Tài liệu Khảo sát thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của lá phù dung (hibiscus mutabilis l.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TRÚC KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA LÁ PHÙ DUNG (HIBISCUS MUTABILIS L.) Ngành: Dược liệu và dược học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thầy hướng dẫn: TS. Trần Thị Vân Anh Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nguyễn Thị Phương Trúc ii TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học – Năm học 2016-2018 Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của lá phù dung (Hibiscus mutabilis L.) Nguyễn Thị Phương Trúc Giảng viên hướng dẫn: TS. Trần Thị Vân Anh Đặt vấn đề Cây Phù dung (Hibiscus mutabilis L.) họ Bông (Malvaceae) là cây cảnh được trồng ở nhiều nơi do có hoa đẹp và biến đổi màu sắc trong ngày. Theo kinh nghiệm dân gian, lá và hoa Phù dung được dùng chữa mụn nhọt, sung tấy, kinh nguyệt ra không đều …. Tuy nhiên những đề tài nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của lá cây Phù dung vẫn còn khá ít. Nhằm góp phần đánh giá tác dụng của các cây thuốc dân gian trên cơ sở khoa học, chúng tôi thực hiện đề tài " Khảo sát thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của lá Phù dung (Hibiscus mutabilis L.)" Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: lá Phù dung (Hibiscus mutabilis L.) thu hái ở tỉnh Thái Bình vào tháng 9 năm 2017. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học: chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 96%, chiết phân bố lỏng - lỏng; phân lập các hợp chất bằng kỹ thuật sắc ký cột nhanh, sắc ký cột cổ điển, sắc ký rây phân tử, kết tinh lại trong dung môi thích hợp; kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM; định danh các hợp chất phân lập được bằng các kỹ thuật phổ học (MS, NMR). Phương pháp khảo sát tác dụng kháng viêm: Khảo sát độc tính cấp đường uống của cao chiết lá Phù dung trên chuột nhắt Swiss albino đực và cái, theo dõi tỷ lệ chết và biểu hiện độc tính trong vòng 72 giờ. Tác động phòng và điều trị viêm của cao được xác định trên mô hình gây viêm bàn chân chuột nhắt bằng carrageenan 1%. Kết quả Cao chiết Phù dung không thể hiện độc tính cấp đường uống với liều tối đa có thể cho uống qua kim (Dmax) là 40 g cao. Cao chiết thể hiện tác động phòng viêm cấp trên chuột khi cho uống cao liều 100 mg/kg và 200 mg/kg giúp giảm độ phù bàn chân chuột so với lô chứng bệnh tại các thời điểm khảo sát. Trên mô hình khảo sát tác động điều trị viêm, liều 100 mg/kg của cao chiết Phù dung có tác dụng kháng viêm tốt hơn liều 200 mg/kg. 5 kg bột lá Phù dung chiết ngấm kiệt bằng cồn 96% thu 350 g cao toàn phần. Cao toàn phần được hòa với nước rồi tiến hành lắc phân bố lỏng lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là thu được 40 g cao pethro ether, 7,5 g cao DCM, 9,5 g cao EtOAc và 73 g cao n-BuOH. Cao DCM tiếp tục phân tích bằng phương pháp sắc ký cột nhanh thu được 6 phân đoạn, các phân đoạn được phân tích bằng sắc ký rây phân tử, thu được 3 chất tinh khiết là PD1 (2 mg), PD2 (10 mg), PD3 (2 mg). Cao EtOAc được phân tích bằng sắc ký cột nhanh thu được 9 phân đoạn. Từ các phân đoạn này tiếp tục tinh chế thu được các chất tinh khiết là PD4 (250 mg), PD5 (6 mg), PD6 (4 mg), PD8 (30 mg). Các chất được xác định cấu trúc lần lượt là scopoletin, acid vanillic, 3,4 dehydrotheaspiron, tiliroside, astragalin, isoquercitrin và rutin. Kết luận Cao Phù dung không thể hiện độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng với liều tối đa (Dmax) là 40 g cao/kg. Cao chiết thể hiện tác động dự phòng và điều trị viêm cấp trên chuột nhắt với liều cho uống 100 mg/kg. 7 hợp chất đã được phân lập từ cao cồn có tác dụng kháng viêm, được xác định cấu trúc là scopoletin, acid vanillic, 3,4 dehydrotheaspiron, tiliroside, astragalin, isoquercitrin và rutin. iii Final essay for the degree of MS Pharm. Academic year 2016-2018 INVESTIGATION OF THE CHEMICAL CONSTITUENTS AND ANTI-INFLAMATORY EFFECTs OF HIBISCUS MUTABILIS LEAF Nguyen Thi Phuong Truc Supervisor: Dr. Tran Thi Van Anh Introduction Hibiscus mutabilis (Malvaceae), an ornamental plant with showy flowers, is planted widely. Traditionally, the leaves and flowers of this plant are used for the treatment of inflammation, swelling and menstrual problems….. However, there is few studies on this species was performed. Therefore, the purpose of this study was to investigate the chemical constituents and anti-inflamatory effect of H. mutabilis for having scientific evidences to rationalize the usage of this plant. Material and Methods Material: The leaves of H. mutabilis were collected in Thai Binh province in September 2017. Methods: percolation with EtOH 96%, liquid – liquid extraction; isolation using flash column chromatography, column chromatography, size exclusion chromatography; recrystallization in suitable solvents; checking purity with thin layer chromatography, UPLC; determination the structures of isolated compounds with spectrometry methods (MS and NMR). Oral acute toxicity of H. mutabilis extract was investigated in male and female Swiss albino mice by monitoring mortality and toxicity within 72 hours. Anti-inflammatory effect was determined in 1% carrageenan-induced paw edema mouse model. Results H. mutabilis extract did not show any signs of oral acute toxicity in mice at the maximum dose (Dmax) of 40 g extract/kg. The extract exhibited protective effect against acute inflammation at the oral doses of 100 mg/kg and 200 mg/kg by decreasing hind paw edema in mice compared to pathological control at all tested times. In treatment protocol, the dose of 100 mg/kg showed a better anti-inflammatory effect than 200 mg/kg one. 5 kg dried leaves powder were percolated with EtOH 96% to yield 350 g crude extract. The ethanol extract was suspended in water and partitioned with increasing polarity solvents to yield petroleum ether extract (40 g), dicloromethane extract (7.5 g), 9,5 g ethyl acetate extract (9.5 g) and butanol extract (73 g). The dicloromethane extract was subjected to a vaccum liquid chromatography, then continue to separate by size exclusion chromatography, to obtain 3 compounds PD1, PD2 and PD3, which were determined to be scopoletin (2 mg), acid vanillic (10 mg) and dehydrotheaspiron (2 mg), respectively. The ethyl acetate extract was subjected to difference liquid chromatography method to give 4 compounds PD4, PD5, PD6 and PD8 which were determined to be tiliroside (205 mg), astragalin (6 mg), isoquercitrin (4 mg) and rutin (30 mg), respectively. Conclusion H. mutabilis extract did not show oral acute toxicity in mice at the maximum dose of 40 g/kg This extract exhibited protective and curative effects on inflammation at oral doses of 100 mg/kg and 200 mg/kg in mice. Seven compounds were isolated from H.mutabilis: scopoletin (2 mg), acid vanillic (10 mg) and dehydrotheaspiron (2 mg), tiliroside (205 mg), astragalin (6 mg), isoquercitrin (4 mg) and rutin (30 mg) iv MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .............................................. vi DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ viii DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................. x MỞ ĐẦU............................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 2 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI HIBISCUS ............................................................. 2 1.1.1 Vị trí phân loại chi Hibiscus ...................................................................... 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Hibiscus ............................................................... 2 1.1.3 Tổng quan về thành phần hóa học một số loài trong chi Hibiscus ............ 4 1.1.4. Tổng quan về tác dụng dược lý một số loài trong chi Hibiscus ............... 6 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY PHÙ DUNG (HIBISUS MUTABILIS L.) .......... 10 1.2.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................... 10 1.2.2. Sinh thái và phân bố:............................................................................... 10 1.2.3 Thành phần hóa học ................................................................................. 11 1.2.4. Tác dụng dược lý .................................................................................... 12 1.2.5. Công dụng dân gian ................................................................................ 15 1.3 VIÊM VÀ CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM ........................................................................................................................... 15 1.3.1 Viêm ......................................................................................................... 15 1.3.2. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc ................. 17 1.5.3 Độc tính cấp ............................................................................................. 19 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 21 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................ 21 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 22 2.2.1. Kiểm tra nguyên liệu ............................................................................... 22 2.2.2 Khảo sát tác dụng kháng viêm của cao dược liệu ................................... 23 2.2.3. Chiết xuất, tách phân đoạn: ..................................................................... 25 2.2.4.Phương pháp phân lập .............................................................................. 26 2.2.5 Xác định cấu trúc các chất ....................................................................... 27 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 28 3.1 KIỂM TRA NGUYÊN LIỆU ..................................................................... 28 3.1.1. Khảo sát thực vật..................................................................................... 28 3.1.2. Khảo sát vi học lá Phù dung ................................................................... 29 3.1.3. Xác định độ tinh khiết ............................................................................. 32 3.1.4 Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật trong lá Phù dung .................... 32 3.2. CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU ..................................................................... 34 3.3 KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CẤP ........................................................................................................ 34 v 3.3.1 Kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống ................................................. 34 3.3.2.Kết quả tác dụng phòng viêm cấp ............................................................ 35 3.3.4. Kết quả tác động điều trị viêm cấp ......................................................... 36 3.4 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA LÁ PHÙ DUNG ........ 38 3.4.1 Phân tách cao chiết toàn phần .................................................................. 38 3.3.2. Phân tách cao DCM (Muta-B) ................................................................ 39 3.3.3. Phân tách cao EtOAc (Muta -C) ............................................................. 45 3.5 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT PHÂN LẬP .................................. 56 3.5.1 Kiểm tra độ tinh khiết các chất bằng UPLC ............................................ 56 3.5.2 Xác định cấu trúc chất PD1 ..................................................................... 60 3.5.3 Xác định cấu trúc chất PD2 ..................................................................... 61 3.5.4 Xác định cấu trúc chất PD3 ..................................................................... 62 3.5.5 Xác định cấu trúc chất PD5 ..................................................................... 63 3.5.6 Xác định cấu trúc chất PD4 ..................................................................... 65 3.5.7 Xác định cấu trúc PD6 ............................................................................. 67 3.6.8 Xác định cấu trúc PD8 ............................................................................. 69 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................ 71 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................... 75 Đề nghị .............................................................................................................. 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 77 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ tắt Chữ nguyên Ý nghĩa 13 Cộng hưởng từ hạt nhân C13 1 13 2 1 3 AOA Antioxydant activity 4 ABTS 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6sulfonate) 5 BuOH Butanol 6 CHCl3 Cloroform 7 COSY Correlation spectroscopy 8 DCM Dicloromethan 9 DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl 10 DĐVN Dược điểnViệt Nam 11 DEPT Distortionless Enhancement polarization Transfer 12 DMSO Dimethyl sulfoxide 13 GAE Gallic acide equivalent 14 EtOAc Ethyl acetat 15 FeCl3 10% FeCl3 10% / cồn 96% 16 FRAP Ferric reducing ability of plasma 17 HCOOH Acid formic 18 HPLC High performance liquid chromatography 19 HSQC Heteronuclear SpectroscopyQuantum Coherence 20 IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể 21 IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại 22 LPO Lipid peroxidation 23 MeOH Methanol 24 MS Mass spectrometry C-NMR H-NMR 1 C - Nuclear Magnetic Resonance H - Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân proton Hoạt tính chống oxy hóa by Đương lượng acid gallic Khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp khử sắt Sắc ký lỏng hiệu năng cao Khối phổ vii 25 MTT 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazol brom 26 NF-kB Nuclear Factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B 27 NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 28 PĐ Phân đoạn 29 SEM Standard Error of the Mean 30 SKC Sắc ký cột 31 SKĐ Sắc kí đồ 32 SKLM Sắc ký lớp mỏng 33 TLTK Tài liệu tham khảo 34 TT Thuốc thử 35 UV-vis Ultraviolet and Visible Tử ngoại khả kiến 36 VLC Vacuum Liquid Chromatography Sắc ký cột chân không 37 VS Vanillin- acid sulfuric Độ sai chuẩn của trị số TB viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Vị trí phân loại chi Hibiscus ............................................................... 2 Hình 1.2. Hình hoa các loài trong chi Hibiscus .................................................. 4 Hình 1.3. Một số cấu trúc hóa học các chất có trong chi Hibiscus ..................... 6 Hình 1.4. Toàn cây và hoa Hibiscus mutabilis L ............................................. 11 Hình 1.5. Cấu trúc một số chất tìm thấy trong cây Phù dung ........................... 12 Hình 3.6. Hoa và lá Phù dung ........................................................................... 28 Hình 3.7. Biểu bì trên và dưới của lá Phù Dung ............................................... 29 Hình 1.8. Vi phẫu lá Phù Dung ......................................................................... 31 Hình 3.9. Các cấu tử soi bột lá Phù dung.......................................................... 31 Hình 3.10. Sơ đồ chiết xuất lá Phù dung .......................................................... 34 Hình 3.11. Độ phù bàn chân chuột ở các lô thử nghiệm phòng viêm .............. 36 Hình 3.12. Độ phù bàn chân chuột ở các lô thử nghiệm................................... 37 Hình 3.13. Hình các phân đoạn cao lá Phù dung .............................................. 38 Hình 3.14. Sơ đồ phân tách các cao từ lá Phù dung ......................................... 39 Hình 3.15. Hình sắc ký các phân đoạn của cao B ............................................. 40 Hình 3.16. Kết quả tinh chế phân đoạn B.2 bằng SK rây phân tử .................... 41 Hình 3.17. Hình sắc ký 5 phân đoạn của Muta-B.3 .......................................... 41 Hình 3.18. Hình so sánh Muta-B.2.2 và Muta-B.3.2 ........................................ 42 Hình 3.19. Hình tổng hợp các phân đoạn của B.I qua cột Sephadex................ 42 Hình 3.20. Hình các phân đoạn B.5 .................................................................. 43 Hình 3. 21. Hình tổng hợp các chất phân lập được từ cao B ............................ 44 Hình 3.22. Sơ đồ phân tách cao Muta-B ........................................................... 45 Hình 3.23. Hình tổng hợp 9 phân đoạn phân tách từ Muta-C........................... 46 Hình 3.24. Các phân đoạn của C.2.................................................................... 47 Hình 3.25. Kết quả phân tách phân đoạn C.3 bằng Sephadex LH-20 .............. 48 Hình 3.26. Các phân đoạn của C.4.................................................................... 49 Hình 3.27. Các phân đoạn của C.5.................................................................... 49 Hình 3.28. Hình sắc ký so sánh C.4.3 và C.5.4 ................................................ 50 Hình 3.29. Hình sắc ký các phân đoạn của C.6 ................................................ 51 Hình 3.30. Sắc kí so sánhphân đoạn C.5.6 và C.6.7 ......................................... 51 Hình 3.31. Các phân đoạn của C.8.................................................................... 52 Hình 3.32. Các phân đoạn của C.9.................................................................... 52 Hình 3.33. So sánh giữa C.8.3; C.8.4; C.9.2; C.9.3 .......................................... 53 Hình 3.34.Kết quả phân tách C.III qua cột silicagel ......................................... 54 Hình 3.35. Quy trình phân lập các chất từ cao ethyl acetate ( Muta-C) ........... 55 Hình 3.36. Hình tổng hợp các chất phân lập được từ cao C ............................. 56 ix Hình 3.37. Kết quả kiểm tinh khiết các chất PD1 – PD8 ................................. 59 Hình 3.38. Cấu trúc chất PD1 (scopoletin) ....................................................... 61 Hình 3.39: Cấu trúc chất PD2 (acid vanilic) ..................................................... 62 Hình 3.40. Cấu trúc chất PD4 và một số tương tác HMBC quan trọng ........... 63 Hình 3.41.: Cấu trúc chất PD5 (astragalin) ....................................................... 65 Hình 3.42. Cấu trúc nhánh coumaroyl .............................................................. 65 Hình 3.43. Cấu trúc tiliroside ............................................................................ 67 Hình 3.44. Cấu trúc isoquercitrin ...................................................................... 69 Hình 3.45. Cấu trúc rutin .................................................................................. 70 x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Mô tả thực vật một số loài trong chi Hibiscus.................................... 3 Bảng 1.2. Tổng hợp tác dụng dược lý một số loài trong chi Hibiscus ............... 9 Bảng 3.3. Kết quả thử tinh khiết bột lá Phù dung ............................................. 32 Bảng 3.4. Hàm lượng chất chiết được của dược liệu lá Phù dung.................... 32 Bảng 3.5. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết từ lá ........... 32 Bảng 3.6. Sự thay đổi độ phù chân chuột theo thời gian giữa các lô................ 35 Bảng 3.7. Sự thay đổi độ phù chân chuột theo thời gian giữa các lô................ 37 Bảng 3.8. Kết quả lắc phân bố lỏng lỏng cao lá Phù dung ............................... 38 Bảng 3.9. Kết quả sắc ký cột nhanh phân đoạn cao B ...................................... 40 Bảng 3.10. Kết quả chạy sắc ký rây phân tử B.2 .............................................. 41 Bảng 3.11.Kết quả các phân đoạn của B.3 ....................................................... 41 Bảng 3.12. Kết quả các phân đoạn sắc ký rây phân tử của B.I ........................ 42 Bảng 3.13. Kết quả các phân đoạn của B.5 ...................................................... 43 Bảng 3.14. Kết quả 9 phân đoạn của Muta-C ................................................... 46 Bảng 3.15. Kết quả các phân đoạn của C.2 ...................................................... 47 Bảng 3.16. Kết quả các phân đoạn của C.3 ...................................................... 48 Bảng 3.17. Kết quả các phân đoạn của C.4 ...................................................... 48 Bảng 3.18. Kết quả các phân đoạn của C.5 ...................................................... 49 Bảng 3.19. Kết quả các phân đoạn của C.6 ...................................................... 50 Bảng 3.20. Kết quả các phân đoạn của C.8 ...................................................... 51 Bảng 3.21. Kết quả chạy sắc ký rây phân tử của C.9 ....................................... 52 Bảng 3.22. Kết quả chạy sắc ký cột cổ điển của C.III ...................................... 54 Bảng 3.23. Tổng kết các chất phân lập được .................................................... 56 Bảng 3.24. Kết quả kiểm tinh khiết các chất .................................................... 59 Bảng 3.25. Dữ liệu phổ PD1 (CDCl3, 125/500 MHz) và scopoletin (CD3OD 400 MHz) .......................................................................................................... 60 Bảng 3.26. Dữ liệu phổ chất PD2 (MeOD, 125/500 MHz) và acid vanillic (DMSO-d6, 125/500 MHz) ............................................................................... 61 Bảng 3.27. Dữ liệu phổ 13C – NMR (125 MHz) và 1H–NMR (500 MHz) của PD3 đo trong CDCl3 ......................................................................................... 63 Bảng 3.28. Dữ liệu phổ PD5 (MeOD; 125/500 MHz) và astragalin (DMSO-d6 + D2O; 125/500 MHz)....................................................................................... 64 Bảng 3.29. Dữ liệu phổ chất PD2 (MeOD, 125/500 MHz) và tiliroside (DMSOd6; 125/500 MHz).............................................................................................. 66 Bảng 3.30. Dữ liệu phổ PD6 (MeOD; 125/500 MHz) và isoquercitrin (MeOD) ........................................................................................................................... 68 Bảng 3.31. Dữ liệu phổ PD8 ( MeOD; 125/500 MHz) và rutin (DMSO-d6; 125/500 MHz) ................................................................................................... 70 xi 1 MỞ ĐẦU Từ hàng nghìn năm trước, con người đã biết dựa vào thiên nhiên để sinh sống, phát triển và điều trị bệnh. Con người biết phát hiện, chắt lọc những tinh tuý từ cây cỏ và sinh vật tồn tại trong tự nhiên để tạo ra những bài thuốc nâng cao sức khoẻ và điều trị bệnh cho mình. Cùng với sự phát triển kinh tế - xã hội, nhu cầu sử dụng các loại thuốc đông dược trong điều trị bệnh, chăm sóc sức khoẻ người dân ngày càng được khẳng định. Gần đây trong nước và trên thế giới đã có xu hướng quay về thiên nhiên trong việc phòng bệnh, cải thiện sức khỏe và điều trị những bệnh mãn tính. Nhiều sản phẩm và những chiết xuất từ thiên nhiên không chỉ được các nhà y học Phương Đông quan tâm mà còn gây sự chú ý và tham gia của các nhà y học Phương Tây. Rất nhiều cây thuốc dân gian có thể tìm thấy trong vườn nhà nhưng có công dụng không thua kém các loại thuốc tổng hợp. Cây Phù dung (Hibiscus mutabilis L.) họ Bông (Malvacaea) là cây mọc hoang và được trồng ở nhiều nơi để làm cảnh. Cây còn có rất nhiều tên khác, như "mộc phù dung", "mộc liên", "cự sương", "sương giáng", "túy tửu phù dung", "đại diệp phù dung", "địa phù dung", "thủy phù dung", "thất tinh"... Phù dung có hoa thay đổi màu sắc vào thời điểm khác nhau trong ngày nên thường được trồng làm cảnh. Ngoài ra vỏ thân Phù dung có thể dùng để bện thừng, dệt vải hoặc làm giấy; đặc biệt lá và hoa tươi hoặc khô được dùng để làm thuốc Theo kinh nghiệm dân gian, lá và hoa Phù dung được dùng chữa mụn nhọt, sung tấy, kinh nguyệt ra không đều. Ở Trung Quốc, lá và hoa Phù dung dùng giải nhiệt giải độc, chữa ho lâu ngày, thuốc giảm đau chữa vết bỏng…. Tuy nhiên những đề tài nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của lá cây Phù dung vẫn còn khá ít. Nhằm góp phần đánh giá tác dụng của các cây thuốc dân gian trên cơ sở khoa học, chúng tôi thực hiện đề tài " Khảo sát thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của lá Phù dung (Hibiscus mutabilis L.)" với mục tiêu: - Kiểm tra nguyên liệu lá cây Phù dung - Khảo sát thành phần hoá học của lá cây Phù dung - Đánh giá tác dụng kháng viêm của cao chiết lá Phù dung trên mô hình chuột gây viêm - Phân lập và xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất chính từ lá Phù dung 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI HIBISCUS. 1.1.1 Vị trí phân loại chi Hibiscus. Theo hệ thống phân loại Takhtajan, vị trí phân loại thực vật của chi Hibiscus. như sau [5] Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ Bông (Malvales) Họ Bông (Malvacaea) Chi Dâm bụt (Hibiscus) Hình 1.1. Vị trí phân loại chi Hibiscus 1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Hibiscus Chi Dâm bụt, chi Râm bụt hay chi Phù dung (danh pháp khoa học: Hibiscus) là một chi lớn chứa khoảng 275 loài thực vật có hoa trong họ Bông (Malvaceae), có nguồn gốc ở khu vực ôn đới ấm, cận nhiệt đới và nhiệt đới trên khắp thế giới. [4] Chi này bao gồm các loại cây thân thảo sống một đến nhiều năm giống như các loại cây bụi thân gỗ và cây thân gỗ nhỏ. Hầu hết các loài dâm bụt có nhiều màu sắc với đặc điểm màu đậm ở tâm tràng hoa ( Lowry, 1976). Lá của chi Dâm bụt khá đơn giản, mọc so le, loại lá đơn hình trứng hay hình mũi mác, thông thường với mép lá dạng răng cưa hay dạng thùy, có thể có lá kèm. Hoa mở đối xứng với đài hình chén, hoa lớn, dễ thấy, hình kèn, với 5 cánh hoa, có màu từ trắng tới hồng, đỏ, tía hay vàng và rộng từ 4–15 cm năm cánh hoa dính ở chân. Quả là loại quả nang năm thùy khô, chứa vài hạt trong mỗi thùy, được giải phóng khi quả nang tách ra khi chín [9]. Trong khu vực ôn đới, loài được trồng làm cảnh nhiều nhất có lẽ là Hibiscus syriacus. Tại khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, Hibiscus rosa-sinensis với nhiều giống lai có hoa sặc sỡ, là loại cây cảnh phổ biến. 3 Ở Việt Nam có khoảng 22 loài thuộc chi Hibiscus, trong đó có một số loài thông dụng như sau [8]: Bảng 1.1. Mô tả thực vật một số loài trong chi Hibiscus STT 1 2 3 4 5 Tên khoa học Tên Việt Mô tả Nam Hibiscus Bụp đông Cây cỏ một năm, cao đến 3,5 m; ít nhánh. Lá có cannabinus L. Ấn độ phiến to 10-15 cm, chia thuỳ 0-3-5, gần như không có lông; cuống dài. Hoa đơn độc ở nách lá vành trắng hay ngà, đỏ đậm ở tâm. Quả nang tròn, có lông, có thể gây ngứa. Hibiscus rosa- Dâm bụt Cây nhỏ 2-4 m. Lá có phiến không lông, bìa có sinensis L. răng to. Hoa đơn độc ở nách lá, to, đỏ hay ngà; cọng rất dài (10-15 cm); đài hình ống 5 răng, cánh hoa dài 5-7 cm; ống tiểu nhuỵ dài 5-8 cm; như nhung. Quả nang. Hibiscus Bụp giấm Cây cỏ cao đến 3 m, ít nhánh; thường có màu tía. sabdariffa L. Lá có 3-5 thuỳ thon nhọn, bìa có răng, không lông. Hoa ở nách lá; cọng ngắn; đài phụ mập đỏ và rất chua tồn tại ở quả; vành vàng hay trắng với tâm đỏ. Hibiscus Bụp hồng Cây nhỏ cao 3-4 m. Phiến xanh đậm, không lông, syriacus L. cận có thuỳ hay không, lá bẹ mau rụng. Hoa đứng, có cọng ngắn; lá đài phụ hẹp, cứng; vành màu tím, ít khi trắng. Hibiscus Bụp tra Đại môc nhỏ. Lá có phiến hình tim, láng mặt trên, tiliaceus L. hơi trắng mặt dưới; gân chính có 1-3 tuyến ở mặt dưới; lá bẹ to, dài, mau rụng. Hoa đơn độc; vành vàng tươi tâm đỏ. Hoa Hibiscus cannabinus L.[69] Hoa Hibiscus rosa-sinensis L [70] 4 Hoa Hibiscus sabdariffa L.[71] Hoa Hibiscus syriacus L. [72] Hoa Hibiscus tiliaceus L. [73] Hình 1.2. Hình hoa một số loài trong chi Hibiscus 1.1.3 Tổng quan về thành phần hóa học một số loài trong chi Hibiscus Các nghiên cứu sơ bộ về hóa học của các loài trong chi Hibiscus cho thấy sự hiện diện của các nhóm hợp chất như tannin, phlobatannin, glycosid tim, flavonoid, terpenoid, saponin và các chất khác có mặt trong lá, thân và rễ của cây. Hoa chứa anthocyanidin. Ở loài H. platanifolius chỉ mới có nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học, kết quả cho thấy sự hiện diện của carbohydrate, gôm, protein, acid amin, steroid, alkaloid, tannin và flavonoid.[41] Một số loài như H. rosa-sinensis, H. sabdariffa., H. platanifolius, H. cannabinus., H. tiliaceus., đã có những nghiên cứu chi tiết hơn, đã phân tích được cấu trúc một số hợp chất thuộc nhóm flavonoid, phenolic và các hydrocarbon mạch dài, các acid hữu cơ… Nhóm acid hữu cơ Một số nghiên cứu báo cáo H. rosa-sinensis có các acid như: niacin, ascorbic, citric, tartaric và acid oxalic [41]. Theo nhiều nghiên cứu loài H. sabdariffa. có các thành phần hóa học như hydroxycitric, acid hibiscus, acid hibiscus 6-methyl ester [17]. 5 Hydrocarbon mạch dài Năm 2006, 4 chất (n-hexacosa-3-one-20, 21-diol; n-triacontan; n-triacontan-15-one và n – hentriacontan) đã được phân lập từ dịch chiết ethanol lá và hoa của H.rosasinensis. [41] Các flavonoid và phenolic Một số nghiên cứu đã báo cáo H. rosa-sinensis có chứa flavonoid, cyanidin, quercetin [41] Năm 2011 Ho Sik-Rho và cộng sự đã phân lập được 4 flavonol từ lá của H.cannabinus L. bao gồm: kaempferol, kaempferitrin (kaempferol-3,7-O-αdirhamnoside), α-rhamnoisorobin (kaempferol 7-O-α-L rhamnopyranoside), và afzelin (kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranoside) [54]. Theo nhiều nghiên cứu loài H. sabdariffa. có flavonoid như quercetin-3-sambioside, quercetin-3-rutinoside, acid 5-O-caffeoylshikimic, leucoside (kaempferol-3-Osambubioside), quercetin-3-O-glucoside, kaempferol-3-O-rutinoside, myricetin, quercetin, kaempferol-3-glucoside; các anthocyanidin gồm delphinidin-3sambubioside, cyanidin-3-sambubioside; phenolic gồm acid gallic, acid chlorogenic, 5-hydroxymethylfurfural, methyl gallate 2-O-trans-acid caffeoyl-hydroxicitric, acid 5-caffeoylquinic, myricetin-3-arabinogalactoside, acid 3-caffeoylquinic, acid protocatechuic, acid protocatechuic glucoside, acid coumaroylquinic [17]. n-hexacosa-3-one-20,21-diol n-triacotan-15-one n-triacotan 6 Acid hydroxycitric Acid hibiscus R = OH Acid gallic R=H Acid protocatechuic Quercitrin R1 = Rhamnose, R2 = H Rhamnoisoropin R1 = H, R2 = Rhamnose Acid citric Cyanidin Kaempferol R1 = H Afzelin R1 = Rhamnose Hình 1.3. Một số cấu trúc hóa học các chất có trong chi Hibiscus 1.1.4. Tổng quan về tác dụng dược lý một số loài trong chi Hibiscus Nhiều loài trong chi Hibiscus thể hiện các tác dụng dược lý rõ rệt, nổi bật là tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng viêm và kháng khuẩn. Về tác dụng kháng viêm, một số loài sau đây đã chứng minh khả năng kháng viêm bằng nhiều mô hình nghiên cứu khác nhau. Loài Hibiscus tiliaceus L. Năm 2009, Narender và cộng sự đã có nghiên cứu đánh giá tác dụng kháng viêm của các dịch chiết từ lá H.tiliaceus bao gồm dịch chiết methanol, ether dầu hỏa và dịch chiết chloroform. Thử nghiệm tiến hành theo mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan. Chuột được chia thành năm nhóm, mỗi nhóm gồm sáu con chuột. Nhóm đối chứng được cho uống 2,5 ml/kg nước muối, nhóm chứng dương được dùng natri diclofenac (50 7 mg/kg) và các nhóm thử nghiệm uống dịch chiết liều 250 và 500 mg/kg. Ba mươi phút sau khi dùng các dịch chiết khác nhau, carrageenan (0,1 ml 1% kl/tt) dạng huyền phù được tiêm vào chân trái phía sau của chuột. Thể tích chân chuột được đo vào giờ thứ 2 và thứ 3 sau khi tiêm carrageenan. Nhóm chuột uống dịch chiết không có chuột nào chết ngay cả ở liều cao nhất (5000 mg/kg, đường uống) đo đó các liều thử nghiệm (5, 50 và 500 mg/kg) của H. tiliaceus là an toàn. Các dịch chiết methanol, ether dầu hỏa và chloroform từ lá H tiliaceus với liều 250 và 500 mg/kg ức chế đáng kể (p <0,05) sự phù chân chuột do carragennan [46]. Loài Hibiscus cannabinus L. Năm 2011 Ho Sik Rho. và cộng sự đã phân lập kaemferol và kaemferol rhamnoside từ lá H. cannabinus và nghiên cứu về tác dụng kháng viêm của các chất này. Hoạt tính chống viêm được đánh giá bằng cách đo nồng độ nitric oxide (NO) và hoạt động của NF-κB thể hiện qua hiện diện của enzyme luciferase trên mô hình tế bào RAW264.7 kích thích bởi LPS (lipopolysaccharide). Tác dụng kháng viêm của kaempferol và kaempferol rhamnosid liên quan đến khả năng ức chế quá trình sản xuất NO và ức chế hoạt tính trung gian NF-κB, IκBα được sử dụng làm chất chứng dương. Hoạt tính ức chế NO giảm theo thứ tự kaempferol, α-rhamnoisorobin, afzelin và kaempferitrin. Hợp chất kaempferol (IC50 = 15,4 μM) và α-rhamnoisorobin (IC50 = 37,7 μM) cho thấy hoạt tính ức chế NO mạnh mà không gây độc tế bào. Chất afzelin có đường rhamnose ở vị trí 3 gây giảm hoạt động ức chế NO. Ảnh hưởng của kaempferol và các glycoside của nó trên hoạt tính NF-κB cũng được đánh giá. Kaempferol và α-rhamnoisorobin cũng ức chế hoạt tính trung gian của NFκB. Tuy nhiên, thứ tự hoạt động của hai hợp chất là khác nhau. Hợp chất αrhamnoisorobin (IC50 = 36,2 μM) mạnh hơn kaempferol (IC50 = 90,3 μM). [54] Loài Hibiscus sabdariffa L. Năm 2013, Meraiyebu và cộng sự đã nghiên cứu về tác dụng kháng viêm của lá H. sabdariffa. Nghiên cứu này được tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng viêm từ dịch chiết methanol của lá H. sabdariffa ở chuột Wistar trưởng thành. Tổng cộng 25 chuột cả đực và cái có trọng lượng từ 180 - 200 g được chia ngẫu nhiên thành năm nhóm mỗi nhóm năm con. Nhóm I được uống 1 ml nước cất để làm lô chứng, Nhóm II được gây viêm bằng cách sử dụng carrageenan (0,1 ml/kg) và không điều trị, Nhóm III và IV lần lượt nhận dịch chiết H. sabdariffa liều thấp (250 mg/kg) và liều cao (500 mg/kg) tương ứng sau khi được gây viêm, nhóm chứng dương được 8 điều trị bằng diclofenac (20 mg/kg) sau khi gây viêm bằng carrageenan. Độ phù bàn chân của mỗi con chuột được đo trước, sau khi viêm và sau khi điều trị. Kết quả có sự giảm đáng kể (p <0,05) độ phù bàn chân chuột ở nhóm nhận liều cao (500 mg/kg) dịch chiết methanol của H. sabdariffa với giá trị trung bình ± SEM từ 0,566 ± 0,023 đến 0,414 ± 0,009 so với nhóm không được điều trị. Nghiên cứu cho thấy rằng điều trị bằng dịch chiết methanol lá H. sabdariffa ở liều thấp (250 mg/kg) không có tác dụng giảm phù, nhưng đã có sự giảm phù chân ở liều cao (500 mg/kg). Việc giảm phù chân trong nhóm liều cao cho thấy chiết xuất methanol của H. sabdariffa có hoạt tính kháng viêm chống lại yếu tố gây viêm carrageenan tương tự như tác dụng của diclofenac. Do đó dịch chiết methanol của H. sabdariffa có tiềm năng trong việc điều trị viêm [38]. Năm 2017. một nghiên cứu của nhóm tác giả Mohamed I. Gabi thực hiện khảo sát tác dụng kháng viêm in vitro của dịch chiết methanol từ hoa H.sabdariffa. Một số mô hình nghiên cứu kháng viêm in vitro như ức chế sự biến tính albumin và xét nghiệm ổn định màng tế bào được thực hiện với dịch chiết methanol. Enzyme lysosomal được giải phóng trong quá trình viêm, enzyme này được cho là có liên quan đến viêm nhiễm cấp tính hoặc mãn tính. Các loại thuốc kháng viêm không steroid điều trị bằng khả năng ức chế các enzyme lysosomal hoặc ổn định các màng lysosomal. Vì màng hồng cầu người tương tự như màng lysosomal, nên từ việc xác định các dịch chiết có khả năng ổn định màng tế bào hồng cầu người có thể dự đoán tác dụng kháng viêm của dịch chiết. Chiết xuất từ H. sabdariffa ức chế sự phá hủy màng tế bào hồng cầu ở mức độ khác nhau. Cao methanol cho thấy khả năng tác dụng là 35,79%, 14,31%, 13,88% và 7,65% ở nồng độ 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 và 12,5 μg/ml tương ứng. Diclofenac là chất chống viêm chuẩn cho thấy sự ức chế tối đa 86,75% ở nồng độ 200 μg/ml Biến tính protein là một quá trình trong đó protein bị mất cấu trúc ban đầu của chúng bởi tác nhân bên ngoài, chẳng hạn như acid hoặc bazơ mạnh, muối vô cơ, dung môi hữu cơ hoặc nhiệt. Hầu hết các protein sinh học đều mất chức năng sinh học của chúng khi bị biến tính. Sự biến tính của protein là nguyên nhân gây viêm. Đây là một cơ sở để nghiên cứu cơ chế hoạt động chống viêm, khả năng tách chiết protein đã được nghiên cứu. Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế biến tính protein của dịch chiết methanol H. sabdariffa tối đa 51,2% ở liều 100 μg/mL, các liều 50, 25 và 12,5 μg/mL có khả năng ức chế lần lượt là 34,55%, 28,67% và 18,62%, chứng dương là diclofenac có khả năng ức chế 76,04% ở nồng độ 200 μg/ml.