Tài liệu Lv duong quy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y DƯƠNG THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC COUMARIN TỪ CÂY ĐƯƠNG QUY DI THỰC [ANGELICA ACUTILOBA (SIEB. ET ZUCC.) KIT.] LÀM CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y DƯƠNG THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC COUMARIN TỪ CÂY ĐƯƠNG QUY DI THỰC [ANGELICA ACUTILOBA (SIEB. ET ZUCC.) KIT.] LÀM CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc Mã số: 60720402 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Phương Thiện Thương HÀ NỘI – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình của riêng tôi, do chính tôi thực hiện, tất cả các số liệu trong luận văn này chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có điều gì sai trái tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tác giả Dương Thu Hương LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, các chuyên gia, các nhà khoa học đã hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Trước hết, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Phương Thiện Thương - người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ Khoa Hóa Phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám đốc, Phòng sau đại học, các thầy cô giáo Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược - Học viện Quân y đã dạy dỗ, tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và công tác. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng 8 năm 2015 Học viên cao học Dương Thu Hương MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1 Chương 1 ......................................................................................................... 3 TỔNG QUAN ................................................................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU ĐƯƠNG QUY DI THỰC ................ 3 1.1.1. Vị trí phân loại ................................................................................ 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật ........................................................................... 3 1.1.3. Thành phần hóa học ........................................................................ 4 1.1.4. Tác dụng dược lý và công dụng ...................................................... 7 1.2. TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU VÀ CÁC SẢN PHẨM TỪ ĐƯƠNG QUY............................................................................................. 15 Chương 2 ......................................................................................................... 18 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 18 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 18 2.2. DUNG MÔI, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ ............................... ............. 19 2.2.1. Dung môi, hóa chất ....................................................................... 19 2.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ............................................ 19 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 20 2.3.1. Phương pháp chiết xuất, phân lập các hợp chất từ ĐQDT ........... 20 2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ ĐQDT 21 2.3.3. Phương pháp định tính, định lượng các hợp chất coumarin trong ĐQDT ................................................................................................................. 21 2.3.4. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 28 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................... 28 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................. 29 3.1. CHIẾT XUẤT CÁC CAO TỪ DƯỢC LIỆU .......................................... 29 3.2. PHÂN LẬP CÁC COUMARIN CHÍNH TRONG CAO CHIẾT ....... 29 3.2.1. Định tính coumarin trong dược liệu .............................................. 29 3.2.2. Phân lập các coumarin ................................................................. 30 3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT ....................................... 33 3.3.1. Hợp chất AA1 ............................................................................... 33 3.3.2. Hợp chất AA2 ............................................................................... 35 3.4. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CÁC COUMARIN PHÂN LẬP ĐƯỢC VÀ ACID FERULIC TRONG DƯỢC LIỆU ĐƯƠNG QUY DI THỰC ................................................................. 37 3.4.1. Phương pháp định tính coumarin và acid ferulic trong dược liệu Đương quy di thực .................................................................................. 37 3.4.2. Định lượng các coumarin phân lập được bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp huỳnh quang (HPLC-FLD) ......................................... 39 Chương 4 ......................................................................................................... 50 BÀN LUẬN .................................................................................................... 50 4.1. Phân lập và biện giải các coumarin làm chất đánh dấu ........................... 50 4.2. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng các coumarin phân lập được đồng thời với acid ferulic ....................................................................... 50 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 52 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 55 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 64 PHỤ LỤC I: PHIẾU PHÂN TÍCH VÀ KIỂM NGHIỆM .............................. 65 PHỤ LỤC II: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AA1 ......................................... 66 PHỤ LỤC III: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AA2 ........................................ 76 DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN Phần viết đầy đủ TT Phần viết tắt 1 AchE Acetylcholin esterase 2 ACN Acetonitril 3 BYT Bộ y tế 4 CYP Cytochrome 5 DCM Dicloromethan 6 DEET N,N-diethyl-m-toluamide 7 DMSO Dimethyl sulfoxid 8 ĐQ Đương quy 9 ĐQDT Đương quy di thực 10 ĐQNB Đương quy Nhật Bản 11 EtOAc Ethyl acetat 12 EtOH Ethanol 13 GC-MS Gas chromatography - mass Spectroscopy (Sắc ký khí khối phổ) 14 GC-TOF-MS Gas chromatography – time of flight - mass Spectroscopy (Sắc ký khí khối phổ đầu dò thời gian bay) 15 HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) 16 HPLC-FLD High-performance liquid chromatography Fluorescence Detector (Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector huỳnh quang) 17 IL Interleukin 18 Phổ IR Infrared Spectroscopy (Hồng ngoại) 19 LC liquid chromatography (Sắc ký lỏng) 20 LOD Limit of Detection: Giới hạn phát hiện 21 LOQ Limit of Quantitation: Giới hạn định lượng 22 Phổ MS Mass Spectroscopy (Khối phổ) 23 NF-κB Nuclear factor-κb 24 Phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (phổ cộng hưởng từ hạt nhân) 25 nt Như trên 26 Nrf2 2-Nuclear factor E2 related 27 PMACI Phorbol-12-myristate-13-acetate plus calcium ionophore 28 PPARα Hepatic peroxisome proliferator activated receptor-α 29 QĐ Quyết định 30 RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) 31 SREBP Hepatic sterol regulatory element binding proteins 32 TGF-β1 Transforming growth factor 33 TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) 34 TNF-α Tumor necrosis factor-α 35 TSS Toki-shakuyaku-san 36 TT Thông tư 37 UV Ultraviolet (Tử ngoại) 38 VIS visible (Khả kiến) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1: Tóm tắt các tác dụng dược lý của A. acutiloba........................................ 11 2.1: Nồng độ các chất trong các dung dịch hỗn hợp chuẩn ............................ 23 3.1. Định tính coumarin trong dược liệu và các cao chiết bằng phản ứng hóa học đặc trưng ................................................................................................... 30 3.2: Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của AA1 và xanthotoxin .............................. 33 3.3: Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của AA2 ....................................................... 35 3.4: Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống ......................................... 42 3.5:Kết quả xác định khoảng tuyến tính ......................................................... 43 3.6:Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp .......................................... 45 3.7: Bảng kết quả phân tích độ thu hồi ........................................................... 46 3.8: Độ thu hồi của phương pháp .................................................................... 46 3.9: Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp .................................. 47 3.10: Bảng số liệu phân tích các mẫu ĐQDT ................................................. 47 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1: Một số hợp chất phthalid từ A. acutiloba................................................ 5 1.2: Một số hợp chất tinh dầu khác từ A. acutiloba ........................................ 5 1.3: Một số hợp chất coumarin trong rễ A. acutiloba ..................................... 6 2.1: Rễ đương quy di thực Nhật Bản (A. acutiloba) ....................................... 18 3.1. Quy trình chiết xuất các cao từ dược liệu ĐQDT .................................... 29 3.2: Định tính coumarin trong các cao chiết ................................................... 30 3.3. Quy trình phân lập AA1 và AA2 ............................................................. 31 3.4: Sắc ký đồ AA1 và AA2............................................................................ 32 3.5: Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết chất AA1................................... 32 3.6: Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết chất AA2................................... 33 3.7: Cấu trúc của AA1 ..................................................................................... 35 3.8: Cấu trúc của AA2 ..................................................................................... 37 3.9: SKĐ TLC định tính coumarin và acid ferulic trong ĐQDT .................... 38 3.10: Sắc ký đồ HPLC định tính coumarin trong dược liệu ĐQDT ............... 39 3.11: Sắc ký đồ HPLC-UV định tính các coumarin trong dược liệu ĐQDT .. 40 3.12: Sắc ký đồ HPLC phân tích coumarin trong ĐQDT tại các điều kiện phân tích khác nhau.................................................................................................. 41 3.13: Đường chuẩn xác định nồng độ acid ferulic .......................................... 43 3.14: Đường chuẩn xác định nồng độ scopoletin............................................ 44 3.15: Đường chuẩn xác định nồng độ xanthotoxin ......................................... 44 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, việc sử dụng thuốc và những sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu trong công tác phòng và chữa bệnh ngày càng trở nên phổ biến nhằm hạn chế các tác dụng không mong muốn của tân dược. Tuy nhiên, trên thị trường ngày càng xuất hiện tình trạng dược liệu giả, kém chất lượng. Chúng được dùng trong các bài thuốc, chế phẩm mà người bệnh hay sử dụng hàng ngày, trong đó có dược liệu Đương quy di thực (ĐQDT). Để đảm bảo an toàn khi sử dụng thảo dược trong điều trị, khám, chữa bệnh, Bộ Y tế đã yêu cầu phải kiểm tra chất lượng dược liệu, vị thuốc y học cổ truyền (thông tư số 05/2014/TT-BYT) và cần thiết xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng dược liệu và thuốc từ dược liệu (Quyết định 2614/QĐ-BYT). Dược liệu Đương quy di thực (Radix Angelicae acutilobae) – được chế biến từ rễ củ của cây Đương quy di thực Nhật Bản (Angelica acutiloba (Sieb.et Zucc.) Kit.), họ Hoa tán (Apiaceae) - là vị thuốc được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền từ lâu, được ví là nhân sâm của phụ nữ. Ngày nay, ĐQDT có mặt trong nhiều sản phẩm như thuốc, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và đồ uống. Dù đã có nhiều văn bản pháp luật hướng dẫn nhưng vấn đề đánh giá và kiểm soát chất lượng nguồn dược liệu trong đó có ĐQDT đang còn nhiều hạn chế. Vậy vấn đề đặt ra là làm thế nào kiểm soát chất lượng dược liệu và các sản phẩm chứa ĐQDT? Dược điển Việt Nam IV có chuyên luận riêng cho dược liệu ĐQDT bao gồm các chỉ tiêu: mô tả, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng so sánh với dược liệu đối chiếu, định lượng chất chiết được trong ethanol 50%. Đây là các phương pháp mới chỉ đánh giá được tính đúng của dược liệu chứ chưa thể đánh giá được chất lượng dược liệu thông qua hàm lượng các hoạt chất chính. Tham khảo Dược điển các quốc gia khác, chỉ có Nhật Bản là có chuyên luận riêng với loài Angelica acutiloba – Japanese 2 Angelica root - bao gồm các chỉ tiêu: mô tả, độ sạch, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid, định lượng chất chiết được trong ethanol. Theo các nghiên cứu, nhóm chất chính có trong ĐQDT là tinh dầu (ligustilid, nbutylidenphtalid…), coumarin (scopoletin, xanthotoxin…), saccharid, acid hữu cơ…. Với mong muốn nâng cao khả năng đánh giá chất lượng dược liệu Đương quy di thực bằng các phương pháp phân tích hiện đại (HPTLC, HPLC, UV-VIS…) chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Nghiên cứu chiết xuất và phân lập các coumarin từ cây đương quy di thực [Angelica acutiloba (Sieb. et Zucc.) Kit.] làm chất đánh dấu phục vụ công tác kiểm nghiệm thuốc" với các mục tiêu: - Phân lập được một số chất thuộc nhóm coumarin từ dược liệu Đương quy di thực (Radix Angelicae acutilobae). - Xây dựng được phương pháp định tính, định lượng coumarin đã phân lập được trong dược liệu Đương quy di thực. 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU ĐƯƠNG QUY DI THỰC Đương quy là một vị thuốc được dùng phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam từ lâu đời. Dược liệu Đương quy là rễ của một số loài thuộc chi Angelica, như Angelica gigas Nakai trong Dược điển Hàn Quốc, Angelica sinensis (Oliv.) Drils trong Dược điển Trung quốc và Hồng Kong, Angelica acutiloba Kitagawa ở Nhật Bản – tất cả đều không có nguồn gốc từ Việt Nam mà đều phải di thực. Vì vậy, Dược điển Việt Nam IV quy định dược liệu Đương quy - Radix Angelicae sinensis - là rễ của loài Angelica sinensis (Oliv.) Drils và dược liệu Đương quy di thực - Radix Angelicae acutilobae là rễ của loài Angelica acutiloba Kitag. [2]. 1.1.1. Vị trí phân loại Theo khung phân loại ngành Ngọc lan, Đương quy di thực có tên khoa học là Angelica acutiloba Kitag. có vị trí phân loại như sau: Ngành: Ngọc lan – Magnoliophyta Lớp: Ngọc lan – Magnoliopsida Phân lớp: Thù Du (Cornidae) Bộ: Ngũ gia bì (Araliales) Họ: Hoa tán (Apiaceace) Chi: Angelica [5], [9]. Loài: Angelica acutiloba Kitag. Đương quy di thực còn có tên đồng danh là: Ligusticum acutilobum Siebold & Zucc. 1.1.2. Đặc điểm thực vật Cây thảo, sống nhiều năm, cao 40 - 80 cm, không lông. Lá mọc so le, ở phía dưới có cuống dài 10 - 30 cm, gốc có bẹ ngắn dạng máng, xẻ lông chim 1- 2 lần, lá chét phân thùy hình mác dài 2 - 7 cm, rộng 1 - 3 cm, có cuống 4 ngắn hoặc không cuống; các thùy phân nhỏ, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép có răng to sắc; lá ở ngoài ngọn tiêu giảm. Cụm hoa tán kép, có cuống dài 5 - 20 cm gồm 25 - 40 tán; tổng bao và tiểu bao giống nhau có lá bắc dạng sợi; hoa nhỏ màu trắng lục nhạt; đài không có răng, tràng 5 cánh lõm ở đầu; nhị 5, bầu hình chóp ngược, có gân lồi. Quả bế đôi, hơi dẹt, có cạnh và gân lồi, gân ở mép rộng dạng cánh [5], [9]. 1.1.3. Thành phần hóa học Cũng như các loài đương quy khác, Đương quy di thực có thành phần chính là các tinh dầu, coumarin, saccharid, các acid béo và các thành phần khác [9]. 1.1.3.1. Tinh dầu Tinh dầu là một trong những thành phần chính của Đương quy di thực cũng như các loài Angelica khác, có trong tất cả các bộ phận của cây [9]. Thành phần chính trong tinh dầu lá và rễ ĐQDT là các hợp chất phthalid [29]. Các hợp chất phthalid trong rễ A. acutiloba bao gồm: Z-ligustilid, Eligustilid, 3-butylphthalid, Z-butylidenephthalid, 3-butyliden-4- hydroxyphthalid, E-butylidenephthalid, senkyunolid A, senkyunolid F, senkyunolid H, senkyunolid I , 6,7-dihydroxyligustilid, 6,7-epoxyligustilid [29], [57], levistolid A [57], butyliden dihydrophthalid [26]. 5 Hình 1.1: Một số hợp chất phthalid từ A. acutiloba Ngoài ra, trong rễ đương quy di thực còn chứa các hợp chất tinh dầu thuộc nhóm khác như: α-pinen, β-pinen, camphen, sabinen, β-myrcen, αterpinen, ο-cimen, β-phellandren, β-ocimen, alloocimen, 5-undecen, transcaryophyllen, trans-β-farnesen [26]. Hình 1.2: Một số hợp chất tinh dầu khác từ A. acutiloba 1.1.3.2. Coumarin Coumarin là nhóm hợp chất quan trọng, đặc trưng cho các loài thuộc chi Angelica [9]. Trong loài A. acutiloba có chứa các coumarin thuộc các nhóm: coumarin đơn giản (gồm umbelliferon [47], scopoletin [45]); furanocoumarin (gồm xanthotoxin [38] , isopimpinenlin [38], bergapten [24], psoralen [24]); pyranocoumarin (gồm decursinol schinicoumarin [48]. angelat [14], decursin [31]); và 6 Năm 1977, Tanaka và cộng sự đã phân lập scopoletin từ A. acutiloba. Scopoletin còn có trong một số loài Angelica khác như A. pubescens [55], A. japonica [15], A. dahurica [25]. Scopoletin có tác dụng chống ung thư và tăng cường khả năng miễn dịch [46], chống viêm [18],[54], chống oxy hóa [54], chống lão hóa [40]. Năm 2004, Miyazawa M. và cộng sự đã phân lập được xanthotoxin từ rễ của Đương quy Nhật Bản [38]. Ngoài ra, xanthotoxin còn có mặt trong một số loài khác như A. pubescentis [56], A. peucedanum [42], A. archangelica [43], A. japonica [15]. Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy xanthotoxin có tác dụng ức chế acetylcholinesterase với IC50 là 0,72mM [43], ức chế sự phát triển của khối u [15]. Hình 1.3: Một số hợp chất coumarin trong rễ A. acutiloba 1.1.3.3. Saccharid Saccharid trong ĐQDT gồm 2 loại là monosaccharid và polysaccharid [5], [9]. Monosaccharid trong ĐQDT gồm có các đường đơn như: sucrose, lactose [47], fructose, glucose [49]. Polysaccharid trong A. acutiloba gồm các polysaccharid đồng thể và dị thể. Các polysaccharid đồng thể là các glucan (polymer của glucose liên kết với nhau theo 4-O hay 4,6-di-O-glucosyl, cấu hình α) hay araban (polymer 7 của arabinose). Các polysaccharid dị thể bao gồm các pectic AR-2IIa-IId, các polysaccharid này chứa tỷ lệ lớn acid galacturonic với vùng trung tâm đường chứa chủ yếu các đường Rha, Ara và Gal; và các pectic arabinogalactan là AGIIa và AGIIb-1[27]. 1.1.3.4. Các nhóm chất khác Ngoài các nhóm chất chính kể trên, A. acutiloba còn chứa alkaloid, acid hữu cơ, acid amin và một số hợp chất khác như sau: Acid hữu cơ: acid ferulic [29], [47], [57], acid citric [47], [49], acid malic [47], [49], maleat, acid fumaric [47], acid phosphoric [49], acid galacturonic [49], acid succinic [49], acid propanoic [49], acid pipecolic [49]. Acid amin: acid 4-Aminobutyric (GABA), alanin, argrinin [47], prolin [47], [49], cytisin [48], asparagin [49], serin [49], threonin [49], [47], leucin [47], glutamin [47], phenylalanin [47]. Alkaloid: caffein [47]. Các pyrazin: ethylmethylpyrazin, tetramethylpyrazin, trimethylpyrazin [49]. Polyacetylen: falcarinol, falcarindiol, falcarinolon [5], [9]. Các hợp chất khác: R-methyl-5-(1-methylethyl)-1-nitro-1,3- cyclohexadien [48], myricetin [48], podophyllotoxin [48], vulgaxanthin-1 [48], inositol [49], ornithin [49], coniferyl ferulat [57], 4-hydroxy-4-methyl-2pentanon [14], β-farnesen, β-sitosterol [5]. 1.1.4. Tác dụng dược lý và công dụng 1.1.4.1. Tác dụng dược lý Tác dụng trên huyết học Nghiên cứu của Lee H.W. năm 2014 cho thấy dịch chiết nước từ A. acutiloba có tác dụng ngăn ngừa thiếu máu tán huyết trên chuột gây bởi phenylhydrazin, thể hiện qua tăng số lượng hồng cầu và nồng độ erythropoietin trong máu [30]. 8 Nghiên cứu năm 2004 của Hatano Ryo và cộng sự cho thấy cao chiết nước từ A. acutiloba có tác dụng kích thích tạo máu bằng cách kích hoạt hồng cầu chưa trưởng thành ở chuột thiếu máu do 5-fluorouracil gây ra [20]. Phân đoạn giàu polysaccharid với liều 50mg/kg thể trọng/ngày trong 10 ngày có tác dụng kích thích các tế bào trong tủy xương ở ngày thứ 10, tăng tỷ lệ hồng cầu lưới ở máu ngoại vi vào ngày thứ 15 và số lượng hồng cầu được phục hồi gần như hoàn toàn vào ngày thứ 20 [20]. Cơ chế có thể thông qua ức chế tiết các cytokin [20]. Theo kết quả nghiên cứu của Kozo Fukuda và cộng sự, cao chiết rễ A. acutiloba với nồng độ 200µg/ml có tác dụng chống đông máu thông qua ức chế kết tập tiểu cầu, hồng cầu và tăng phân hủy fibrin [16]. Tác dụng này được cho là do các hợp chất như Z-ligustilid, Z-butylidenephthalid, acid ferulic, adenosin và falcarindiol tạo nên [16]. Tác dụng trên miễn dịch Nghiên cứu năm 1982 của Y. Kumazawa và cộng sự cho thấy các polysaccharid từ rễ A. acutiloba có tác dụng kích thích miễn dịch [28]. Kết quả nghiên cứu năm 1987 của Haruki Yamada và cộng sự cho thấy rễ đương quy Nhật Bản có chứa hợp chất polysaccharid arabinogalactan (ký hiệu AGIIb-1) có tác dụng kháng bổ thể [53]. Nghiên cứu sâu hơn cho thấy cấu trúc arabino-3,6-galactan là cấu trúc có hoạt tính mạnh nhất trong số các đơn vị và vùng rimified (rhamnogalacturonan với các chuỗi carbohydrate trung tâm như arabinan, galactan và arabinogalactan) là cần thiết cho hoạt tính [52]. Năm 2011 K. Lee và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống dị ứng của rễ đương quy Nhật Bản. Kết quả cho thấy ở nồng độ từ 1-100µg/ml, cao chiết A. acutiloba ức chế sự giải phóng các cytokin (TNF-α, IL-6 và IL-8) và quá trình phosphoryl oxy hóa của JNK và ERK ở tế bào đại thực bào bị viêm do PMACI A23187 gây ra [31]. Tác dụng trên chuyển hóa 9 Kết quả nghiên cứu của L-M. Liu và cộng sự năm 2012 cho thấy cao chiết cồn thấp độ của rễ A. acutiloba với liều 100-300mg/kg/ngày có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol, triglycerid trong huyết tương và gan chuột ăn chế độ ăn giàu chất béo [34]. Tác dụng này được cho là do cao chiết A. acutiloba có tác dụng làm tăng quá trình oxy hóa các acid béo bằng cách tăng sự biểu hiện của PPARα và giảm sự biểu hiện của SREBP [34]. Cao chiết cồn từ rễ A. acutiloba liều 200mg/kg/ngày trong 8 tuần có tác dụng làm giảm nồng độ đường huyết ở chuột đái tháo đường gây bởi steptozocin, đồng thời cải thiện các chỉ số albumin niệu, độ thanh thải creatinin ở chuột đái tháo đường [35]. Các tác dụng này có thể do cao chiết đương quy ngăn ngừa sự tăng của các yếu tố NF-κB, TGF-β1, ngăn ngừa sự tích lũy của fibronectin trong bệnh thận do đái tháo đường ở chuột [35]. Cao chiết đương quy còn có tác dụng làm giảm các sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của glycation (AGEs), acid thiobarbituric phản ứng trong ty thể, nồng độ Nε-(carboxymethyl)lysine và thụ thể của AGEs ở thận [35]. Nghiên cứu của I.M. Liu và cộng sự năm 2011 cho thấy sử dụng cao chiết đương quy Nhật Bản với liều 300mg/kg/ngày trong 8 tuần có tác dụng giảm kháng insulin ở chuột béo phì do ăn chế độ ăn giàu fructose, tác dụng này tương đương pioglitazone liều 20mg/kg/ngày [33]. Tác dụng trên thần kinh trung ương Cao chiết nước từ rễ A. acutiloba liều 1,25-2,5g/g có tác dụng làm giảm ảnh hưởng của stress trên giấc ngủ của chuột. Ở liều này cao chiết nước ĐQNB cũng có tác dụng trên các trường hợp sử dụng chất chủ vận α2androceptor (yohimbine), diazoxan, α1-androreceptor methoxamine. Những kết quả này gợi ý rằng cao chiết nước từ ĐQNB có tác dụng giảm mức độ kích thích gây bởi stress cô lập hay hoạt hóa hệ thổng noradrenergic trung ương [37].