Tài liệu Nghi n cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của lá cây cà na (elaeocarpus hygrophilus kurz) (2)

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- TRÌ KIM NGỌC NGHI N CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ CÂY CÀ NA (Elaeocarpus hygrophilus Kurz) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- TRÌ KIM NGỌC NGHI N CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ CÂY CÀ NA (Elaeocarpus hygrophilus Kurz) Ngành: Dƣợc liệu - Dƣợc học cổ truyền Mã số: 8720206 Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. VÕ VĂN LẸO Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 . . LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc đến Thầy TS. Võ Văn Lẹo, người đã chỉ ra hướng nghiên cứu, chỉ bảo tận tình, động viên, quan tâm và lo lắng cho em trong quá trình thực hiện luận văn. Em xin cám ơn Thầy PGS.TS. Trần Hùng đã quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho em cũng như các bạn thực hiện luận văn tốt nghiệp. Em xin cám ơn Thầy TS. Nguyễn Viết Kình và Cô PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương đã dành thời gian để đọc phản biện luận văn này và giúp luận văn của em được hoàn thiện hơn, đồng thời Thầy cũng đã giảng dạy cho chúng em nhiều điều cần biết khi nghiên cứu khoa học. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Bộ môn Dược liệu trường Đại học y dược TP. Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho chúng em những kiến thức chuyên môn thật sâu sắc. Cảm ơn các anh chị giảng viên, nghiên cứu viên, cũng như của các cô, các chị kỹ thuật viên ở Bộ môn Dược liệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho chúng em được hoàn thành quyển luận văn này. Xin được gửi lời cảm ơn các anh, chị, các bạn lớp cao học Dược liệu 2016 – 2018 đã sát cánh bên nhau cùng nổ lực vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình học tập và đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Lời cảm ơn cuối cùng em xin dành cho gia đình, là những người đã luôn quan tâm, chăm sóc và tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành tốt đề tài. Trì Kim Ngọc . . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Trì Kim Ngọc . . v TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dƣợc học – Năm học 2016-2018 NGHI N CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY CÀ NA (Elaeocarpus hygrophilus Kurz) Trì Kim Ngọc Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Võ Văn Lẹo Mở đầu Cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz, Elaeocarpaceae) mọc hoang rất nhiều ở các tỉnh miền Tây. Các công trình nghiên cứu trên thế giới về loài cây này gần nhƣ chỉ dừng lại ở quả, rất ít công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá và các bộ phận khác của cây Cà na. Do đó luận văn này đƣợc thực hiện với các mục tiêu phân lập các hợp chất từ cây Cà na theo định hƣớng tác dụng chống oxy hóa trên mô hình DPPH. Đối tƣợng: Lá Cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz), 14 kg lá khô. Phƣơng pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn cao chiết và các chất phân lập đƣợc bằng mô hình DPPH. Sử dụng các phƣơng pháp chiết phân bố lỏng - lỏng, sắc ký cột chân không, sắc ký cột cổ điển và các phƣơng pháp tinh chế khác để phân lập các chất tinh khiết từ các phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh. Xác định cấu trúc dựa vào dữ liệu phổ UV, phổ khối và phổ NMR. Kết quả và bàn luận Kết quả thử nghiệm DPPH cho thấy khả năng chống oxy hóa của các cao giảm dần: Cao ethyl acetat (84,62 %) > cao nƣớc (66,4 %) > cao cloroform (25,81 %) > cao n-hexan (2,74 %). Do đó cao ethyl acetat đƣợc tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học. Phân lập đƣợc 6 chất: acid 3-Omethyl ellagic 4’-O-α-rhamnopyranosid (564,00 mg), 3-O-methyl myricetin (8,00 mg), quercetin (12,00 mg), myricetin (430,00 mg), acid gallic (67,00 mg) và myricitrin (79,65 mg). IC50 các chất phân lập đƣợc giảm dần theo thứ tự: quercetin (IC50 = 4,7 µmol/l) > myricetrin (IC50 = 9,1 µmol/l) > acid gallic (IC50 = 9,4 µmol/l) > myricetin (IC50 = 10,7 µmol/l) > acid ascorbic (IC50 = 13,1µmol/l) > 3-O-methyl myricetin (IC50 = 13,6 µmol/l). Kết luận: từ cao ethyl acetat đã thu đƣợc 6 chất tinh khiết: Khối lƣợng các chất thu đƣợc tƣơng đối nhiều, có thể hƣớng tới việc xây dựng chất chu n d ng trong kiểm nghiệm dƣợc liệu, chế ph m ho c sử dụng trong các nghiên cứu về tác dụng sinh học. . . vi Thesis of master of pharmacy, course: 2016-2018 Major: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION FOR THE ANTIOXIDANT CONSTITUENTS OF ELAEOCARPUS HYGROPHILUS KURZ Tri Kim Ngoc Supervisor: Dr. Vo Van Leo Introduction Elaeocarpus hygrophilus Kurz is a wild grow in the western provinces. Until now there have been few studies on the chemical composition and bio-activity of leaves and other parts of the plant. As a result, in this thesis our aim is to carry out a bio-guided isolation for the antioxidant components on DPPH of Elaeocarpus hygrophilus leaves. Materials: Elaeocarpus hygrophilus leaves (14 kg of dry leaves). Methods In vitro screening of fractions, isolating compounds for the antioxidant activity on DPPH assay. Distribution of liquid-liquid extraction, vacuum liquid chromatography, silica gel column chromatography, and recrystallization of crystals in suitable solvents. Structure elucidations were based on NMR and MS methods. Results and discussions DPPH assay showed that the antioxidant activity of extracts was as follows: ethyl acetat extract (84.62 %) > water extract (66.4 %) > chloroform extract (25.81 %) > n-hexan extract (2.74 %). Therefore, ethyl acetat extract was chosen for isolations later. 6 substances were obtained: 3-Omethylellagic acid 4’-O-α-rhamnopyranosid (564 mg), 3-O-methyl myricetin (8 mg), quercetin (12 mg), myricetin (430 mg), acid gallic (67 mg) and myricitrin (79.65 mg). IC50 values of substances isolated and extracts comparing with vitamin C were as follows: quercetin (IC50 = 4.7 µmol/l) > myricitrin (IC50 = 9.1 µmol/l) > acid gallic (IC50 = 9.4 µmol/l) > myricetin (IC50 = 10.7 µmol/l) > vitamin C (IC50 = 13.1 µmol/l) > 3-O-methyl myricetin (IC50 = 13.6 µmol/l). Conclusions: 6 substances were obtained from EtOAc extract of Elaeocarpus leaves. They can be standardized for conference standards using in biotests, in quality control of Elaeocarpus leaves or preparations related. . . vii MỤC LỤC TÓM TẮT LUẬN VĂN ..................................................................................................... v MỤC LỤC ........................................................................................................................vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ................................................................ ix DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................ xi DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ .........................................................................xii MỞ ĐẦU........................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC ............................................................................ 3 1.1.1. Vị trí phân loại ............................................................................................................. 3 1.1.2. Đ c điểm của chi Elaeocarpus ................................................................................... .3 1.1.3. Đ c điểm của cây Cà na Elaeocarpus hygrophilus ..................................................... 3 1.2. TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ............................................................ 8 1.3. TÁC DỤNG DƢỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG CỦA CÂY CÀ NA ............................... 11 1.3.1. Tác dụng dƣợc lý ....................................................................................................... 11 1.3.2. Công dụng trong y học cổ truyền............................................................................... 12 1.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA ............. 12 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 17 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 17 2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................................ 17 2.1.2. Dung môi và hóa chất ................................................................................................ 17 2.1.3. Dụng cụ, trang thiết bị ............................................................................................... 17 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 18 2.2.1. Nghiên cứu thực vật học ............................................................................................ 18 2.2.2. Thử tinh khiết............................................................................................................. 19 2.2.3. Xác định hàm lƣợng chất chiết đƣợc trong dƣợc liệu................................................ 19 2.2.4. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ................................................................... 20 2.2.5. Chiết xuất cao toàn phần ............................................................................................ 20 2.2.6. Tách các phân đoạn bằng chiết phân bố lỏng – lỏng ................................................. 20 2.2.7. Phƣơng pháp sàng lọc tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in vitro ....................... 21 2.2.8. Phân lập và tinh chế các chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa .............................. 23 . . viii 2.2.9. Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập đƣợc. ......................................................... 24 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................... 26 3.1. NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC ............................................................................... 26 3.1.1. Đ c điểm hình thái ..................................................................................................... 26 3.1.2. Đ c điểm vi phẫu ....................................................................................................... 27 3.1.3. Soi bột lá Cà na (40X) ............................................................................................... 31 3.2. THỬ TINH KHIẾT ...................................................................................................... 32 3.2.1. Xác định độ m .......................................................................................................... 32 3.2.2. Xác định độ tro .......................................................................................................... 32 3.3. HÀM LƢỢNG CHẤT CHIẾT ĐƢỢC TRONG LÁ CÀ NA ...................................... 32 3.4. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC .......................................................................................... 33 3.4.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ................................................................... 33 3.4.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa các cao phân đoạn ..................................................... 34 3.4.3. Chiết xuất, tách phân đoạn từ cao toàn phần ............................................................. 36 3.4.4. Kiểm tra khả năng chống oxy hóa của các cao chiết phân đoạn ............................... 38 3.4.5. Phân lập chất từ cao EA ............................................................................................. 40 3.4.6. Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập đƣợc bằng SKLM...................................... 46 3.4.7. Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập đƣợc bằng UPLC ...................................... 50 3.4.8. Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập đƣợc .......................................................... 54 3.4.9. Tóm tắt kết quả của quá trình chiết xuất và phân lập ................................................ 80 3.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TRÊN CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC .................................................................................................... 80 3.5.1. Định tính bằng SKLM ............................................................................................... 80 3.5.2. Thử HTCO trên các chất phân lập bằng phƣơng pháp DPPH ................................... 81 Chƣơng 4 - BÀN LUẬN................................................................................................... 90 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................................... 93 KẾT LUẬN.......................................................................................................................... 93 ĐỀ NGHỊ ............................................................................................................................. 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 95 PHỤ LỤC .................................................................................................................... PL-1 . . ix DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ nguyên Chữ tắt Ý nghĩa 13 13 Cộng hƣởng từ hạt nhân C13 1 1 Cộng hƣởng từ hạt nhân proton C-NMR H-NMR C-Nuclear Magnetic Resonance H-Nuclear Magnetic Resonance br broad Đỉnh rộng d doublet Đỉnh đôi DĐVN Dƣợc điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO dimethyl sulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EA Ethyl acetate FRAP Ferric reducing antioxidant power HMBC HSQC Thử nghiệm đánh giá khả năng khử ion sắt III Hetherronuclear Multiple Bond Correlation Hetherronuclear Single Quantum Correlation HTCO Hoạt tính chống oxy hóa IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% IR Infrared Specroscopy Phổ hồng ngoại J Coupling constant Hằng số ghép m multiplet Nhiều đỉnh MDA Malonyl dialdehyde MeOH Methanol . . x Chữ nguyên Chữ tắt Ý nghĩa MHz Mega Hertz MS Mass Spectroscopy Phổ khối NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân ppm parts per million Phần triệu PDA Photodiode Array Dãy diod quang ROS Rective oxygen species s singlet SKC Sắc ký cột SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng t triplet TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet and Visible Tử ngoại khả kiến VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký (cột) chân không VS Vanillin-sulfuric acid Đỉnh đơn Đỉnh ba . Thuốc thử vanillin 1% trong cồn và acid sulfuric 5% trong cồn . xi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số loài của chi Elaeocarpus thường gặp ở Việt Nam [43]. ................................................... 5 Bảng 1.2. Một số hợp chất phân lập từ cây Cà na ........................................................................................ 9 Bảng 2.3. Cách pha mẫu đo của thử nghiệm DPPH .................................................................................. 22 Bảng 3.4. Kết quả thử tinh khiết của bột lá Cà na ....................................................................................... 32 Bảng 3.5. Hàm lượng chất chiết được của dược liệu lá Cà na (%) ........................................................... 32 Bảng 3.6. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ..................................................................... 33 Bảng 3.7. Kết quả thử HTCO bằng thử nghiệm DPPH trên các mẫu cao khảo sát ................................. 35 Bảng 3.8. Kết quả chiết phân bố cao cồn..................................................................................................... 37 Bảng 3.9. Kết quả thử nghiệm HTCO bằng thử nghiệm DPPH trên các mẫu cao thu được .................. 39 Bảng 3.10. Các phân đoạn của cao EA thu được qua VLC ....................................................................... 41 Bảng 3.11. Hệ dung môi kiểm tra độ tinh khiết EH-1, EH-2, EH-3, EH-4, EH-5, EH-6............................. 47 Bảng 3.12. Kết quả phân tích UPLC của EH-1, EH-2, EH-3, EH-4, EH-5, EH-6 ...................................... 50 13 1 Bảng 3.13. So sánh dữ liệu phổ C NMR, H NMR của EH-1 và 3-O-methylellagic acid 4’-O-αrhamnopyranosid............................................................................................................................................ 57 Bảng 3.14. Dữ liệu phổ NMR của EH-2 (đo trong DMSO-d6)..................................................................... 61 Bảng 3.15. So sánh dữ liệu phổ NMR của EH-3 và quercetin (đo trong DMSO-d6). ............................... 64 13 1 13 1 13 1 Bảng 3.16. So sánh dữ liệu phổ C NMR, H NMR của EH-4 và myricetin (đo trong DMSO-d6). ....... 69 Bảng 3.17. So sánh dữ liệu phổ C NMR, H NMR của EH-5 với acid gallic (đo trong DMSO-d6). ....... 73 Bảng 3.18. So sánh dữ liệu phổ C NMR, H NMR của EH-6 và myricitrin (đo trong DMSO-d6). ....... 77 Hình 3.57. SKĐ của các chất được phân lập với TT DPPH ....................................................................... 80 Bảng 3.19. Kết quả thử nghiệm HTCO bằng thử nghiệm DPPH trên các chất phân lập ....................... 81 Bảng 3.20. Kết quả thử HTCO trên cao EA với dãy 5 nồng độ.................................................................. 82 Bảng 3.21. Kết quả thử HTCO trên acid ascorbic với dãy 6 nồng độ ........................................................ 83 Bảng 3.22. Kết quả thử HTCO trên EH-2 với dãy 5 nồng độ ..................................................................... 84 Bảng 3.23. Kết quả thử HTCO trên EH-3 với dãy 5 nồng độ ..................................................................... 85 Bảng 3.24. Kết quả thử HTCO trên EH-4 với dãy 5 nồng độ ..................................................................... 86 Bảng 3.25. Kết quả thử HTCO trên EH-5 với dãy 5 nồng độ ..................................................................... 87 Bảng 3.26. Kết quả thử HTCO trên EH-6 với dãy 5 nồng độ ..................................................................... 88 Bảng 3.27. Phương trình hồi quy và IC50 của cao EA, acid ascorbic và các chất phân lập.......................................................................................................................................................... 89 . . xii DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Vị trí phân loại của Elaeocarpus hygrophilus Kurz ........................................................................ 3 Hình 1.2. Toàn cây và lá Cà na ....................................................................................................................... 7 Hình 1.3. Hoa và quả Cà na ............................................................................................................................ 8 Hình 1.4. Phản ứng trung hòa gốc DPPH .................................................................................................... 16 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ nghiên cứu chung............................................................................................................. 18 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ chiết xuất cao cồn toàn phần lá Cà na ........................................................................... 20 Hình 3.5. Toàn cây, lá, rễ Cà na ................................................................................................................... 26 Hình 3.6. Hoa, quả Cà na .............................................................................................................................. 27 Hình 3.7. Biểu bì trên có lỗ khí kiểu hỗn bào (a), biểu bì dưới (b) của lá Cà na ....................................... 27 Hình 3.8. Hình vi phẫu chi tiết lá Cà na (Folium Elaeocarpi hygrophili) ..................................................... 28 Hình 3.9. Hình vi phẫu chi tiết thân Cà na (Caulis Elaeocarpi hygrophili).................................................. 29 Hình 3.10. Hình vi phẫu chi tiết rễ Cà na (Radix Elaeocarpi hygrophili) .................................................... 30 Hình 3.11. Bột lá Cà na .................................................................................................................................. 31 Hình 3.12. Các cấu tử trong bột lá Cà na ..................................................................................................... 31 Hình 3.13. Sắc ký đồ các cao phân đoạn khảo sát với TT DPPH.............................................................. 34 Hình 3.14. Biểu đồ kết quả thử HTCO của các phân đoạn cao khảo sát.................................................. 35 Sơ đồ 3.3. Sơ đồ chiết xuất, tách phân đoạn............................................................................................... 36 Sơ đồ 3.4. Sơ đồ chiết phân bố lỏng – lỏng với cao cồn Cà na ................................................................. 37 Hình 3.15. Sắc ký đồ các cao phân đoạn thu được .................................................................................... 38 Hình 3.16. Sắc ký đồ các cao phân đoạn thu được với TT DPPH ............................................................ 38 Hình 3.17. Biểu đồ kết quả thử HTCO của các phân đoạn cao thu được................................................. 39 Hình 3.18. SKĐ các phân đoạn của cao EA qua cột VLC .......................................................................... 41 Hình 3.19. Sắc ký đồ các phân đoạn từ cột sephadex LH 20 phân tách tủa T-2...................................... 42 Hình 3.20. Sắc ký đồ các phân đoạn từ cột sephadex LH 20 phân tách tủa T-3...................................... 44 Sơ đồ 3.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ các phân đoạn cột VLC ........................................................ 46 Hình 3.21. SKĐ kiểm tra độ tinh khiết của EH-1 .......................................................................................... 47 Hình 3.22. SKĐ kiểm tra độ tinh khiết của EH-2 .......................................................................................... 48 Hình 2.23. SKĐ kiểm tra độ tinh khiết của EH-3 .......................................................................................... 48 Hình 3.24. SKĐ kiểm tra độ tinh khiết của EH-4 .......................................................................................... 49 Hình.3.25. SKĐ kiểm tra độ tinh khiết của EH-5 .......................................................................................... 49 Hình.3.26. SKĐ kiểm tra độ tinh khiết của EH-6 .......................................................................................... 50 Hình 3.27 SKĐ của UPLC EH-1, EH-2, EH-3, EH-4, EH-5, EH-6.............................................................. 52 - Hình 3.28. Phổ MS (ES ) của EH-1............................................................................................................... 55 Hình 3.29. Phổ UV (MeOH) của EH-1 .......................................................................................................... 55 Hình 3.30. Cấu trúc của EH-1 và các tương tác xa quan sát được trong phổ HMBC.............................. 58 - Hình 3.31. Phổ MS (ES ) của EH-2............................................................................................................... 58 . . xiii Hình 3.32. Phổ UV (MeOH) của EH-2 .......................................................................................................... 59 Hình 3.33. Cấu trúc của EH-2 và các tương tác xa quan sát được trong phổ HMBC .................... 61 - Hình 3.34. Phổ MS (ES ) của EH-3............................................................................................................... 62 Hình 3.35. Phổ UV (MeOH) của EH-3 .......................................................................................................... 62 Hình 3.36. Cấu trúc của EH-3 và các tương tác xa quan sát được trong phổ HMBC.............................. 65 13 Hình 3.37. Phổ C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của EH-3 ......................................................................... 65 1 Hình 3.38. Phổ H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của EH-3 .......................................................................... 66 1 Hình 3.39. Phổ H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của EH-3 (δH 6,1-7,8 ppm).............................................. 66 - Hình 3.40. Phổ MS (MS ) của EH-4 .............................................................................................................. 67 Hình 3.41. Phổ UV (MeOH) của EH-4 .......................................................................................................... 67 Hình 3.42. Cấu trúc của EH-4 ....................................................................................................................... 70 13 Hình 3.43. Phổ C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của EH-4 ......................................................................... 70 1 Hình 3.44. Phổ H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của EH-4 .......................................................................... 71 Hình 3.45. Phổ DEPT (DMSO-d6, 125 MHz) của EH-4 .............................................................................. 71 - Hình 3.46 Phổ MS (MS ) của EH-5 ............................................................................................................... 72 Hình 3.47 Phổ UV (MeOH) của EH-5 ........................................................................................................... 72 Hình 3.48. Cấu trúc EH-5 và các tương tác xa quan sát được trong phổ HMBC ..................................... 73 13 Hình 3.49. Phổ C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của EH-6 ......................................................................... 73 1 Hình 3.50. Phổ H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của EH-5 .......................................................................... 74 - Hình 3.51. Phổ MS (MS ) của EH-6 .............................................................................................................. 74 Hình 3.52. Phổ UV (MeOH) của EH-6 .......................................................................................................... 75 Hình 3.53. Cấu trúc hóa học của EH-6 và các tương tác xa quan sát được trong phổ HMBC ............... 78 13 Hình 3.54. Phổ C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của EH-6 ......................................................................... 78 1 Hình 3.55. Phổ H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của EH-6 (δH 4,0-7,0 ppm) ............................................ 79 1 Hình 3.56. Phổ H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của EH-6 (δH 0,0-3,7 ppm).............................................. 79 Sơ đồ 3.6. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân lập các chất ................................................................................. 80 Hình 3.57. SKĐ của các chất được phân lập với TT DPPH ....................................................................... 80 Hình 3.58. Xây dựng đường chuẩn cao EA ................................................................................................. 82 Hình 3.59. Xây dựng đường chuẩn acid ascorbic ....................................................................................... 83 Hình 3.60. Xây dựng đường chuẩn EH-2 .................................................................................................... 84 Hình 3.61. Xây dựng đường chuẩn EH-3 .................................................................................................... 85 Hình 3.62. Xây dựng đường chuẩn EH-4 .................................................................................................... 86 Hình 3.63. Xây dựng đường chuẩn EH-5 .................................................................................................... 87 Hình 3.64. Xây dựng đường chuẩn EH-6 .................................................................................................... 88 Hình 3.65. Biểu đồ thể hiện IC50 của các chất phân lập so với cao EA và acid ascorbic tính theo µg/ml ......................................................................................................................................................................... 89 Hình 3.66. Biểu đồ thể hiện IC50 của các chất phân lập so với acid ascorbic tính theo µmol/l ............... 89 . . 1 MỞ ĐẦU Trong lĩnh vực sức khỏe hiện nay, ngƣời ta hay nói nhiều đến tác hại của chất oxy hoá, phản ứng oxy hoá và nhấn mạnh sự cần thiết sử dụng chất chống oxy hoá để bảo vệ, duy trì sức khỏe [17]. Gốc tự do luôn luôn đƣợc sinh ra trong cơ thể con ngƣời. Khi có sự tăng quá nhiều gốc tự do sẽ gây ra tình trạng viêm nhiễm ở các cơ quan, các bệnh lý nhƣ tim mạch, thần kinh, đục thuỷ tinh thể, thoái hóa hoàng điểm ở mắt, tăng nguy cơ các bệnh ung thƣ và nhất là sớm xuất hiện hiện tƣợng lão hoá [6, 7, 14]. Để chống lại sự bội tăng các gốc tự do mà hệ thống chất chống oxy hoá nội sinh không đủ sức cân bằng, các nhà khoa học đ t vấn đề d ng các chất chống oxy hóa ngoại sinh với mục đích phòng bệnh, nâng cao sức khỏe và chống lão hóa [16]. Các chất chống oxy hóa ngoại sinh phổ biến đó là beta-caroten, chất khoáng Se, các hợp chất flavonoid, polyphenol...[15, 23]. Các chất này không xa lạ, chúng có từ các nguồn thiên nhiên, là các thực ph m nhƣ rau cải, trái cây tƣơi và một số loại dƣợc thảo [11]. Cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz, Elaeocarpaceae) là loài cây hoang dại, chịu nƣớc, mọc nhiều trên v ng đất phèn, m n… Quả Cà na lâu nay đƣợc d ng làm thực ph m ở một số nƣớc v ng Đông Nam Á. Ở Việt Nam, Cà na mọc hoang nhiều ở các tỉnh miền Tây. Đây là một nguồn nguyên liệu phong phú, dễ tìm, rẻ tiền nhƣng hiện nay ngƣời dân chỉ mới dừng lại ở việc sử dụng quả Cà na nhƣ một loại rau rừng: ăn sống chấm muối ớt, ngâm chua ngọt... Cho đến nay, các công trình nghiên cứu trên thế giới về loài cây này gần nhƣ chỉ dừng lại ở quả nhƣng cũng g p hạn chế về nguồn nguyên liệu vì quả Cà na chỉ có một m a trong năm từ tháng 9 đến tháng 10. Có rất ít công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá và các bộ phận khác của cây Cà na. Đây là một nguồn nguyên liệu có tiềm năng, nhƣng chƣa đƣợc khai thác và sử dụng đúng mức. Do đó đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hƣớng tác dụng chống oxy hóa của lá cây Cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz)” đƣợc thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu: . . 2 - Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm đánh bắt gốc tự do DPPH các cao chiết từ lá cây Cà na. - Phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất chính từ cao có tác dụng chống oxy hóa mạnh qua sàng lọc trên mô hình DPPH. - Thử hoạt tính chống oxy hóa của chất tinh khiết thu đƣợc sau khi phân lập. Hy vọng kết quả nghiên cứu sẽ làm sáng tỏ hơn về thành phần và hoạt tính chống oxy hóa từ lá cây Cà na, để làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm dƣợc liệu và phục vụ cho các thử nghiệm sinh học sau này. . . 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống Takhtajan (2009), cây Cà na có vị trí phân loại nhƣ sau [4]: Ngành Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan) Lớp Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan) Bộ Oxalidales (Bộ Chua me đất) Họ Elaeocarpaceae (Họ Côm) Chi Elaeocarpus Elaeocarpaceae Elaeocarpaceae Loài Elaeocarpus hygrophilus Kurz Hình 1.1. Vị trí phân loại của Elaeocarpus hygrophilus Kurz 1.1.2. Đặc điểm của chi Elaeocarpus Chi Elaeocarpus (họ Elaeocarpaceae) bao gồm 350-400 loài mà hầu hết phân bố ở rừng mƣa nhiệt đới (ngoại trừ v ng lục địa của châu Phi). Ở Việt Nam có khoảng 40 loài [2]: - Elaeocarpus angustifolius (Côm lá hẹp), Elaeocarpus apiculatus (Côm mũi), Elaeocarpus balansae (Côm Balansa), Elaeocarpus bidoupensis (Côm Bồ đức), Elaeocarpus bonii (Chồi dà), Elaeocarpus coactilus (Côm nhung), Elaeocarpus chinensis (Côm Trung Quốc), - Elaeocarpus darlacensis (Côm Đắk Lắk), Elaeocarpus fleury (Côm Fleury), . . 4 - Elaeocarpus floribundus (Côm trâu), - Elaeocarpus gagnepainii (Côm Gagnapain), - Elaeocarpus grandiflorus (Côm bông lớn), - Elaeocarpus griffithii (Côm Griffith), - Elaeocarpus griseopuberulus (Côm lông xám), - Elaeocarpus grumosus (Côm có mụt), - Elaeocarpus hainanensis (Màng tang), - Elaeocarpus harmandii (Côm Harmand), - Elaeocarpus hygrophilus (Côm háo ẩm, Cà na), Elaeocarpus indochinensis (Côm Đông Dƣơng), Elaeocarpus japonicus (Côm Nhật), Elaeocarpus kontumensis (Côm Kon Tum), Elaeocarpus lanceifolius (Côm lá thon), Elaeocarpus laoticus, Elaeocarpus linearifolius, - Elaeocarpus limitanus, Elaeocarpus macroceras (Côm sừng to), Elaeocarpus medioglaber (Côm giữa trụi), Elaeocarpus nitidus (Côm láng), Elaeocarpus ovalis (Côm xoan), Elaeocarpus parviflorus (Côm hoa nhỏ), Elaeocarpus petelotii (Côm Petelot), Elaeocarpus petiolatus (Côm có cuống), - Elaeocarpus poilanei, Elaeocarpus prunifolius (Côm lá mận), Elaeocarpus tectorius (Đƣớc núi, lá mật cắt), Elaeocarpus silvestris, Elaeocarpus stipularis (Côm lá bẹ), Elaeocarpus tonkinensis (Côm Bắc bộ), Elaeocarpus varunua (Côm), Elaeocarpus viguieri (Nhôi) . . 5 Bảng 1.1. Một số loài của chi Elaeocarpus thường gặp ở Việt Nam [27]. TT 1 Tên Việt Nam Tên khoa học Côm Đồng nai (Đƣớc núi, lá mật cắt) – Elaeocarpus tectorius Đặc điểm Phân bố ở Việt Nam - Cây gỗ thƣờng xanh, cao Thanh Hóa, Nghệ 20 – 25 m, đƣờng kính An, Hà Tĩnh, Gia 40 – 70 cm, cành mập tán rộng. Lai, Kontum, Đắc Lắc, Đồng Nai.... - Hoa lƣỡng tính mọc ch m ở gần đầu cành, cuống chung dài 10 – 14 cm, có lông, nhiều hoa. Cánh tràng 5, dài 4 mm, hình tam giác nhọn, đầu có 25 tua nhỏ. 10 – 30 nhị, bao phấn dài gấp đôi chỉ nhị. Bầu hình trứng có lông, 3 ô, mỗi ô một noãn. Quả hình trái xoan dài 2.5 cm, vỏ quả nhẵn bóng. 2 Côm duyên hải (Côm sừng to) Elaeocarpus macroceras Cây gỗ nhỏ cao 8 – 12 m. Thân Hầu khắp các khu thẳng, gốc có rễ chân nơm. vực bờ nƣớc ở Di Cành non màu nâu nhạt. Linh, Tây Ninh, Cụm hoa ở nách lá hay ở đầu Bình Dƣơng, cành, lá bắc hình mác sớm Bình Phƣớc, thành phố Hồ Chí rụng. Cánh tràng 5, hình tam Minh, Bà Rịa – giác, có nhiều lông, 5 răng ở Vũng Tàu, Bến đỉnh. Tre.... Bầu 2 ô, vòi nhẫn. Quả hình thận dài 1.5 cm, đƣờng kính 0.8 – 1 cm, thịt quả mỏng, cuống quả dài 4 – 5 cm. 3 Côm hải nam Cây gỗ nhỏ, cành non có lông Cao Bằng, Lạng tơ màu trắng. Sơn, Thanh Hóa, Cụm hoa ch m ở nách lá, Nghệ An.... (Màng tang) Elaeocarpus hainanensis thƣờng ngắn hơn so với nách. Hoa màu trắng, đƣờng kính 3 – 4 cm. Cánh đài 5, m t ngoài có lông, hình mác. Cánh tràng 5, hình trứng ngƣợc, xẻ . . 6 nhiều thành tua. Nhị nhiều, nhẵn. Bầu nhẵn, quả hạch hình trám, không có lông dài 2 - 3 cm. 4 Côm bông lớn Elaeocarpus grandiflorus Cây gỗ cao tới 10 – 15 m, Vĩnh Phúc , Sơn đƣờng kính 25 – 30 cm, gốc La, Nam Hà, hơi có bạnh, phân cành lớn. Ninh Bình, Thanh Cụm hoa ng ở đầu cành, Hóa. mang 6 – 8 hoa lớn màu trắng, lá bắc hình sợi. Cánh đài 5 màu trắng xám hình trứng hẹp nhọn đầu; ngoài nhẵn, trong có lông. Cánh tràng 5, màu trắng hình tam giác ngƣợc, gốc dày lên, đỉnh rất rộng, xẻ làm 2 th y lớn, mỗi th y lại bị tƣớc thành 15 th y nhỏ hình sợi. Quả hình trứng dài 3 cm, rộng 1.8 cm, hơi nhọn đầu, chín màu xanh, thịt màu trắng. 5 Côm lá thon Elaeocarpus lanceifolius Cây gỗ lớn, cao đến 20 m; thân Lào Cai, Quảng có rễ chân nơm, tán rậm. Ninh tới Đồng Nai, An Giang. Cụm hoa ng ở kẽ lá, đàu cành dài 8 – 10 cm, mỗi ng 8 – 10 hoa. Hoa màu trắng. Cánh đài 5, mập hình tam giác, dài 1.6 cm, có lông ở m t trong. Cánh tràng 5, màu trắng hình tam giác ngƣợc, gốc mập, đỉnh tràng xẻ đôi mỗi phần lại xẻ thành 8 tua. Quả hạch nhân có 3 rãnh, hình trái xoan, dài 2.5 cm, rộng 1.8 cm. . . 7 6 Côm háo ẩm (Cà na) Elaeocarpus hygrophilus Cây gỗ lớn, cao đến 25 m, gỗ Đồng Nai (Biên màu trắng, nhánh non ít lông. Hoà), Long An Cụm hoa ch m, búp hoa hình (Vĩnh Hƣng, Tân chóp, 5 lá đài có lông màu bạc, Hƣng, Tân hoa năm cánh, cánh hoa có 18- Thạnh, Thạnh 20 rìa, 25-27 nhị, bầu nhụy có Hoá), Tiền Giang lông, bầu 3 ô. Quả nhân cứng (Tân hình bầu dục nhọn, dài 3 cm, Đồng Tháp. Phƣớc), nhân 1 hạt 1.1.3. Đặc điểm của cây Cà na (Elaeocarpus hygrophilus) 1.1.3.1. Danh pháp Tên khoa học: Elaeocarpus hygrophilus Kurz Đồng danh: Elaeocarpus glandulosus Wall. ex Merr. Elaeocarpus madopetalus Pierre [29]. Tên Việt Nam : Cà na, Côm háo m [2]. 1.1.3.2. Mô tả thực vật Cây gỗ lớn, cao đến 25 m, gỗ màu trắng, nhánh non ít lông. Lá có phiến bầu dục, thon ngƣợc, nhỏ, dài 7-9 cm, rộng 2,5-3 cm, chóp lá tròn hay tà, bìa có răng cƣa thƣa, gân phụ 6 c p, cuống dài 1-2 cm. Lá trƣớc khi rụng có màu đỏ. Cụm hoa ch m, búp hoa hình chóp, 5 lá đài có lông màu bạc, hoa năm cánh, cánh hoa có 18-20 rìa, 25-27 nhị, bầu nhụy có lông, bầu 3 ô. Quả nhân cứng hình bầu dục nhọn, dài 3 cm, 1 nhân [30]. Hình 1.2. Toàn cây và lá Cà na [27] .