Tài liệu Luận văn thạc sỹ nghiên cứu vai trò của một số polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. DƯƠNG TẤN NHỰT 2. PGS. TS. BÙI VĂN LỆ Học viên thực hiện: VŨ THỊ THỦY MỤC LỤC MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình và đồ thị Mở đầu ........................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SƠ LƯỢC VỀ PHÔI VÔ TÍNH .......................................................................... 3 1.1.1. Quá trình phát sinh phôi ở thực vật .......................................................... 3 1.1.2. Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng .................... 4 1.1.3. Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính ........................................................... 8 1.1.4. Trạng thái của các tế bào phát sinh phôi vô tính ...................................... 9 1.1.5. Sự phát sinh phôi vô tính ........................................................................ 11 1.1.6. Ứng dụng của quá trình tạo phôi vô tính ................................................ 13 1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH ......... 13 1.2.1. Chất điều hòa sinh trưởng ...................................................................... 13 1.2.2. Nguồn Nitơ ............................................................................................. 15 1.2.3. Ánh sáng ................................................................................................. 16 1.2.4. Đường ..................................................................................................... 16 1.2.5. Độ pH ..................................................................................................... 17 1.3. VAI TRÒ CỦA POLYAMINE .......................................................................... 17 1.3.1. Giới thiệu ................................................................................................ 17 1.3.2. Con đường trao đổi chất của Polyamine ................................................ 18 1.3.2.1. Sinh tổng hợp Polyamine .......................................................... 18 1.3.2.2. Sự vận chuyển Polyamine ......................................................... 21 1.3.2.3. Sự tiếp hợp Polyamine .............................................................. 22 1.3.2.4. Polyamine trong tương tác với các con đường sinh tổng hợp khác ................................................................................... 22 1.3.2.5. Các chất ức chế sinh tổng hợp Polyamine ............................... 22 1.3.3. Polyamine đóng vai trò là chất điều hòa sinh trưởng ............................. 23 1.4. SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) .................................................................................................. 25 1.4.1. Phân loại và đặc điểm hình thái .............................................................. 25 1.4.1.1. Phân loại .................................................................................. 25 1.4.1.2. Đặc điểm hình thái ................................................................... 25 1.4.2. Phân bố ................................................................................................... 26 1.4.3. Thành phần hóa học ............................................................................... 26 1.4.3.1. Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) ....................................... 26 1.4.3.2. Phần trên mặt đất (thân và lá) ................................................. 28 1.4.3.3. Các thành phần khác ................................................................ 28 1.4.4. Các tác dụng của sâm Ngọc Linh ........................................................... 28 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU ......................................................................................................... 30 2.1.1. Nguồn mẫu ............................................................................................. 30 2.1.2. Môi trường nuôi cấy ............................................................................... 30 2.1.3. Điều kiện thí nghiệm .............................................................................. 30 2.1.4. Địa điểm thực hiện đề tài ....................................................................... 30 2.2. PHƯƠNG PHÁP ................................................................................................ 31 2.2.1. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ..................................................................................................... 31 2.2.2. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét ........................................................................................................ 31 2.2.3. Thu thập mẫu và phân tích Polyamine nội sinh ..................................... 32 2.2.4. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 32 2.2.4.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu cấy khác nhau của cây sâm Ngọc Linh .... 32 2.2.4.2. Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau lên sự hình thành mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................... 33 2.2.4.3. Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ............................ 33 2.2.4.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy và điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh .................................... 34 2.2.4.5. Thí nghiệm 5. Khảo sát ảnh hưởng của một số tiền chất sinh tổng hợp Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ................................................ 35 2.2.4.6. Thí nghiệm 6. Khảo sát ảnh hưởng của một số Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ........................................................................ 35 2.2.5. Xử lý số liệu ........................................................................................... 35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU LÊN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO CÓ KHẢ NĂNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH SÂM NGỌC LINH ............ 36 3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MÔI TRƯỜNG KHOÁNG LÊN KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH ........................... 38 3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ 2,4-D KẾT HỢP VỚI 0,5 mg/l NAA VÀ 0,2 mg/l KIN LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH ......................................................................... 41 3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH ................................................................................. 44 3.4.1. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (đặc, lỏng tĩnh, lỏng lắc) lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh.............. 44 3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ....................................................... 46 3.5. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ TIỀN CHẤT SINH TỔNG HỢP POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH ................................................................................. 49 3.5.1. Ảnh hưởng của Arginine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................... 49 3.5.2. Ảnh hưởng của Ornithine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................... 50 3.6. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THUỘC NHÓM POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH ................................................................................. 52 3.6.1. Ảnh hưởng của Putrescine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ......................................................................... 52 3.6.2. Ảnh hưởng của Spermidine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ......................................................................... 55 3.6.3 Ảnh hưởng của Spermine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................... 57 3.7. PHÂN TÍCH POLYAMINE NỘI SINH ........................................................... 60 3.8. GIẢI PHẪU CÁC DẠNG HÌNH THÁI PHÔI KHÁC NHAU CỦA SÂM NGỌC LINH ...................................................................................................... 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN ............................................................................................................... 65 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 66 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ½MS : Môi trường MS với thành phần khoáng đa lượng giảm ½, vi lượng giữ nguyên ½SH : Môi trường SH với thành phần khoáng đa lượng giảm ½, vi lượng giữ nguyên 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid ABA : Absisic acid ACC : 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid ACD : Arginine decarboxylase Arg : Arginine ATP : Adenosine-5’-triphosphate BAP : 6-benzylaminopurine CH : Casein EC : Các cụm phát triển phôi (Embryogenic cluster) G- : Ginsenoside GA3 : Gibberellic acid G-Rb1 : Ginsenoside-Rb1 G-Rg1 : Ginsenoside-Rg1 IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid Kin : Kinetin LDC : Udecarboxylase MR2 MS : Majonoside-R2 : Môi trường Murashige và Skoog, 1962 MS½ : Môi trường MS với thành phần khoáng đa lượng và vi lượng giảm ½ NAA : Acid ODC : Ornithine decarboxylase Orn : Ornithine -naphtaleneacetic PA : Polyamine PEM : Cụm tiền phôi (Pre-embryo mass) pkl : Gene pickle (Một dạng đột biến gene ở cây Arabidopsis) Put : Putrescine SAM : S-adenosylmethionine SERK : Somatic embryogenesis receptor-like kinase SH : Môi trường Schenk and Hildebrandt, 1972 SH½ : Môi trường SH với thành phần khoáng đa lượng và vi lượng giảm ½ Spd : Spermidine Spm : Spermine TDZ : Thidiazuron DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1. Khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu khác nhau Bảng 3.2. của sâm Ngọc Linh ............................................................................. 36 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên khả năng hình thành mô sẹo xốp từ lá sâm Ngọc Linh ........................................................... 39 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,5; 2 mg/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ............................. 42 Bảng 3.4.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh .................................................... 45 Bảng 3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ................................................... 47 Bảng 3.5.1. Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................. 49 Bảng 3.5.2. Ảnh hưởng của Orn lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................. 51 Bảng 3.6.1. Ảnh hưởng của Put lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ....................................................................................... 53 Bảng 3.6.2. Ảnh hưởng của Spd lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh .................................................................................... 56 Bảng 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ................................................................................... 57 DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Trang Các dạng phát sinh phôi ở thực vật ....................................................... 3 Hình 1.2. Mô hình giả thuyết các sự kiện xảy ra trong quá trình phát sinh phôi vô tính ............................................................................................ 7 Hình 1.3. Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển của phôi .................... 9 Hình 1.4. Trao đổi chất PA và tương tác với các con đường trao đổi chất khác ..................................................................................................... 19 Hình 1.5. Cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .................. 25 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu lên khả năng hình thành mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh .................................................................................... 37 Hình 3.2. Ảnh hưởng của các môi trường khoáng lên khả năng hình thành mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ................................................................. 41 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ................................................................. 44 Hình 3.4.1. Mô sẹo và phôi trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc, lỏng tĩnh và đặc. ...................................................................................................... 46 Hình 3.4.2. Mô sẹo trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày và tối hoàn toàn ....... 48 Hình 3.5.1. Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh .................................................................................... 50 Hình 3.5.2. Ảnh hưởng của Orn lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh .................................................................................... 52 Hình 3.6.1. Ảnh hưởng của Put lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh .................................................................................... 54 Hình 3.6.2. Ảnh hưởng của Spd lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh .................................................................................... 56 Hình 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................. 58 Hình 3.6.4. Một số cây con tái sinh từ mô sẹo xốp trên môi trường ĐC, Spd, Put và Spm. ......................................................................................... 58 Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi hàm lượng PA ở các giai đoạn phát triển cụm mô phôi ở sâm Ngọc Linh trên môi trường ĐC và môi trường bổ sung Spd .............................................................................................. 61 Hình 3.7. Sự thay đổi hình thái và cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh ........................................................................ 64 MỞ ĐẦU Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là cây dược liệu đặc hữu quý hiếm của Việt Nam và thế giới, được biết đến bởi hàm lượng cao các hợp chất Saponin triterpenoic tiêu biểu như MR2, G-Rb1 và G-Rg1 [Trần Công Luận, 2003]. Không chỉ có dược tính đặc trưng của chi nhân sâm mà loài cây này còn có tác dụng điển hình như chống stress, chống trầm cảm, tác dụng chống oxi hóa in vitro và in vivo… Hiện nay, do nhu cầu cao của thị trường kết hợp với việc khai thác ồ ạt, thiếu khoa học, trồng, nhân giống hạn chế và bảo tồn lỏng lẻo, đã và đang đẩy sâm Ngọc Linh đến bờ vực của sự tuyệt chủng. Do đó, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được áp dụng cho loài cây này [Nguyễn Ngọc Dung, 1995; Dương Tấn Nhựt et al., 2010]. Đây là phương pháp hiệu quả trong việc nhân nhanh số lượng cây sâm Ngọc Linh trong thời gian ngắn mà vẫn đảm bảo chất lượng cây giống. Trong đó, nhân giống vô tính thông qua con đường phát sinh phôi vô tính đã mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn, có tính thương mại cao bởi tạo ra lượng lớn cây con sâm Ngọc Linh trong thời gian ngắn, cây con đồng đều về di truyền và có tỉ lệ sống sót cao ngoài vườn ươm. Tương tự phôi hữu tính, phôi vô tính gồm có mầm chóp rễ và chồi đỉnh nên có thể nảy mầm thành một cây hoàn chỉnh. Tuy nhiên, sự hình thành phôi vô tính là một quá trình phức tạp, chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nguồn mẫu, nhiệt độ, ánh sáng, độ pH … Trong đó, các chất điều hòa sinh trưởng như 2,4-D, NAA, Kinetin, Proline…. đóng vai trò rất quan trọng. Gần đây, các Polyamine gồm Putrescine, Spermidine và Spermine cùng các tiền chất của chúng (Arginine và Ornithine) được chú ý như là một lớp chất điều hòa sinh trưởng mới có các dụng trong nhiều chu trình của cây như sự chín quả, già lá, sinh trưởng và phát triển hoa; đặc biệt, có sự liên quan mật thiết với quá trình phát sinh phôi vô tính. Ở nồng độ cao, Polyamine có tác dụng giúp cho tế bào lớn lên và phân chia. Trong giai đoạn cảm ứng tạo phôi, Polyamine thúc đẩy các tế bào vùng mô phân sinh phân chia nhanh chóng và biệt hóa tạo phôi. Nồng độ Polyamine giảm có thể gia tăng các tế bào mô sẹo nhưng sẽ làm giảm sự hình thành phôi. Polyamine nâng cao hiệu suất phát sinh phôi ở nhiều loại cây đã được nghiên cứu như cây cà rốt, Pinus gerardiana Wall, Momordica charatia L., cây ổi [Hadrami và D’Auzac, 1992; Ravindra et al., 2007; Ananya et al., 2009; Nasim, 2013]. Mặc dù, việc sử dụng Polyamine kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng khác mang lại hiệu quả trong biệt hóa tế bào hình thành phôi [Rajam, 1997] cũng như các giai đoạn hình thành cây hoàn chỉnh ở thực vật đã được chứng minh [Kevers et al., 2000] song cơ chế tác động vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng. Trong nỗ lực bảo tồn và nhân giống cây sâm Ngọc Linh, chúng tôi đã tiến hành “Nghiên cứu vai trò của một số Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro”. Ảnh hưởng nguồn mẫu, điều kiện khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, điều kiện nuôi cấy và điều kiện chiếu sáng được đánh giá trước khi nghiên cứu vai trò của các Polyamine cũng như tiền chất của chúng lên sự hình thành và tần suất phát sinh phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh in vitro. Đồng thời, nồng độ Polyamine nội sinh cũng được tiến thành phân tích để những kết luận trở nên thuyết phục, có giá trị hơn và mở đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về Polyamine trên loài cây quý này. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SƠ LƯỢC VỀ PHÔI VÔ TÍNH Phôi vô tính chứa chất dinh dưỡng tương tự phôi hữu tính, có mầm chóp rễ và chồi đỉnh nên có thể nảy mầm trực tiếp thành cây không qua giai đoạn phát sinh chồi, rễ. Các mô và tế bào sinh dưỡng nuôi cấy in vitro tạo ra phôi vô tính trực tiếp; hoặc gián tiếp thông qua một quá trình tạo mô sẹo. Tế bào mô sẹo có thể phân chia theo cấp số nhân, nhờ vậy chỉ sau một thời gian ngắn nó có thể tạo được một số lượng phôi đáng kể. Ưu điểm nổi bật của phôi vô tính là có thể bảo quản được lâu dài và cho nảy mầm vào thời vụ thích hợp. Hiện nay, trên 200 loài cây trồng đã được nhân giống thành công bằng công nghệ phôi vô tính. Công nghệ tạo phôi vô tính hiện nay vẫn đang là công nghệ tiên tiến trên thế giới [Nguyễn Văn Uyển, 2006; Dương Tấn Nhựt, 2007]. 1.1.1. Quá trình phát sinh phôi ở thực vật Hình 1.1. Các dạng phát sinh phôi ở thực vật [Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007] Ở các loài thực vật bậc cao, phôi và nội nhũ là kết quả của sự thụ phấn kép (sự thụ phấn của tế bào noãn đồng thời với sự thụ phấn của tế bào trung tâm) được bao bọc trong hạt. Sự phát sinh phôi hợp tử ở thực vật là một quá trình phức tạp ẩn sâu trong mô mẹ. Ngoài những dữ liệu mô học thu thập được trên nhiều loài thực vật thì việc phân tích các dạng đột biến ở cây Arabidopsis cũng đã góp phần làm sáng tỏ một chuỗi các sự kiện xảy ra trong quá trình phát triển phôi ở thực vật. Ngày nay, vi nhân giống và thụ phấn in vitro, kết hợp với các biện pháp phân tử và gene, đã làm rõ ràng thêm một số chi tiết và đồng thời cũng có những đóng góp thiết thực vào vốn hiểu biết của chúng ta về quá trình phát sinh phôi sinh dưỡng ở thực vật. Tuy nhiên, ở các loài thực vật bậc cao, việc không thể phát sinh phôi hợp tử ở một số loài được cho là có liên quan đến sự sinh sản vô phối (apomixis-sự sinh sản không thông qua quá trình thụ tinh) (gồm hơn 400 loài cây thuộc ít nhất 40 họ khác nhau). Trong quá trình sinh sản vô phối, sự hình thành hạt vô tính bắt đầu từ mô mẹ của noãn, không trải qua quá trình giảm phân và thụ phấn, dẫn đến sự phát triển của phôi. Hiện tượng sinh sản vô phối đã bộc lộ hai khía cạnh quan trọng của quá trình phát sinh phôi ở thực vật: (1) Các điểm nhấn kích hoạt sự thụ phấn có thể được thay thế bằng những cơ chế nội sinh; (2) Ở một số loài thực vật bậc cao, ngoài tế bào noãn được thụ phấn thì các loại tế bào khác cũng có thể duy trì và giữ lại khả năng phát triển phôi. Mặc dù quá trình sinh sản vô phối chỉ hạn chế ở các tế bào phát sinh đỉnh hoặc noãn, nhưng cũng có một số lượng lớn tế bào sinh dưỡng thực vật có thể trải qua quá trình phát triển phôi dưới những điều kiện thích hợp. Ví dụ, sự hình thành phôi (có vai trò như lá mầm sinh dưỡng) cũng có thể xảy ra trên mép lá của cây sống đời Kalanchoe, cây Malaxis paludosa [Taylor, 1967]. Có nhiều thí nghiệm phát sinh phôi được bắt đầu từ nuôi cấy in vitro các tế bào sinh dưỡng hoặc tế bào giao tử (ví dụ: tiểu bào tử). Các dạng thức phát sinh phôi ở thực vật được tóm lược trên Hình 1.1. 1.1.2. Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng Theo Moltrasio và cộng sự (2004) thì khả năng phát sinh phôi vô tính được biểu hiện trước hết là ở mức kiểu gene và điều này có thể được chứng minh dễ dàng bằng cách chuyển khả năng phát sinh phôi từ kiểu gene có khả năng phát sinh phôi sang kiểu gene ngăn cản sự phát sinh phôi thông qua quá trình lai giống hữu tính. Mặc dù các điều kiện kích thích sự phát sinh phôi đã được thiết lập cho nhiều loài, nhưng vẫn còn một số lượng lớn các loài chưa thể tạo phôi vô tính. Thậm chí ngay trong cùng một loài, có kiểu gene dễ tạo phôi nhưng cũng có kiểu gene ngăn cản sự tạo phôi. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sự ngăn cản tạo phôi có thể được giải quyết bằng cách tối ưu hóa các điều kiện sinh trưởng của cây hoặc bằng cách chọn lựa mẫu cấy thích hợp. Vì vậy, việc xác định các đặc tính di truyền có thể chỉ được sử dụng để xác định vị trí và thời điểm biểu hiện khả năng phát sinh phôi. Do đó khả năng phát sinh phôi chủ yếu được xác định thông qua chương trình phát triển của thực vật cũng như những dấu hiệu của môi trường. Phôi vô tính có thể phát triển trên tất cả các cơ quan của cây cà rốt hoặc cỏ linh lăng mà có mang những kiểu gene nhất định quy định sự phát sinh phôi; từ đó, cho thấy biên độ biểu hiện rộng của khả năng phát sinh phôi. Tuy nhiên, ở phần lớn các loài thực vật, khả năng phát sinh phôi bị hạn chế ở những mô nhất định của kiểu gene nói trên. Những thí nghiệm nuôi cấy mô cho thấy giữa các cơ quan khác nhau của cây tồn tại một gradient phản ứng phát sinh phôi. Các mô có nguồn gốc từ phôi thì có khả năng phát sinh phôi cao nhất và khả năng này giảm dần ở cọng dưới lá mầm, cuống lá, lá và rễ [Neumann, 2000]. Nhưng điều thú vị là vẫn có thể được phục hồi khả năng phát sinh phôi vô tính bằng con đường tạo mô sẹo trung gian từ các tế bào sinh dưỡng đã mất đi tiềm năng này. Rõ ràng, khả năng phát sinh phôi của tế bào thực vật không ngừng giảm trong suốt quá trình phát triển cá thể và phụ thuộc vào loài. Ở thực vật một lá mầm, bao gồm hầu hết các loài ngũ cốc quan trọng, khả năng phát sinh phôi hầu như chỉ giới hạn ở các tế bào có nguồn gốc từ phôi hoặc mô phân sinh bao gồm phôi non, hạt, gốc lá của Graminae, đỉnh chồi của Orchidaceae, vảy củ và chồi bên của Liliaceae. Trong nuôi cấy in vitro, khả năng phát sinh phôi của những tế bào mô phân sinh này có thể được duy trì nếu mẫu cấy được nuôi trên môi trường có bổ sung 2,4-D, tiếp đó cho tạo mô sẹo. Cấy chuyền những tế bào mô sẹo có khả năng phát sinh phôi này sang môi trường không có chất kích thích sinh trưởng hoặc môi trường có bổ sung auxin với nồng độ thấp thì có thể đạt được một tỉ lệ phát sinh phôi vô tính cao. Ngược với các tế bào mô phân sinh, các tế bào sinh dưỡng của cây một lá mầm được biệt hóa sớm hơn và nhanh hơn, điều này làm mất khả năng phân chia và phát sinh hình thái của chúng. Ở mặt này, cần lưu ý là sự điều hòa quá trình phát triển chuyển tiếp từ giai đoạn còn non đến giai đoạn trưởng thành có thể khác nhau giữa cây một lá mầm và hai lá mầm. Mặc dù lý do trực tiếp của việc sớm mất đi tính toàn năng ở thực vật một lá mầm vẫn chưa được biết đến, nhưng người ta đã có thể liên hệ giữa sự điều hòa nghiêm ngặt của quá trình tổng hợp này với quá trình chuyển hóa của các chất điều hoà nội sinh, chẳng hạn như auxin. Nhiều thí nghiệm đã được thực hiện để so sánh kiểu gene điều khiển sự phát sinh phôi và kiểu gene ngăn cản sự phát sinh phôi nhằm chỉ ra những khác biệt chính giữa chúng [Fehér et al., 2003]. Ở cỏ linh lăng (Medicago sativa), những kiểu gene có quan hệ mật thiết được chọn lọc dựa trên khả năng phát sinh phôi của chúng; các phản ứng của chúng với auxin được so sánh và những đặc điểm khác nhau được ghi nhận; trong đó, những gene đáp ứng với auxin được kích thích hoặc bị ức chế ở nồng độ auxin rất thấp để chống lại những kiểu gene ngăn cản sự phát sinh phôi [Börge et al., 1990]. Ngoài ra, auxin còn có tác dụng ức chế sự ra rễ của những mẫu cắt chồi sinh trưởng in vitro ở nồng độ thấp hơn nhiều [Börge et al., 1990]. Mô sẹo của các kiểu gene không phát sinh phôi vẫn tiếp tục sinh trưởng trong môi trường bổ sung 2,4-D có nồng độ tương đương với nồng độ ức chế sự phân bào của những kiểu gene điều khiển sự phát sinh phôi. Các quan sát trên chỉ ra những khác biệt đáng kể về tính nhạy cảm với auxin của hai kiểu gene này. Vai trò quan trọng của các hormone biến dưỡng nội sinh (bị ảnh hưởng bởi tính di truyền, các dấu hiệu sinh lý và môi trường) trong giai đoạn kích thích phát sinh phôi sinh dưỡng đã được thừa nhận. Những tế bào có khả năng phát sinh phôi có đặc điểm là nhân nằm ở vị trí trung tâm, có những ống siêu nhỏ nổi bật ở gần nhân và những sợi nhỏ actin [Šamaj et al., 2003]. Verdeil và cộng sự (2001), đã mô tả các tế bào phát sinh phôi ở cây dừa có các đặc điểm rất rõ ràng: lõm sâu vào vỏ nhân, các thể lưới dictyosomes và bộ máy golgi nhân lên có quan hệ trực tiếp với sự dày lên các vách tế bào. Ngoài ra, chúng còn có một cấu trúc thành tế bào đặc biệt. Các dạng tế bào này vừa có nguồn gốc từ các mô phân sinh (hoặc mô phát sinh phôi) vừa có thể được tạo ra từ những tế bào có khoảng không bào lớn trong một số điều kiện thích hợp; chẳng hạn như sau khi xử lý với 2,4D. Tuy nhiên, một số loại hormone (ABA, cytokinin) hoặc stress khác cũng có thể kích thích sự hình thành những kiểu tế bào có khả năng phát sinh phôi. Hình 1.2. Mô hình giả thuyết các sự kiện xảy ra trong quá trình phát sinh phôi vô tính [Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007] Hệ thống nuôi cấy tế bào trần của cỏ linh lăng cho phép tiến hành những nghiên cứu chi tiết ở mức độ tế bào đơn và cả ở mức độ quần thể tế bào. Kết quả cho thấy sự phát triển của những tế bào này phụ thuộc vào nồng độ 2,4-D: môi trường có bổ sung 1 µM 2,4-D cho phép hình thành những tế bào có khoảng không bào lớn (không có khả năng phát sinh phôi), trong khi môi trường có bổ sung 2,4-D với nồng độ cao gấp 10 lần cho phép hình thành những tế bào nhỏ và dày đặc tế bào chất (có khả năng phát sinh phôi) [Pasternak et al., 2002]. Ngoài ra, hệ thống này còn được sử dụng để tiến hành so sánh giữa các kiểu gene có hoặc không có khả năng phát sinh phôi [Bögre et al., 1990]. Kết quả so sánh giữa những tế bào có khả năng phát sinh phôi và những tế bào không có khả năng phát sinh phôi cho thấy cả 2 kiểu gene trên không những thể hiện những khác biệt về đặc điểm hình thái mà còn thể hiện những biến đổi trong quá trình sinh lý. Gene đặc trưng nhất liên quan đến tiềm năng phát sinh phôi là gene mã hóa cho enzyme SERK1, được Schmidt và cộng sự (1997) phát hiện lần đầu tiên ở cây cà rốt. Tác giả này dụng promoter SERK để nối vào đoạn gene mã hóa cho enzyme luciferase và tiến hành theo dõi tế bào bằng video, kết quả cho thấy tế bào đơn mà có sự biểu hiện của SERK thì thực sự có thể phát triển thành phôi sinh dưỡng. Ngoài ra, sự biểu hiện lệch vị trí gene AtSERK có thể làm cho sự hình thành phôi sinh dưỡng diễn ra một cách dễ dàng hơn [Hecht et al., 2001]. Do đó, sự biểu hiện của gene SERK được sử dụng như là một nhân tố đánh dấu khả năng sinh phôi. Ở thực vật, AtSERK được biểu hiện lần đầu tiên trong quá trình phát sinh đại bào tử và sau đó là trong các đại bào tử có chức năng, trong tất cả các tế bào của túi phôi cho đến khi thụ phấn và trong túi phôi cho tới giai đoạn hình tim. Sau giai đoạn hình tim này, sự biểu hiện của gene không còn được tìm thấy ở bất kì bộ phận nào của hạt đang phát triển. Tuy nhiên, gene này có sự biểu hiện thấp ở những mô mạch trưởng thành. Sự biểu hiện gene AtSERK1 cũng được quan sát ở đỉnh chồi, mô phân sinh và lá mầm của hạt cây Arabidopsis nuôi cấy trong môi trường có bổ sung auxin trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy mô sẹo phát sinh phôi [Hecht et al., 2001]. Có ý kiến cho rằng protein SERK đơn thuần chỉ là một marker phát sinh hình thái tổng quát chứ không hẳn là một marker phát sinh phôi. 1.1.3. Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính Có nhiều hệ thống nuôi cấy mô sử dụng 2,4-D như là một chất cảm ứng có hiệu quả trong quá trình phát sinh phôi vô tính. Hiện nay, thừa nhận quan điểm rằng việc xác định trạng thái của tế bào xảy ra trong môi trường có 2,4-D, nhưng trong cùng thời điểm đó thì sự phát triển lại bị ức chế. Việc 2,4-D chỉ là một điểm nút chuyển đổi trạng thái của tế bào thì đã được nhấn mạnh bằng các thí nghiệm sử dụng một hệ thống đặc biệt (nuôi cấy huyền phù các vi mô sẹo) nuôi cấy các tế bào Medicago trong môi trường có bổ sung một loại auxin tổng hợp khác là NAA [Dudits et al., 1991]. Nếu cấy chuyền những tế bào này sang môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng thì chúng sẽ tạo rễ với tần số cao. Nếu những tế bào này được xử lý 2,4-D ở nồng độ cao (100 M) trong một khoảng thời gian ngắn (khoảng vài phút) rồi cấy chuyền sang môi trường không có chất điều hòa tăng trưởng thì chúng sẽ phát triển thành phôi vô tính. Tuy nhiên, phải 2-3 tuần sau khi xử lý thì mới có thể quan sát được những khối phôi đầu tiên trên bề mặt của mô sẹo. Dựa trên cơ sở những thí nghiệm này, hiệu quả phát sinh phôi cao đạt được khi nuôi cấy các mảnh cấy lá mầm cây cà rốt trên môi trường bổ sung 450 M 2,4-D trong thời gian 2 giờ [Kitamiya et al., 2000]. Thực ra, những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng 2,4-D rất cần thiết để khởi sự chương trình phát sinh phôi. Việc cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường không có 2,4D có vai trò quan trọng trong việc thiết lập tính phân cực của tế bào, đây được xem là một trong những sự kiện đầu tiên của quá trình phát triển phôi [Fehér et al., 2003]. 1.1.4. Trạng thái của các tế bào phát sinh phôi vô tính Hình 1.3. Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển của phôi. [Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007] Sự khởi đầu quá trình phát triển phát sinh phôi ở các tế bào đã biệt hóa đòi hỏi một quá trình tái chương trình hóa tế bào hoàn chỉnh. Quá trình này đi kèm với những thay đổi hoàn toàn về mặt hình thái và sinh lý; trong đó, việc tái chương trình hóa kiểu biểu hiện tổng thể của các gene là hết sức quan trọng. Trong những năm gần đây, việc kiểm soát nghiêm ngặt sự cải biến các nhiễm sắc thể phản ứng lại các tín hiệu môi trường và tín hiệu phát triển nhằm xác định chính xác vị trí và thời điểm biểu hiện của các gene này đã được chấp nhận rộng rãi [Li et al., 2002]. Mức độ tổ chức cao của nhiễm sắc thể sẽ tạo ra tính ổn định về kiểu biểu hiện của những gene xác định vùng nào của bộ gene là im lặng hay hoạt động trong tế bào hoặc trong giai đoạn phát triển đang khảo sát. Các bằng chứng thực nghiệm đã chứng tỏ được tầm quan trọng của cấu trúc nhiễm sắc thể trong việc điều hòa sự chuyển vị sinh phôi. Ví dụ, việc bất hoạt một số gene trong bộ nhiễm sắc thể có vai trò quan trọng trong việc quyết định sự sinh trưởng của phôi và nội nhũ của Arabidopsis. Người ta đã xác định được những gene đột biến mã hóa cho những protein tương tự như những protein có chức năng bất hoạt nhiễm sắc thể (nhóm Polycomb trong suốt quá trình phát triển của ruồi giấm) ở Arabidopsis. Kết quả của những đột biến này là sự hình thành hạt hoặc nội nhũ mà không lệ thuộc vào quá trình thụ phấn. Dạng đột biến medea gây ra sự thiếu hụt protein trong cùng một con đường điều hòa. Các kết quả nghiên cứu cho thấy chương trình phát sinh phôi bị ức chế bởi các gene im lặng trong nhiễm sắc thể và sau đó được kích hoạt nhằm đáp ứng với sự thụ phấn. Một dạng đột biến nữa ở Arabidopsis, pickle (pkl), có kiểu hình được xác định dựa trên sự biểu hiện của các marker phôi chuyên biệt trong giai đoạn hậu phát sinh phôi và quá trình tái sinh tự phát của các phôi vô tính ở rễ. Sản phẩm của gene pkl được mô tả như là một nhân tố tái tổ chức nhiễm sắc thể mà có thể ức chế sự biểu hiện của những gene liên quan đến sự phát sinh phôi cũng như điều hòa sự chuyển vị phát triển từ trạng thái phát sinh phôi sang trạng thái sinh dưỡng. Ngoài việc tổ chức nhiễm sắc thể, sự điều hòa trực tiếp của các gene liên quan đến các nhân tố phiên mã đặc hiệu. Cho tới nay, nhiều nhân tố phiên mã (leafy cotyledon 1 và 2, wuschell, baby woom) đã được xác định là có liên quan đến sự phát sinh phôi hợp tử và gây ra sự lệch vị trí trong quá trình hình thành phôi nếu chúng được biểu hiện trong mô sinh dưỡng. Mối liên hệ giữa sự tái tổ chức nhiễm sắc thể và những nhân tố phiên mã này đã được chứng minh bằng cách làm giảm tác dụng ức chế biểu hiện của lec1 trong đột biến pickle, và điều này đã dẫn tới sự phát triển phôi ở rễ. Pickle được nhận định là nhân tố ức chế tế bào phát sinh phôi trong tất cả các mô sinh dưỡng, nhưng người ta cũng đã chứng minh được rằng có thể chọn lọc được những chức năng không ức chế sự phát sinh phôi trong những đột biến pickle. Dựa vào những bằng chứng trên, chúng ta có thể đưa ra giả thiết rằng trong suốt quá trình cảm ứng phát sinh phôi vô tính, sự tái tổ chức của nhiễm sắc thể đã làm giảm chương trình phát sinh phôi, mặt khác bị ức chế bởi các cơ chế bất hoạt nhiễm sắc thể trong các tế bào sinh dưỡng thực vật. Những protein có chứa vùng nhiễm sắc thể có cấu trúc tương tự Polycomb đã được tìm thấy trong quá trình phát sinh phôi hợp tử và phôi vô tính của cà rốt. Ngoài ra, sự biểu hiện của lec1 trong suốt quá trình phát sinh phôi vô tính đã được chứng minh ở cà rốt và cỏ linh lăng [Yazawa et al., 2004]. Cụ thể, với cà rốt, gene c-lec1 xuất hiện trong các mẫu cấy phôi và gene này biểu hiện rõ chỉ 1 ngày sau khi cấy chuyền sang môi trường không có 2,4-D ; trong khi đó, ở cỏ linh lăng, khi gây shock mẫu cấy bằng 2,4-D trong 1 giờ sau nhiều tuần nuôi cấy trong môi trường không có chất điều hòa tăng trưởng, sự biểu hiện của ms-lec1 chỉ gia tăng vào giai đoạn biệt hóa phôi (3 tuần sau khi cảm ứng) [Fehér et al., 2003]. Nghiên cứu này đã củng cố cho giả thuyết rằng ở hệ thống nuôi cấy phát sinh phôi cây cà rốt thì quá trình phát sinh phôi diễn ra trước khi mẫu cấy được cấy chuyền sang môi trường không có 2,4-D.