tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu và các cộng sự đã sản xuất thành phẩm Morantin từ khổ qua và chứng minh tác dụng hạ glucose huyết trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng alloxan [10]. Các tác giả Mai Phương Mai, Võ Phùng Nguyên đã thăm dò tác dụng hạ glucose huyết của một số bài thuốc dân gian theo mô hình đái tháo đường bằng streptozotocin trên . . chuột nhắt, trong thành phần bài thuốc có chứa quả khổ qua [4]. Các tác giả Trần Anh Vũ, Hoàng Thái Phượng Các đã nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của thành phẩm cốm hỗn dịch từ cao quế và khổ qua loại quả nhỏ trên mô hình chuột nhắt [14]. Khả năng ức chế enzym α-glucosidase Jiayin Yue và các cộng sự (2017) đã thử tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của 21 chất phân lập từ quả Momordica charantia L., kết quả có 3 chất gồm: Karaviloside II, (19R,23E)-5b,19-epoxy-19,25-dimethoxycucurbita-6,23-dien-3b-ol và 25- O-methylkaraviagein D, cho khả năng ức chế enzym α-glucosidase rất tốt [37]. 1.1.3. Charantin Charantin là một steroid glycosid được phân lập từ cây khổ qua, tồn tại trong cây dưới dạng hỗn hợp của stigmasterol glucosid và sitosterol glucosid với tỷ lệ 1 : 1, là chất kết tinh màu trắng, trung tính, không vị. Tính tan: Charantin tan tốt trong chloroform, dichloromethan, tan được trong methanol và ethanol, kém tan trong nước. Tác dụng dược lý: Charantin được thử nghiệm tác dụng hạ glucose huyết trên thỏ, kết quả cho thấy glucose huyết hạ dần trong vòng một đến bốn giờ và sau đó hồi phục từ từ trở về mức ban đầu, với liều uống 50 mg/kg, lượng glucose trong máu đã giảm 42% sau 4 giờ. Cơ chế hạ glucose huyết của charantin được cho rằng có tác dụng trên tuyến tụy và cả ngoài tụy. Ngoài ra charantin cũng được nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp trên mèo với liều 800 mg/kg có thể gây hạ 5 - 10% huyết áp của mèo [41], [61]. . . A A: Stigmasterol glucosid B B: Sitosterol glucosid Hình 1.2. Công thức cấu tạo hóa học của charantin 1.1.4. Công dụng Ở nước ta, ngoài công dụng làm thực phẩm, khổ qua còn được dùng làm một vị thuốc, tắm cho trẻ em trừ rôm sẩy. Ở Phillippin, quả dùng dưới dạng nước sắc hay thuốc viên chữa đái tháo đường không phụ thuộc insulin. Tại Puerto Rico (một nước gần Cuba, châu Mỹ), khổ qua được dùng trong y học dân gian chữa bệnh đái tháo đường. Tại Ấn Độ, quả, lá và rễ được dùng làm thuốc chữa đái tháo đường [1]. 1.1.5. Một số thành phẩm từ dược liệu khổ qua Viên nang mướp đắng KA của Công ty TNHH thực phẩm chức năng Khánh An, thành phần bao gồm 130 mg cao khô quả khổ qua rừng, lactose vừa đủ 1 viên nang 500 mg. Dùng cho người bị đái tháo đường, tiền đái tháo đường. Người lớn: mỗi lần uống 2 - 3 viên, ngày 2 lần. Viên nang khổ qua rừng MUDARU của công ty cổ phần TNB Việt Nam. Mỗi viên chứa 130 mg cao khô tương đương 1,3 g dược liệu khô. Dùng hỗ trợ cho bệnh nhân cao huyết áp, rối loạn cholesterol, đái tháo đường, người đang ăn kiêng hay những người có vấn đề về tim mạch. Ngày uống 2 lần, mỗi lần 1 - 2 viên trước bữa ăn. Viên nén Wild Bitter Melon Extract của công ty Jarrow Formulas®. Mỗi viên chứa 750 mg cao khổ qua rừng (tỷ lệ dược liệu/cao là 15 : 1). Dùng hỗ trợ người cao huyết áp và đái tháo đường, dùng 2 viên mỗi ngày. . . Hình 1.3. Một số thành phẩm từ khổ qua trên thị trường 1.1.6. Cao đặc khổ qua G và chế phẩm Năm 2017, nhóm nghiên cứu Trần Anh Vũ, Dương Thị Mộng Ngọc, Nguyễn Thị Thu Hằng [13] đã nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu khổ qua loại quả nhỏ(Momordica charantia Linn. var. abreviata Seringe., Cucurbitaceae) (khổ qua rừng). Trong đó chỉ tiêu độ ẩm không quá 13% và chỉ tiêu định lượng: hàm lượng charantin trong bột quả không được dưới 0,07 % tính trên dược liệu khô tuyệt đối. Tiếp theo đó nhóm nghiên cứu Trần Anh Vũ, Huỳnh Thanh Hậu [15] đã nghiên cứu điều chế cao đặc khổ qua G từ quả khổ qua rừng với dung môi chiết xuất là cồn 70%, tỷ lệ dược liệu: dung môi 1: 6,5 và đã xây dựng TCCS cho cao đặc khổ qua G gồm các chỉ tiêu như: cảm quan, mất khối lượng do làm khô (≤ 12%), định tính, định lượng (hàm lượng charantin trong cao ≥ 0,70%), Cao này khó tan trong nước (1 g cao cần trên 200 ml nước cất), trong chế phẩm cốm pha hỗn dịch và cao khổ qua được kết hợp với cao quế (tỷ lệ 6: 4) cũng đã được thử tác dụng hạ glucose huyết trên chuột, với liều 0,84 g/kg chuột (tương đương 0,42 g hỗn hợp cao khổ qua , quế) cho tác dụng hạ glucose huyết so với trước khi điều trị (50,0%) tương đương thuốc chứng glibenclamid liều 5 mg/kg (46,8%) [14]. . . 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI THIỆN ĐỘ TAN VÀ ĐỘ HÒA TAN CỦA CÁC THÀNH PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU Thuốc uống chỉ được hấp thu hoàn toàn khi hoạt chất tan tốt trong môi trường dịch tiêu hóa tuy nhiên, không phải hoạt chất nào cũng tan tốt trong nước đặc biệt các hoạt chất có nguồn gốc từ dược liệu. Do đó cải thiện độ tan là một thách thức lớn trong nghiên cứu và phát triển thuốc [57]. Thử nghiệm độ hòa tan là một trong những phương tiện cần thiết để kiểm soát chất lượng dược phẩm rắn trong sản xuất thuốc, nhằm đánh giá khả năng hòa tan và sẵn sàng hấp thu của thuốc trong đường tiêu hóa, điều kiện thử nghiệm độ hòa tan in vitro cần tương tự với tình trạng in vivo. Tiêu chí xác định độ hòa tan là tỷ lệ phần trăm dược chất hòa tan vào môi trường thử so với hàm lượng ghi trên nhãn, đối với thuốc phóng thích tức thời được xác định ở một thời điểm nhất định, môi trường thử độ hòa tan có thể là nước cất hay môi trường có pH giống dịch tiêu hóa [8]. Đối với các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu, việc thử độ hòa tan gặp nhiều khó khăn hơn so với thuốc từ hóa dược do tính chất hóa học phức tạp của dược liệu và nhiều chất với cấu trúc khác nhau. Việc nghiên cứu các môi trường hòa tan để cải thiện độ tan của các chất chỉ điểm trong dược liệu đã được chứng minh có tác dụng dược lý có thể làm thay đổi hiệu quả trị liệu của thuốc [30]. 1.2.1. Một số phương pháp cải thiện độ tan thành phẩm từ dược liệu 1.2.1.1. Phương pháp vật lý Giảm kích thước tiểu phân Khi kích thước tiểu phân càng nhỏ thì tổng diện tích bề mặt càng lớn, sự tương tác với dung môi tăng lên dẫn đến tăng khả năng hòa tan. Những phương pháp thông thường làm giảm kích thước tiểu phân dựa trên tác động cơ học như nghiền, phun sấy, phương pháp micro hóa (micronization) là kỹ thuật làm giảm kích thước tiểu phân bằng cách dùng máy nghiền phản lực (jet mill), máy xay keo (colloid mill). Các phương pháp này làm tăng tốc độ tan nhưng không làm tăng độ tan, thường kết hợp các chất hỗ trợ như: nhóm chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt ... để giúp gia tăng độ tan và tốc độ tan [57]. .