Tài liệu Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng sinh học của vỏ thân cây quăng (alangium salviifolium l.f.wang., alangiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- BÙI HOÀNG MINH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA VỎ THÂN CÂY QUĂNG (ALANGIUM SALVIIFOLIUM L.F. WANG., ALANGIACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- BÙI HOÀNG MINH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA VỎ THÂN CÂY QUĂNG (ALANGIUM SALVIIFOLIUM L.F. WANG., ALANGIACEAE) Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. TRẦN HÙNG TP HỒ CHÍ MINH - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Bùi Hoàng Minh TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC KHÓA 2016 – 2018 Chuyên ngành: Dược liệu –Dược học cổ truyền, mã số: 8720206 Tên đề tài: Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng sinh học của vỏ thân cây Quăng (Alangium salviifolium (L.f) Wang., Alangiaceae) Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trần Hùng Học viên thực hiện: Bùi Hoàng Minh Mở đầu: Các công trình khoa học trên thế giới về loài Alangium salviifolium (L.f) Wang., Alangiaceae cho thấy nhiều tác dụng dược lý đáng quý. Tuy nhiên hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về loài cây này tại Việt Nam. Đề tài tiến hành phân lập các thành phần hóa học có trong vỏ thân Alangium salviifolium (L.f) Wang. theo định hướng của tác dụng sinh học nhằm cung cấp thêm thông tin và góp phần chứng minh tác dụng của cây thuốc này. Đối tượng nghiên cứu: Vỏ thân cây Quăng (Alangium salviifolium (L.f) Wang.) thu hái tại Quảng Ngãi (07/2016). Phương pháp nghiên cứu: Định danh, lựa chọn nguyên liệu, khảo sát đặc điểm thực vật, kiểm tra độ tinh khiết; Khảo sát hóa học theo định hướng của tác dụng chống oxy hóa (mô hình DPPH, ức chế xanthin oxydase) và độc tế bào (mô hình MTT với 3 dòng tế bào MDA-MB 231, RD, HepG2). Phân lập, tinh chế, định danh và đánh giá hoạt tính sinh học các chất phân lập được. Kết quả: Xác định nguyên liệu: Định danh nguyên liệu chính xác là vỏ thân cây Quăng bằng hình thái thực vật và ADN. Chiết tách và đánh giá tác dụng sinh học các cao chiết, phân đoạn: Từ 10 kg vỏ thân cây Quăng, bằng phương pháp chiết ngấm kiệt thu được 554 g cao cồn. Bằng chiết phân bố rắn – lỏng cao cồn, đã thu được 50 g phân đoạn DCM, 31 g phân đoạn EtOAc, 408 g phân đoạn MeOH. Phân đoạn alkaloid toàn phần (30 g) được tách ra từ phân đoạn MeOH cho tác dụng sinh học tốt nhất trên cả 3 mô hình. Phân lập và xác định cấu trúc: Từ 31 g phân đoạn EtOAc qua sắc ký cột quá tải kết hợp kết tinh phân đoạn thu được 4 kết tinh. Thông qua các kỹ thuật phổ đã định danh được acid betulinic (A2a, 30 mg), demethylalangisid (A2e, 25 mg) cùng với hỗn hợp (1:1) của stigmasterol-3-O-glucosid và β-sitosterol-3-O glucosid (124 mg) và 1 chất (A2c, 34 mg) hiện đang được định danh. Từ 30 g phân đoạn alkaloid toàn phần, bằng các kỹ thuật sắc ký cột kết hợp với HPLC điều chế đã thu được 2 chất. Bằng các kỹ thuật phổ, cấu trúc được đề nghị lần lượt là psychotrin (Aa1, 14 mg) và demethylpsychotrin (Aa3, 17 mg). Thử tác dụng sinh học: Demethylalangisid cho khả năng ức chế mạnh DPPH (IC50 = 31,36 µM), trong khi demethylpsychotrin ức chế xanthin oxydase với IC50 = 23,8 µM tương đương với allopurinol; psychotrin độc với tế bào ung thư HepG2 với IC50 = 9,83 µM. Việc thử nghiệm về tác dụng sinh học trên các chất tinh khiết và phân lập chất khác từ các phân đoạn giàu tiềm năng vẫn đang được tiếp tục. SUMMARY THESIS OF MASTER OF PHARMACY – Course: 2016 – 2018 Major: Traditional Pharmacy – Code: 8720206 BIOASSAY-GUIDED PHYTOCHEMICAL STUDY OF CONSTITUENTS FROM TRUNK BARK OF Alangium salviifolium (L.f.) Wang., Alangiaceae Instructor: Tran Hung, Assoc. Prof., Dr Student: Bui Hoang Minh Introduction: Alangium salviifolium (L.f) Wang. has been known to have potential efficacy against numbers of diseases. However, there is no study about this plant in Viet Nam so far. This study was conducted to isolated of bioactive compounds from trunk bark of A. saviifolium by bioassay-guided fractionation as first step to prove the usefulness of this plant. Materials: Trunk bark of Alangium salviifolium (L.f) Wang. was collected on 10/2016 in Quang Ngai. Methods: Extraction, seperation, isolation and purification were done as routine works. Structure elucidation was based on NMR and MS spectrometric methods. In vitro screening of fractions for antioxidant (DPPH and xanthin oxidase inhibitory activities) and cytotoxic activities (with 3 cell lines MDA-MB 231, RD, HepG2) were performed as in literatures. Results: Bio-assay screening of ethanolic extract and its fractions: From 10 kg of truck bark powder, 554 g of 96% ethanolic extract was obtained. It was further solid-liquid partioned between Silica gel and succesively solvents to obtain DCM (50 g), EtOAc (31 g), and MeOH (408 g) fractions. From MeOH fraction, 30g of total alkaloid subfraction was obtained. In vitro antioxidative and cytotoxic activities on EtOH extract, CHCl3, EtOAc, MeOH and total alkaloid fractions revealed that the alkaloid fraction had the highest reduce ability and cytotoxic activity. Chemical composition : EtOAc extract (31 g) was further separated by overloaded-column to obtain 10 fractions. Betulinic acid (A2a, 30 mg), a mixture of stigmasterol-3-O-glucosid và β-sitosterol-3-O glucosid (A2b, 124 mg) and demethylalangisid (A2e, 25 mg) were isolated from these fractions by fractional crystallization. From 30 g of total alkaloid sub-fraction, psychotrin (Aa1, 14 mg) and demethylpsychotrin (Aa3, 17 mg) were isolated and characterizated by CC combined with pep-HPLC. IC50 of isolated compounds in DPPH and cytotoxic models: Demethylalangisid showed high ability in DPPH radical scavenging (IC50 = 31,36 µM) while demethylpsychotrin had the same result in xanthin oxydase inhibitory (in comparison with allopurinol) and psychotrin proved its potential cytotoxic effect (IC50 = 9,83 µM) on HepG2 cell line. Conclusion: A. salviifolium (L.f) Wang. has potential activities on treatment diseases such as cancer, gout, hepatitis... Further studies on constituents and activities of this plant are in process. i MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................ iv DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................. vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................. viii ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU .......................... 3 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ...............................................................3 1.1.1. Thực vật học .....................................................................................................3 1.1.2. Thành phần hóa học: .......................................................................................7 1.1.3. Tác dụng dược lý ............................................................................................11 1.1.4. Một số kinh nghiệm sử dụng cây Quăng trong dân gian ...............................18 Gốc tự do và một số mô hình thử tác động chống oxy hóa .........................18 1.2.1. Gốc tự do ....................................................................................................18 1.2.2. Một số mô hình thử tác động chống oxy hóa ..........................................19 Tổng quan về bệnh ung thư ...........................................................................20 1.3.1. Khái niệm .......................................................................................................20 1.3.2. Các mô hình nghiên cứu khảo sát độc tính trên tế bào ..................................20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................23 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.....................................................................................23 2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị ...................................................................................23 2.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................25 2.2.1. Xác định nguyên liệu ......................................................................................25 2.2.2. Kiểm tinh khiết ...............................................................................................26 2.2.3. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật trong vỏ thân Alangium salviifolium ........................................................................................................................26 2.2.4. Chiết xuất và phân lập ...................................................................................26 ii 2.2.5. Xác định cấu trúc chất phân lập được ...........................................................28 2.2.6. Sàng lọc sinh học............................................................................................28 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ............................................................................. 33 3.1. Khảo sát thực vật học .....................................................................................33 3.1.1. Khảo sát đặc điểm hình thái...........................................................................33 3.1.2. Khảo sát đặc điểm vi học ...............................................................................33 3.1.3. Định danh bằng phương pháp giải trình tự ADN ..........................................37 3.2. Kiểm tra độ tinh khiết ....................................................................................37 3.3. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật ......................................................38 3.4. Nghiên cứu hóa học theo định hướng tác dụng sinh học ............................38 3.4.1. Đánh giá tác dụng sinh học của 3 bộ phận dùng (lá, vỏ thân và rễ) .............38 3.4.2. Chiết các phân đoạn từ cao cồn vỏ thân Alangium salviifolium ...................39 3.4.3. Phân tách các phân đoạn từ phân đoạn EtOAc (A2) .....................................44 3.4.4. Phân tách các phân đoạn từ phân đoạn alkaloid toàn phần (Aa) .................47 3.4.5. Phân tách các phân đoạn từ Aa.2 ..................................................................52 3.4.6. Phân tách các phân đoạn từ Aa.2.3 ...............................................................55 3.4.7. Phân tách các phân đoạn từ Aa.3 ..................................................................57 3.4.8. Phân tách các phân đoạn từ Aa.3.3 ...............................................................60 3.5. Phân lập ...........................................................................................................62 3.5.1. Phân lập A2a từ A2.1 .....................................................................................62 3.5.2. Phân lập A2b từ A2.3 và A2.4 ........................................................................62 3.5.3. Phân lập A2c từ A2.6 .....................................................................................62 3.5.4. Phân lập A2e từ A2.10 ...................................................................................63 3.5.5. Phân lập Aa1 từ Aa ........................................................................................63 3.5.6. Phân lập Aa3 từ Aa.8 .....................................................................................63 3.6. Xác định độ tinh khiết và cấu trúc các chất phân lập được .......................63 3.6.1. Chất A2a .........................................................................................................63 iii 3.6.2. Chất A2b .........................................................................................................65 3.6.3. Chất A2e .........................................................................................................67 3.6.4. Chất Aa3 .........................................................................................................72 3.6.5. Chất Aa1 .........................................................................................................77 3.6.6. Chất A2c .........................................................................................................80 3.6.7. Tổng kêt kết quả phân lập ........................................................................82 3.7. Thử nghiệm tác dụng sinh học một số chất phân lập được ........................83 3.7.1. Mô hình DPPH ...............................................................................................83 3.7.2. Ức chế xanthin oxydase..................................................................................84 3.7.3. Độc tế bào ......................................................................................................84 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................... 86 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 89 Kết luận ....................................................................................................................89 Đề nghị......................................................................................................................90 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 91 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC .................................................................. PL.1 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Bảng thống kê đặc điểm một số loài thuộc chi Alangium có ở châu Á .......3 Bảng 1.2 Một số alkaloid có trong các bộ phận loài Alangium salviifolium ............8 Bảng 2.1 Các loại mẫu cho thử nghiệm in vitro mô hình DPPH ..............................30 Bảng 2.2 Các loại mẫu dùng cho thử nghiệm in vitro tác dụng ức chế xanthin oxidase ...................................................................................................................................31 Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của bột vỏ thân cây Quăng .......................38 Bảng 3.2 Bảng kết quả khảo sát hóa thực vật vỏ thân cây Quăng ............................38 Bảng 3.3 Khả năng ức chế xanthin oxydase của 3 cao cồn (Lá, Vỏ thân, Rễ) .........39 Bảng 3.4 Khả năng ức chế của cao cồn vỏ thân và rễ trên 3 dòng tế bào ung thư ...39 Bảng 3.5 Phần trăm ức chế xanthin oxidase (%) của các cao ...................................42 Bảng 3.6 Kết quả % ức chế của các phân đoạn trên 3 dòng tế bào ung thư .............42 Bảng 3.7 Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột quá tải A2.........................45 Bảng 3.8 Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột quá tải phân đoạn Aa .......49 Bảng 3.9 Kết quả khả năng ức chế xanthin oxydase của các cao phân đoạn Aa.1-9 ...................................................................................................................................51 Bảng 3.10 Kết quả khả năng ức chế tế bào ung thư HepG2 của các phân đoạn Aa.1Aa.9 ...........................................................................................................................51 Bảng 3.11 Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển Aa.2 ...................53 Bảng 3.12 Kết quả khả năng ức chế xanthin oxydase của các cao phân đoạn Aa.2.1Aa.2.5 ........................................................................................................................55 Bảng 3.13 Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển Aa.2.3 ................57 Bảng 3.14 Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển Aa.3 ...................58 Bảng 3.15 Kết quả khả năng ức chế xanthin oxydase của các phân đoạn Aa.3.1-Aa.1.5 ...................................................................................................................................60 Bảng 3.16 Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển Aa.3.3 ................62 Bảng 3.17 Bảng so sánh phổ NMR của A2a và acid betulinic .................................65 Bảng 3.18 Bảng so sánh phổ 13 C-NMR của A2b và Stigmasta-5,22-dien-3-β-O- glucopyranosid ..........................................................................................................66 v Bảng 3.19 Dữ liệu phổ NMR của A2e ......................................................................69 Bảng 3.20 Bảng so sánh phổ 13 C-NMR của A2e và demetylalangisid (trích vùng aglycon) .....................................................................................................................71 Bảng 3.21 Dữ liệu phổ NMR của Aa3 (MeOD) .......................................................73 Bảng 3.22 Bảng so sánh phổ NMR của Aa3 với 9-demetylpsychotrin ....................77 Bảng 3.23 Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của Aa1 với Aa3 ..................................79 Bảng 3.24 Bảng so sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của Aa1 với psychotrin..................80 Bảng 3.25 Kết quả thử nghiệm khả năng chống OXH trên mô hình DPPH.............83 Bảng 3.26 Giá trị IC50 của các mẫu thử trong mô hình DPPH .................................84 Bảng 3.27 Kết quả thử nghiệm ức chế xanthin oxydase ...........................................84 Bảng 3.28 Giá trị IC50 của các mẫu thử trong thử nghiệm ức chế xanthin oxydase .84 Bảng 3.29 Giá trị IC50 của các mẫu thử trong thử nghiệm độc tế bào ......................85 Bảng 3.30 Bảng tổng kết kết quả thử sinh học các chất tinh khiết ...........................85 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của cây Quăng (Alangium salviifolium) .......................6 Hình 1.2 Cấu trúc một số Alkaloid trong Alangium salviifolium ...............................9 Hình 1.3 Cấu trúc một số dẫn chất phenolic trong Alangium salviifolium ...............10 Hình 1.4 Cấu trúc một số dẫn chất triterpen trong Alangium salviifolium ...............10 Hình 1.5 Một số cấu trúc sesquiterpen trong Alangium salviifolium ........................11 Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất và phân lập vỏ thân Alangium salviifolium .....................27 Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm thử DPPH trên đĩa 96 giếng ...........................................30 Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái cây Quăng........................................................33 Hình 3.2 Khí khổng dạng hỗn bào của lá Quăng ......................................................34 Hình 3.3 Vi phẫu và sơ đồ tổng quát lá Quăng .........................................................34 Hình 3.4 Vi phẫu chi tiết lá cây Quăng .....................................................................35 Hình 3.5 Các cấu tử trong bột lá cây Quăng .............................................................35 Hình 3.6 Vi phẫu và sơ đồ tổng quát thân cây Quăng ..............................................36 Hình 3.7 Vi phẫu chi tiết thân cây Quăng .................................................................36 Hình 3.8 Các cấu tử trong bột vỏ thân cây Quăng ....................................................37 Hình 3.9 Kết quả thử nghiệm 3 cao cồn (Lá, Vỏ thân, Rễ) trên mô hình DPPH......38 Hình 3.10 Kết quả của quá trình chiết xuất vỏ thân Alangium salviifolium .............40 Hình 3.11 Sắc ký đồ tổng kết các phân đoạn từ cao cồn A0 ....................................41 Hình 3.12 Kết quả sàng lọc các cao phân đoạn từ cao cồn trên mô hình DPPH ......41 Hình 3.13 Biểu đồ khả năng ức chế của các cao phân đoạn (100 µg/ml ) ...............43 Hình 3.14 Sắc ký đồ phân tích phân đoạn A2 ...........................................................44 Hình 3.15 Sắc ký đồ các phân đoạn từ cột quá tải A2 ..............................................46 Hình 3.16 Kết quả sàng lọc các phân đoạn từ A2 trên mô hình DPPH ...................47 Hình 3.17 Sắc ký đồ phân tích phân đoạn Aa ..........................................................47 Hình 3.18 Sắc ký đồ các phân đoạn từ cột quá tải phân đoạn Aa .............................49 Hình 3.19 Kết quả sàng lọc các cao phân đoạn từ Aa trên mô hình DPPH ..............50 Hình 3.20 Sắc ký đồ phân tích phân đoạn Aa.2 ........................................................52 Hình 3.21 Sắc ký đồ các phân đoạn từ cột cổ điển Aa.2 ..........................................54 vii Hình 3.22 Kết quả sàng lọc các phân đoạn từ Aa.2 trên mô hình DPPH .................54 Hình 3.23 Sắc ký đồ phân tích phân đoạn Aa.2.3 .....................................................56 Hình 3.24 Sắc ký đồ các phân đoạn từ cột cổ điển Aa.2.3 .......................................57 Hình 3.25 Sắc ký đồ phân tích phân đoạn Aa.3 ........................................................57 Hình 3.26 Sắc ký đồ các phân đoạn từ cột cổ điển Aa.3 ..........................................59 Hình 3.27 Kết quả sàng lọc các cao phân đoạn từ Aa.3 trên mô hình DPPH ...........59 Hình 3.28 Sắc ký đồ phân tích phân đoạn Aa.3.3 .....................................................61 Hình 3.29 Sắc ký đồ các phân đoạn từ cột cổ điển Aa.2.3 .......................................62 Hình 3.30 Sắc ký đồ kiểm tinh khiết A2a .................................................................64 Hình 3.31 Cấu trúc của A2a (Acid betulinic) ...........................................................65 Hình 3.32 Công thức cấu tạo của A2b ......................................................................67 Hình 3.33 Sắc ký đồ kiểm tinh khiết A2e .................................................................68 Hình 3.34 Kết quả thử tinh khiết A2e bằng HPLC ..................................................68 Hình 3.35 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của A2e ......................71 Hình 3.36 Sắc ký đồ kiểm tinh khiết Aa3 .................................................................72 Hình 3.37 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của Aa3 ......................77 Hình 3.38 Sắc ký đồ kiểm tinh khiết Aa1 .................................................................78 Hình 3.39 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của Aa1 .....................80 Hình 3.40 Sắc ký đồ kiểm tinh khiết A2c .................................................................81 Hình 3.42 Sơ đồ tóm tắt kết quả phân lập từ vỏ thân cây Quăng .............................82 Hình 3.43 Sắc ký đồ tổng kết quá trình phân lập từ A2 và Aa .................................83 viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT APCI Atmospheric-pressure chemical ionization CMC carboxymethyl cellulose COSY Collerated Spectroscopy - (phổ) tương quan 1H-1H CTPT công thức phân tử d doublet DCM dicloromethan dd doublet of doublets DMSO dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-diphenyl-2-picrylhydralazyl hydrat ESI Electrospray ionization EtOAc ethyl acetat HepG2 Hepatocellular carcinoma cell line HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC High Performance Liquid Chromatography HSQC Heteronuclear Single Bond Correlation IC Inhibitory concentration m multiplet MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 MDA-MB-231 M.D. Anderson Metastasis Breast cancer MOLT-3 T lymphoblastic leukaemia MRSA Methicillin-resistant S.aureus MS Mass Spectrometry - Phổ khối n-Hex n-hexan NMR Nuclear Magnetic Resonance - Cộng hưởng từ hạt nhân NOESY Nuclear Overhauser Spectroscopy PE petroleum ether pHPLC preparative high pressure liquid column PTK phân tử khối ix RD Human rhabdomyosarcoma cell line s singlet t triplet TNSH Thử nghiệm sinh học TT VS thuốc tử vanilin-sulfuric UV ultraviolet - tử ngoại 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Quăng (Alangium salviifolium (L.f.) Wang. Alangiaceae) là một vị thuốc phổ biến trong y học cổ truyền trong một số nước như Thái Lan, Cam-pu-chia, đặc biệt là Ấn Độ trong điều trị nhiều bệnh như tiêu chảy, sốt phát ban, suy tim, cao huyết áp, viêm khớp và ung thư da [7], [9], [36]. Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng dược lý nổi trội từ dịch chiết các bộ phận của Alangium salviifolium (L.f.) Wang., tiêu biểu là khả năng chống oxy hóa trên nhiều mô hình khác nhau cho kết quả gần như tương đồng với vitamin C [10]; khả năng kháng viêm trên nhiều mô hình in vivo với đối tượng thử nghiệm là chuột nhắt bằng đường uống (400 mg/kg đến 800 mg/kg) cũng cho kết quả khá ấn tượng khi so sánh với một số thuốc kháng viêm như ibuprofen, aspirin hay indomethacin [21], [37]. Cũng với liều khảo sát tương tự, các cao chiết từ Alangium salviifolia (L.f.) Wang. còn làm hạ đường huyết rõ rệt [21] và đặc biệt, còn có một số báo cáo về tác động độc tế bào khá mạnh trên một số dòng tế bào ung thư người [9], [30]. Đây là loài cây gần như đặc hữu ở các nước khu vực Đông Á và Đông Nam Á, đặc biệt là Ấn Độ và đã được đưa vào Dược điển nước này như một vị thuốc quan trọng [7]. Ở Việt Nam, loài Alangium salviifolium (L.f.) Wang. phân bố khá phổ biển ở miền trung các tỉnh Quảng Nam, Quảng Ngãi với tên gọi là cây Quăng [3], [5]. Tuy nhiên hiện nay, trong nước chưa có nghiên cứu nào về loài cây này và Quăng chỉ được người dân địa phương xem là cây lấy gỗ và bị đốn để lấy đất trồng nương rẫy một cách lãng phí. Đây là một nguồn nguyên liệu có sẵn và gần như đặc hữu chỉ ở một số khu vực lại giàu tiềm năng. Nếu như được đầu tư nghiên cứu hợp lý sẽ góp phần không nhỏ vào công cuộc bảo vệ sức khỏe cho người dân nói chung và góp phần tìm ra các cấu trúc có tác dụng dược lý đáng quý nói riêng. Từ những lý do trên, chúng tôi đặt vấn đề “Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng sinh học của vỏ thân cây Quăng (Alangium salviifolium (L.f) Wang. Alangiaceae)” với những mục tiêu cụ thể sau: - Sàng lọc in vitro tác dụng dụng chống oxy hóa và độc tính trên tế bào của cao chiết toàn phần, các phân đoạn và các chất tinh khiết trong cây Quăng; 2 - Chiết xuất và phân lập các chất theo định hướng tác dụng chống oxy hóa và độc tính trên tế bào; - Xác định cấu trúc các chất phân lập được; Từ đó cung cấp thêm thông tin cho loài dược liệu nhiều tiềm năng này và là tiền đề cho các nghiên cứu kiểm nghiệm, dược lý sau này để đi tới việc sử dụng cây thuốc này vào điều trị. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1.1.1. Thực vật học Vị trí trong bảng phân loại thực vật 1.1.1.1. Theo hệ thống phân loại của Bentham and Hooker’s, vị trí của Alangium salviifolium (L.f.) Wang. được xếp như sau: Giới thực vật (Plantea) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Sơn thù du (Cornales) Họ Thôi chanh (Alangiaceae) Chi Alangium Lam. Loài salviifolium (L.f) Wang. [7], [50], [54] Theo một số tài liệu, họ Alangiaceae được gộp chung với họ Cornaceae [49], [54], 1.1.1.2. Chi Alangium Alangium là chi duy nhất trong họ Alangiaceae (Thôi chanh) gồm có khoảng 20 loài phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới Đông bán cầu. Phần lớn là các cây bụi nhỏ hoặc cây gỗ có chiều cao từ 5 – 10 m. Thân màu vàng nhạt; Lá có hình dạng biến thiên, thường có hình elip và kích thước không bằng nhau; Hoa có màu vàng trắng nhạt và có mùi thơm; Quả có từ 1 -2 hạt [10], [54]. Bảng 1.1 Bảng thống kê đặc điểm một số loài thuộc chi Alangium có ở châu Á [37], [54] Tên loài Đặc điểm so sánh Alangium alpinum Cây leo, có thể cao tới 12 m. (C.B.Clarke) Cuống lá 3-5 cm, phiến hình trứng hoặc thuôn dài, 6-16 x 5-13 cm, phía rìa W.W.Sm. & Cave có lông thưa thớt, phía trong nhẵn, rìa lượn sóng. Cụm hoa 5-12 hoa, mọc ở nách. Đài hoa chia 6-8 thùy, sô cánh bằng số lá đài. 6-8 nhị, chỉ nhị dài 5-6 mm, nhẵn. Quả hạch hình elip, 20 x 8-9 mm. 4 Alangium Cây bụi hoặc thân gỗ, có thể cao tới 6m, cành xù xì. barbatum Baill. Cuống lá dài 2-2,5 cm. Phiến lá hình trứng, hình trứng ngược hoặc thuôn dài 10-15 x 5-8 cm, mỏng. Lá nguyên, có nhiều lông, đặc biệt ở vùng gân chính. Cụm hoa phân nhánh, 1,2-2,5 cm , 3-15 hoa trở lên, xù xì. Cuống hoa 2-10 mm. Đài hoa chia 4-7 thùy, 4-7 cánh hoa, mặt ngoài có lông, mặt trong nhẵn. 5-7 nhị, có lông mêm bên trong. 4-8 vòi nhụy, nhẵn. Alangium chinense Cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, cao 3-5 m, cành non có lông. (Lour.) Harms Cuống lá đỏ, 4-6 cm. 3-5 gân chính, lá nguyên hoạc chia thùy nông, chóp lá nhọn. Cụm hoa kiểu xim mọc ở nách lá, mỗi cụm 3-15 hoa, đài hoa chia 4-7 thùy, đều, có răng cưa. Cánh hoa đều, tiền khai van, 1-1,5 cm; có 6-8 nhị, bằng số cánh hoa. Quả hạch hình elip, 1,3–2 cm. Alangium faberi Cây bụi, cao 1-4 m. Vỏ cây trơn, cành nhỏ. Oliv. Lá hình elip hoặc hình bầu dục, cả hai bề mặt đều có lông. Cụm hoa 5-10 hoa, đài hoa hình chuông, chia 7 thùy hình tam giác. 5-6 cánh hoa, hai mặt có lông. 5-6 nhị hoa, bằng số cánh. Chỉ nhị 2 m, nở rộng và có lông phía trên. Mặt trong bao phấn có lông mềm. Đầu nhụy hình cầu. Quả hạch trong hoặc hơi elip, màu tím nhạt khi chín. Alangium Cây bụi leo hoặc cây bụi, cao 1-5 m. Vỏ thân màu tím sậm, nhẵn. kwangsiense Cuống lá 1-1,5 cm, phiến thuôn dài hoặc hình elip hẹp, 8-17 x 4-8 cm, lá Melch. mỏng, có 3-5 gân chính và 5-7 cặp gân phụ. Hai mặt nhẵn, đầu lá nhọn. Cụm hoa từ 5-12 hoa mọc ở nách, nhỏ, cuống hoa 1-1,5 cm. Đài hoa hình chén, chia 5 thùy, 5 cánh hoa, phía ngoài có lông, phía trong nhẵn, dính ở gốc. 5 nhị, ngắn hơn cánh hoa, nhẵn, quả hạch hình trứng, 8-12 x 5 mm. Alangium kurzii Cây gỗ hoặc cây bụi, có thể cao tới 28 m. Cành non nhẵn, thưa thớt. Craib Phiến lá mặt trên xanh lục nhạt, mặt dưới màu đậm hơn, phiến hình trứng, mỏng, 12-14 x 7-9 cm. Lá nguyên, đầu lá nhọn. Cụm hoa 5-7 hoa, cuống hoa 3-5 mm, hoa rất thơm, 6-8 cánh hoa, màu vàng, vàng đậm, cam hoặc đỏ gạch, hiếm khi có màu trắng hoặc màu vàng kem, phiến nguyên 2-2,5 cm. 6-8 nhị, màu vàng, có lông. Bầu nhụy 2 ô, vòi nhụy màu trắng, đầu nhụy chia 4 thùy. Quả hạch khi chín màu tím đậm hoặc đen, hình elip, 1,2-1,5 mm. 5 Alangium Cây bụi. Cành màu xám nâu. platanifolium Cuống lá 3-10cm. (Siebold & Zucc.) Phiến lá hình trứng hoặc tròn, hiếm khi hình mũi mác, mỏng, có lông tơ. Harms Cụm hoa ít hoa, hoa nhỏ, cánh hoa thường ngắn hơn 1cm. Cánh hoa màu trắng. Alangium Lá hình trứng, to, đôi khi chia thùy. Lá mọc xiên, có tua cuốn. premnifolium Ohwi Cụm hoa 2–5 hoa, ngắn, 3–8 cm. Cuống 1–1,5 cm. Đài hoa nhẵn. 7 nhị hoa. Quả hạch 1-1,2 cm. Alangium Cây gỗ đứng nhỏ hoặc cây bụi, cao khoảng 5 m. qingchuanense Phiến lá hình trứng hẹp hoặc rộng, mặt dưới màu xám nhạt, mặt trên màu M.Y.He xanh lục nhạt, 4–7 × 2,7–4 cm, cuống lá 1–1,6 cm. Cụm hoa 2 hoặc 3 hoa, đài hoa hình chén, 7 cánh hoa, màu vàng hoặc trắng, phiến nguyên, hai mặt có lông, 7 nhị hoa, nhị ngắn hơn cánh. Nhụy nhẵn, vòi nhụy 1cm. Alangium Cây bụi hoặc cây gỗ có thể cao đến 20 m. Lá hình trứng hoặc thuôn dài 8- salviifolium (L.f.) 18 x 3-7 cm. Wang. Cuống lá ngắn, dài 0,6-1,2 cm, có lông hay nhẵn. Cụm hoa không cuống, thường là cụm từ 4-8 hoa, hoặc ít hơn, đôi khi chỉ là một bông hoa đơn độc, có nhiều lông tơ. Cuống 2-8 mm. Hoa thơm, màu kem, 1,2–3 cm. Đài hoa 2,5 mm; 5–10 thùy. 4–6 cánh hoa, phía ngoài nhiều lông tơ, phía trong ít hơn. 10-30 nhị; chỉ nhị dài 4-12 mm. Quả hạch đỏ khi chín, 9-24 x 6-16 mm. Alangium Cây gỗ nhỏ hoặc cây bụi, cao khoảng 4m. yunnanense Cuống lá 2-3 cm. Phiến lá hình trứng, mỏng, cả hai mặt đều có lông tơ. Gân C.Y.Wu ex lá hình chân vịt. W.P.Fang Cụm hoa 5-15 hoa mọc ở nách. Đài hoa dạng phễu, 6-10 cánh hoa. 6-10 nhị, nhị ngắn hơn cánh hoa. Bao phấn có lông mịn. Quả hạch hình bầu dục khoảng 1cm, cuống nhỏ, có lông. 1.1.1.3. Loài Alangium salviifolium (L.f.) Wang. Tên khoa học: Alangium salviifolium (L.f.) Wang. Đồng danh: Alangium lamarckii Thwaites, Alangium decapelatum Lam. Tên thường gọi: Quăng, Quăng lông, Thôi ba lông xám, Thôi chanh lá xôn [4], [5]. 6 Tên nước ngoài: tên thông dụng theo tiếng Anh: Sage-leaved alangium; theo địa phương: Ankor Kanta (Bangladesh), Angol, Ankol, Dhera (India) và Ruk anguna (SriLanka)…[23], [49]. 1.1.1.4. Mô tả thực vật Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của cây Quăng (Alangium salviifolium ) [50] A. Thân B+C. Hoa dạng chùm D. Quả E. Cành có gai nhọn Thân: Đại mộc nhỏ, cao từ 3 đến 10 m có khi 18 m, đôi khi tiểu mộc có khi leo, có khi có gai (nhánh nhọn) dài khoảng 12 mm [10]. Lá: đơn mọc cách, cuống ngắn đôi khi dài đến 1,5 cm, phiến lá dài hình dạng biến thiên nhưng thường là oval có kích thước biến thiên 3-23 cm x 1,5-9 cm, mặt dưới có lông dày sét, chót có mũi. Hoa: lưỡng tính, dạng chùm gồm từ 5-10 cánh màu trắng hơi vàng nhạt và có mùi thơm lông vàng mặt ngoài; cuống hoa dài 2-8 mm, đài hoa hình ống nhỏ, hình tam giác khoảng 1.5 mm, tràng hoa hình ống gồm nhiều cánh hoa kích thước 12-28,5 mm x 12,5 mm. Bộ nhị: gồm từ 12-32 chỉ nhị mang bao phấn, dài 5-14 mm; Nhụy: Bầu dưới