Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế (perionyx excavatus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG PROTEASE LÊN QUÁ TRÌNH THU NHẬN DỊCH THỦY PHÂN TỪ TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) Bình Dương – Tháng 3 năm 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG PROTEASE LÊN QUÁ TRÌNH THU NHẬN DỊCH THỦY PHÂN TỪ TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) Sinh viên thực hiện: Huỳnh Thị Kim Trang Nam, Nữ: Nữ Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: Tài Nguyên Môi Trường Ngành học: Khoa Học Môi Trường Người hướng dẫn: Thạc sĩ Trần Ngọc Hùng Năm thứ: 3 /Số năm đào tạo: 4 UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập – Tự do – Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế (Perionyx excavatus). - Sinh viên thực hiện: Huỳnh Thị Kim Trang - Lớp: D13MT02 Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4 - Người hướng dẫn: Thạc sĩ Trần Ngọc Hùng 2. Mục tiêu đề tài: Thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế qua quá trình thủy phân. Xác định ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế. 3. Tính mới và sáng tạo: Nghiên cứu đi sâu và quan tâm vào vấn đề mới là bổ sung enzyme protease và các yếu tố ảnh hưởng như nhiệt độ và thời gian nhằm tối ưu quá trình thủy phân trùn quế, rút ngắn thời gian thủy phân, nâng cao hiệu suất thủy phân trùn để thu được dịch trùn có hàm lượng đạm cao. 4. Kết quả nghiên cứu: Để tối ưu quá trình thủy phân trùn quế và thu được dịch thủy phân với hàm lượng đạm cao, cần thiết phải tiên hành quá trình tự phân trùn quế trong điều kiện bổ sung enzyme protease. Quá trình nghiên cứu cho thấy với hoạt độ enzyme protease bổ sung là 2,5UI, ở nhiệt độ 35oC và thời gian thủy phân 8 giờ là tối ưu cho việc bổ sung enzyme protease để thu nhận dịch thủy phân với tổng lượng đạm hòa tan là 15,4g/lít. 5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài: Nghiên cứu đã đưa ra các yếu tố và điều kiện về hàm lượng protease cần thêm vào, nhiệt độ và thời gian ủ để tối ưu quá trình thu nhận dịch thủy phân trùn quế, rút ngắn thời gian và tăng hiệu suất thủy phân của trùn quế đồng thời thu được lượng đạm hòa tan cao trong dịch thủy phân trùn giúp góp phần mang lại giá trị cao hơn cho các sản phẩm trùn quế đồng thời giúp phát triển nghề nuôi trùn. Ngoài ra, dịch trùn có hiệu suất thủy phân cao giúp tăng hiệu quả cho cây trồng, vật nuôi, giúp phát triển ngành trồng trọt và chăn nuôi khi sử dụng dịch trùn phun lên cây trồng cũng như làm thức ăn cho thủy sản, gia cầm... 6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ họ tên tác giả, nhan đề và các yếu tố về xuất bản nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có): Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm chính thực hiện đề tài (ký, họ và tên) Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực hiện đề tài (phần này do người hướng dẫn ghi): ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm Xác nhận của lãnh đạo khoa Người hướng dẫn (ký, họ và tên) (ký, họ và tên) UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập – Tự do – Hạnh phúc THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I. SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN: Ảnh 4x6 Họ và tên: Huỳnh Thị Kim Trang Sinh ngày: 27 tháng 9 năm 1994 Nơi sinh: Bình Dương Lớp: D13MT02 Khóa: 2013-2017 Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Địa chỉ liên hệ: Phường Phú Thọ, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương Điện thoại: 0909619944 Email: [email protected] II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích của sinh viên từ năm thứ 1 đến năm đang học): * Năm thứ 1: Ngành học: Khoa học Môi trường Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Kết quả xếp loại học tập: Khá Sơ lược thành tích: * Năm thứ 2: Ngành học: Khoa học Môi trường Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Kết quả xếp loại học tập: Khá Sơ lược thành tích: * Năm thứ 3: Ngành học: Khoa học Môi trường Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Kết quả xếp loại học tập: Khá Sơ lược thành tích: Ngày Xác nhận của lãnh đạo khoa tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm chính (ký, họ và tên) thực hiện đề tài (ký, họ và tên) 7. Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu đề tài: STT Họ và Tên Lớp Mã số sinh viên 1 Huỳnh Thị Kim Trang D13MT02 1324403010107 2 Nguyễn Trường Nam D13MT02 1324403010152 3 Vũ Thị Linh D13MT02 1324403010149 4 Lê Thị Ánh Trúc D13MT02 1324403010111 5 Lê Văn Tài D13MT02 1324403010168 MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU...........................................................................................................1 1.1. Tổng quan vể tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài........................................1 1.1.1. Các nghiên cứu ngoài nước..............................................................................1 1.1.2. Các nghiên cứu trong nước...............................................................................1 1.2. Lí do lựa chọn đề tài................................................................................................3 1.3. Mục tiêu đề tài.........................................................................................................4 1.4. Vật liệu....................................................................................................................4 1.5. Phương pháp nghiên cứu.........................................................................................5 1.5.1. Phương pháp xác định hoạt độ protease...........................................................5 1.5.2. Phương pháp nuôi cấy bán rắn thu nhận chế phẩm có hoạt tính protease.........5 1.5.3. Phương pháp thủy phân trùn quế......................................................................5 1.5.4. Phương pháp xác định đạm tổng......................................................................5 1.6. Đối tượng................................................................................................................. 7 1.7. Phạm vi nghiên cứu.................................................................................................8 1.8. Cơ sở lý thuyết.........................................................................................................8 1.8.1. Giới thiệu về trùn quế.......................................................................................8 1.8.2. Giới thiệu về enzyme protease........................................................................10 PHẦN 2: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................................15 2.1. Hoạt độ chế phẩm protease nuôi cấy.....................................................................15 2.2. Ảnh hưởng của hoạt độ protease đến khả năng thủy phân trùn quế.......................15 2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân trùn quế....................................17 2.4. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân trùn quế...................................18 PHẦN 3: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ............................................................................21 3.1. Kết luận.................................................................................................................21 3.2. Kiến nghị...............................................................................................................21 TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................22 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Hàm lượng amino acid trong bột trùn quế chưa thủy phân và bột trùn quế tự phân………………………………………………………………….....9 Bảng 2: Hoạt độ trung bình của chế phẩm protease thô…………………………………15 Bảng 3: Ảnh hưởng của hàm lượng protease đến khả năng thủy phân trùn quế……………….................................................................................….16 Bảng 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân trùn quế…………………………………………………………………..……17 Bảng 5: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân trùn quế……………………………………………………………...………...18 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Biểu đồ ảnh hưởng của hàm lượng protease đến khả năng thủy phân trùn quế………………………………………………………………………..16 Hình 2: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân trùn quế…………………………………………………………………..……17 Hình 3: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân trùn quế………………………………………………………………………..19 PHỤ LỤC Bảng 1. Ảnh hưởng của hàm lượng protease đến khả năng thủy phân trùn quế Hoạt độ protease (UI/100ml dịch trùn) Thể tích L thử không Thể tích thử thật Hàm lượng đạm (Vt) (g/lít) (Vk) 0 UI 4 9,90 9,85 2.5 UI 4 9,90 9,85 5 UI 4 9,90 9,85 7,5 UI 4 9,90 9,85 10 UI 4 9,90 9,85 7,40 7,30 7,20 7,20 7,10 7,10 7,10 7,20 7,00 7,00 6,90 7,00 7,10 7,20 7,00 7,35 7,30 7,40 7,00 7,20 7,20 7,00 7,30 6,90 7,20 6,90 7,00 7,00 7,00 6,90 14,00 14,42 14,42 15,54 15,26 15,26 15,82 14,70 16,38 15,54 16,66 16,10 15,82 15,54 16,38 Bảng 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân trùn quế Nhiệt độ (oC) Thể tích L thử không Thể tích thử thật Hàm lượng đạm (Vt) (g/lít) (Vk) 30 4 9,30 9,40 35 4 9,30 9,40 40 4 9,30 9,40 45 4 9,30 9,40 50 4 9,30 9,40 55 4 9,30 9,40 7,50 7,35 7,40 7,10 7,20 7,20 7,10 7,20 7,40 7,30 7,50 7,10 7,30 7,30 7,10 7,10 13,30 14,20 13,30 15,80 14,70 14,70 15,80 15,40 7,20 7,40 7,30 7,30 7,50 7,50 7,50 7,50 7,45 7,50 7,15 7,30 7,30 7,40 7,40 7,40 7,50 7,60 7,50 7,50 15,20 14,00 14,40 14,00 13,30 13,30 13,00 12,60 13,10 13,00 Bảng 3. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân trùn quế Thời gian thủy phân Thể tích L thử không (giờ) Thể tích thử thật Hàm lượng đạm (Vt) (g/lít) (Vk) 2 4 10,50 10,60 4 4 10,50 10,60 6 4 10,50 10,60 8 4 10,50 10,60 10 4 10,50 10,60 7,90 8,40 8,30 8,00 8,30 8,00 8,00 7,90 7,90 7,80 7,70 7,80 7,80 7,70 7,70 8,10 8,20 8,25 8,20 8,00 8,15 8,10 7,90 8,05 7,90 7,80 7,75 7,60 7,80 7,75 14,28 12,60 12,74 13,72 13,44 13,86 14,00 14,84 14,42 15,12 15,68 15,54 15,96 15,68 15,82 PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1. Tổng quan vể tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài Vai trò của trùn quế đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như ngành chăn nuôi, trồng trọt, nuôi cấy vi sinh vật, y học… 1.1.1. Các nghiên cứu ngoài nước Bột trùn quế đã được nhiều nhà khoa học bổ sung vào khẩu phần của gia cầm như là một nguồn protein chính. Kết quả cho tăng trưởng tương đương hoặc tốt hơn khi khi cho gia cầm ăn thức ăn truyền thống giàu protein[17,19,20,21]. Harwood (1976), Mekada và cộng sự (1979) cho rằng, gà được cho ăn trùn quế đã cải thiện mức tiêu tốn thức ăn tốt hơn đối chứng, nghĩa là gà ở lô thí nghiệm có cùng tăng trọng với lô đối chứng nhưng lại tiêu thụ ít thức ăn hơn[17,21]. Mekada và cộng sự (1979) dùng 5% bột trùn quế trong khẩu phần ăn của gà và không có sự tăng trọng rõ rệt nhưng có xu hướng giảm tiêu hao thức ăn. Họ cũng thành công trên những thí nghiệm với gà đẻ trong khẩu phần ăn có bổ sung trùn tươi[19]. Một số thí nghiệm ở India (Kale và cộng sự, 1982) và Philippines (Guerro, 1983) cho rằng trùn quế Perionyx excavatus sử dụng tốt phân gia súc, tạo ra nguồn nguyên liệu protein bổ sung vào thức ăn cho gia súc[16,18]. 1.1.2. Các nghiên cứu trong nước Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy, bổ sung trùn quế tươi vào khẩu phần thức ăn của gà cho tác dụng tốt đến sự sinh trưởng, phát triển, khả năng thu nhận và hấp thu chất dinh dưỡng từ thức ăn, tăng tỷ lệ nuôi sống. Từ đó, giúp tăng trọng nhanh, cải thiện hệ số chuyển hóa thức ăn. Nguyễn Xuân Trúc (2008), bổ sung 5% trùn quế tươi vào khẩu phần thức ăn của gà Lương Phượng; Hoàng Thị Mai và cộng sự (2014), bổ sung 3% trùn quế vào khẩu phần thức ăn của giống gà ri lai thì trọng lượng tăng và hệ số tiêu tốn thức ăn giảm ở lô thí nghiệm so với lô đối chứng[5,11]. 1 Đồng thời, trùn quế đã được nghiên cứu và sản xuất thành các chế phẩm sinh học phục vụ cho công nghiệp, nuôi cấy vi sinh vật, là loại thức ăn giàu đạm để bổ sung thêm khẩu phần dinh dưỡng cho các loại tôm cá vừa qua giai đoạn ấu trùng hoặc khôi phục sức khỏe vật nuôi sau bệnh… Năm 2008, Phan Thị Bích Trâm và cộng sự đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất đạm amine của quá trình tự phân giải trùn quế (Perioyx excavatus). Kết quả thí nghiệm cho thấy, điều kiện tối ưu cho hệ protease trùn quế tự thủy phân ở nhiệt độ 55 oC và hoạt động tốt trong môi trường nước và pH 10. Hiệu suất thủy phân đạt cao nhất 46,2% tương ứng với hàm lượng protein trong dung dịch thủy phân đạt 9%, hoạt tính đặc hiệu của enzym ban đầu là 0,097 UI/mg protein và thời gian thủy phân là 24 giờ [8]. Theo Võ Thị Hạnh và cộng sự (2009), đã nghiên cứu và ứng dụng thành công các sản phẩm chiết xuất từ trùn quế và các loại vi sinh vật hữu ích vào trong nông nghiệp như chăn nuôi, trồng trọt. Kết quả ghi nhận rằng các chế phẩm sử dụng trong chăn nuôi có tác dụng kích thích sự thèm ăn, tăng trọng nhanh, giảm tiêu hao thức ăn, giảm tỷ lệ chết cũng như giảm chi phí sản xuất. Các chế phẩm dùng trong trồng trọt dưới dạng phân bón qua lá hoặc bổ sung qua đất có tác dụng cạnh tranh và đối kháng với vi sinh vật gây bệnh có trong đất, phân giải chất hữu cơ, cố định đạm và hòa tan lân. Khi sử dụng các chế phẩm này về lâu dài sẽ giúp đất sạch bệnh và cải thiện độ màu mỡ của đất[3]. Năm 2009, Nguyễn Thị Xuân Thanh đã sử dụng đạm thủy phân trùn quế để nuôi vi sinh vật, kết quả cho thấy có thể thay thế đạm pepton hoàn toàn bằng đạm thủy phân từ trùn quế dùng nuôi cây nấm men Saccharomyces cerevisiae, sự tăng trưởng của nấm tốt hơn khi nuôi cấy bằng đạm pepton Hà Lan. Đồng thời, giá thành khi nuôi bằng đạm trùn quế thấp hơn ½ lần so với đạm pepton Hà Lan[6]. Những nghiên cứu của Phạm Thị Quỳnh Trâm và cộng sự (2008), Phan Thị Bích Trâm và cộng sự (2010) cho thấy, khi bổ sung bột đạm thủy phân vào thức ăn của ấu trùng tôm sú cho kết quả rất khả quan, kết quả tăng trưởng chiều dài tốt hơn bột đạm trùn quế chưa thủy phân, tỷ lệ nuôi sống cao hơn và giá thành của sản phẩm giảm[9,10]. 2 Ngoài ra, các sản phẩm từ quá trình thủy phân trùn quế còn được sử dụng trong y dược học, phòng và chữa tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim, chứng tắc nghẽn mạch máu… Năm 2009, các nhà khoa học thuộc Viện Sinh học nhiệt đới đã chứng minh rằng enzyme fibrinolytic trong trùn quế có khả năng thủy phân mạnh mẽ, làm đứt các sợi fibrin gây tắc thành mạch máu gồ ghề, xơ vữa của bệnh nhân tim mạch hoặc mỡ máu. Phan Thị Bích Trâm và cộng sự (2007) nghiên cứu một số serine protease có khả năng thủy phân fibrin từ trùn quế. Từ đó, có thể ứng dụng vào trong điều trị các bệnh liên quan đến tim mạch như tắc nghẽn mạch máu do fibrin bị đóng cục[7,14]. 1.2. Lí do lựa chọn đề tài Nhiều nghiên cứu cho thấy hiếm có loài động vật nào có giá trị hấp dẫn như trùn quế (Perionyx excavatus). Trùn quế có tỉ trọng nước chiếm khoảng 80 – 85%, chất khô khoảng 15 – 20% trọng lượng cơ thể. Hàm lượng các chất tính trên trọng lượng chất khô cao nhất là protein (68 –70%), kế tiếp là đường (12 – 14%), lipid (7 – 8%) và tro (11 – 12%). Do có hàm lượng protein cao, giàu vitamin, các acid amin và acid béo thiết yếu nên trùn quế được xem là nguồn dinh dưỡng bổ sung quý giá cho các loại gia súc, gia cầm, thủy hải sản giúp các loại vật nuôi tăng trưởng nhanh, kháng bệnh, tăng năng suất… Trùn quế được sử dụng trực tiếp hoặc phối trộn để làm thức ăn cao cấp nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản. Phân trùn quế là loại phân hữu cơ sinh học, có hàm lượng dinh dưỡng cao, thích hợp cho nhiều loại cây trồng và là nguồn phân thích hợp cho việc sản xuất rau sạch, dịch trùn quế còn được sử dụng rất phổ biến trong trồng trọt như một loại phân bón lá giúp cây trồng phát triển tốt hơn. Bên cạnh đó, trùn quế còn được làm nguyên liệu trong y dược để sản xuất ra các loại thuốc hoặc sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm phục vụ đời sống con người. Ngoài ra, trùn quế còn phân hủy rác hữu cơ, bảo vệ môi trường [1,19]. Hơn nữa, hiện nay nông dân ở nhiều nơi xây dựng mô hình chăn nuôi sạch, khép kín từ nuôi bò lấy phân nuôi trùn quế làm thức ăn cho tôm, kết hợp trồng vườn, vừa cung cấp thức ăn cho gia cầm, thủy sản, vừa bảo vệ được môi trường do tận dụng lượng chất thải trong chăn nuôi[23]. 3 Trùn quế thuộc nhóm trùn ăn phân, thường sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy. Nhiều nghiên cứu cho thấy trùn quế phát triển rất tốt trên phân bò [22]. Do đó, hiện nay các mô hình nuôi trùn phát triển mạnh xung quanh các trại bò sữa. Điển hình có thể kể đến các địa phương có diện tích nuôi trùn quế lớn như Hà Nội, Khánh Hòa, Trà Vinh, TP. Hồ Chí Minh… Tuy nhiên việc sử dụng trùn quế tươi gây nhiều khó khăn trong việc bảo quản, quá trình sử dụng và thương mại hóa. Vì vậy, để tiện cho việc bảo quản, dễ dàng sử dụng và giúp thương mại hóa trùn quế, người ta đã thủy phân trùn quế thành dịch. Dịch trùn quế có ưu điểm là dễ dàng sử dụng khi phun lên thức ăn vật nuôi, hòa vào nước làm thức ăn cho thủy sản hay phun lên cây trồng. Tuy nhiên, việc sản xuất dịch trùn hiện nay gặp khó khăn do thời gian thủy phân trùn quế quá dài và trùn quế chưa được thủy phân hoàn toàn, không thu được hết lượng đạm có trong trùn quế. Chính vì những thực tế trên chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế (Perionyx excavatus)”. 1.3. Mục tiêu đề tài Thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế qua quá trình thủy phân. Xác định ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế. 1.4. Vật liệu[2,4] Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong đề tài do phòng thực hành thí nghiệm Sinh Học thuộc Khoa Tài nguyên Môi trường, trường Đại học Thủ Dầu Một cung cấp. Đối tượng thử nghiệm là trùn quế đông lạnh được mua từ cơ sở Trùn Quế Củ Chi huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh. Môi trường giữ giống: Glucose 50 g; Pepton 10 g; Cao thịt 3 g; Agar 20 g; Nước cất vừa đủ 1 lít. Môi trường tăng sinh: Glucose 35 g; Pepton 10 g; Nước giá 10% vừa đủ 1 lít. 4 Môi trường bán rắn thu nhận protease: ZnSO 4 0,0014 g; KH2PO4 0,4 g; DAP 0,8 g; NaCl 1,44 g; CaCO3 2,4 g; MgSO4 0,2 g; Bắp 200 g; Đậu nành 200g; Nước 60% (w/w). 1.5. Phương pháp nghiên cứu 1.5.1. Phương pháp xác định hoạt độ protease[4] Hoạt tính protease được xác định theo phương pháp Anson cải tiến: cho 1 ml dung dịch enzyme vào 2,5 ml dung dịch Casein 1% trong đệm Phosphate pH 7,6. Ủ ở 35 oC trong 20 phút. Mẫu đối chứng được làm ngừng phản ứng bằng 5 ml dung dịch TCA 5%. Xác định hàm lượng Tyrosine trong dịch bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm với thuốc thử Folin. Một đơn vị hoạt tính (UI) là lượng enzyme protease tối thiểu thủy phân Casein trong thời gian 1 phút tạo thành µmol Tyrosine. 1.5.2. Phương pháp nuôi cấy bán rắn thu nhận chế phẩm có hoạt tính protease[4] Chủng Bacillus subtilis được tăng sinh trên môi trường tăng sinh trong 48 giờ. Cấy dịch tăng sinh vào môi trường bán rắn sao cho mật độ giống khoảng 1x10 7 CFU/g canh trường, trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian thích hợp, thu nhận canh trường bán rắn, sấy thông gió ở nhiệt độ 45 – 50 oC. Khi canh trường khô, xay nhuyễn và bảo quản canh trường ở dạng bột mịn. 1.5.3. Phương pháp thủy phân trùn quế[9] Trùn quế được bổ sung nước theo tỉ lệ 2 : 1. Sau đó, cho vào các erlen và tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 55oC. Sau các khoảng thời gian xác định, chúng tôi tiến hành lọc, li tâm, thu dịch thủy phân và sử dụng phương pháp Kjeldahl để xác định hàm lượng đạm tổng số có trong dịch thủy phân. 1.5.4. Phương pháp xác định đạm tổng[9] 1.5.4.1. Nguyên tắc Chất đạm khi đem vô cơ hóa sẽ chuyển thành dạng ammonium sulphate, khi cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac[11]. (NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2H2O + 2NH3 5 Lượng ammoniac phóng thích sẽ được hơi nước lôi cuốn bằng một dụng cụ gọi là máy Parnas – Warger và được dẫn tới một bình tam giác có chứa một lượng thừa H 2SO4. Từ nay, cho phép chúng ta xác định được lượng ammoniac phóng ra, có nghĩa là định lượng được đạm trong mẫu nguyên liệu. 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 1.5.4.2. Hóa chất H2SO4 đậm đặc (d = 1,84); chất xúc tác: hỗn hợp K 2SO4: CuSO4 n = 9:1, xay nhuyễn; Dung dịch NaOH N/100; Dung dịch H2SO4 N/100; Dung dịch (COOH)2 N/100, Dung dịch (COOH)2 N/100, NaOH đậm đặc: cân 40 g NaOH trong nước cất thành 100 ml. Thuốc thử đỏ Methyl 0,5% trong cồn. Thuốc thử Phenolphtalein 1% trong cồn. 1.5.4.3. Cách tiến hành Vô cơ hóa Lấy 6 bình Kjeldahl, thực hiện 3 mẫu thử thật và 3 mẫu thử không. Hút chính xác vào 3 bình thử thật, mỗi bình 1 ml nguyên liệu lỏng (hoặc 0,1 g nguyên liệu khô nghiền nát), 3 bình thử thật, mỗi bình 1 ml nước cất. Tiếp theo, cho vào 6 bình Kjeldahl mỗi bình 5 ml H2SO4 đậm đặc và khoảng 0,5g chất xúc tác. Đề vào tủ hút chất độc cho đến khi dung dịch bằng bên trong bình Kjeldahl trong suốt (khoảng 2 – 3 giờ). Để nguội. Lấy 6 bình Kjeldahl ra, mỗi bình được pha loãng với nước cất thành 100 ml bình định mức. Chưng cất đạm Đốt bình cầu cho đến khi sôi, rửa máy cất đạm, chúng ta tiến hành cất đạm bằng cách sau: Đặt bình hứng có chứa 25 ml dung dịch H 2SO4 N/100 và vài giọt methyl đỏ, rồi đặt vào vòi ống sinh hàn, sao cho đầu nhọn ống sinh hàn chìm trong dung dịch. Hút 10 ml đạm vô cơ hóa đã pha loãng trên cho vào phễu của máy cất đạm, mở khóa cho vào bình phản ứng từ từ cho đến khi hết, tráng phễu 3 lần, mỗi lần một ít nước cất, rồi cũng cho xuống bình phản ứng, cho 10 ml dung dịch NaOH đậm đặc và cũng cho xuống bình từ 6 từ, tráng một ít nước cất (mỗi lần cần chừa lại một ít để hệ thống kín). Để máy lôi cuốn trong vòng 3 phút rồi hạ bình hứng xuống, để thêm 2 phút nữa. Rửa vòi bằng 1 tia nước cất (nước rửa cho vào bình tam giác). Rồi lấy bình tam giác ra, định phân với dung dịch NaOH chuẩn độ đúng là x.N/100 cho đến khi có màu vàng cam. Thực hiện 3 mẫu thử thật, 3 mẫu thử không để lấy trị số trung bình. Phải xác định hệ số hiệu chỉnh x của dung dịch NaOH N/100 bằng dung dịch (COOH)2 N/100. 1.5.4.4. Cách tính kết quả Tính lượng nitơ tổng số có trong 1 lít nguyên liệu. Gọi V 0 là thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử không). Gọi V 1 là thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử thật). Vậy ∆ V =V 0−V 1 là lượng NaOH tương đương với lượng ammoniac phóng thích bởi 10ml dung dịch vô cơ pha loãng. 1 mol ammoniac tương đương với 1 mol NaOH. Do đó, số mol ammoniac phóng thích bởi 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng là: ( ∆ V . x .( 1 −5 ) ¿/1000=∆ V . x .10 mol 100 Số g đạm tổng số có trong 10 ml dịch vô cơ đã pha loãng là: 14 . ∆ V . x . 10−5 g Số gam đạm tổng có trong 100 ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng hay trong 1 ml nguyên liệu: (14 . ∆ V . x . 10−4 . 1000)/1 = 1,4 . ∆ V . x (g/lít) 7