Tài liệu Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng sinh họ của rễ cây quăng alangium salviifolium (l.f.)wangerin alangiaceae

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG THỊ LỆ THỦY ẢO S T T N T C DỤN SN P ẦN ỌC T EO ƢỚN ỌC CỦ RỄ CÂY QUĂN - Alangium salviifolium (L.f.) Wangerin Alangiaceae Ngành: Dƣợc liệu - Dƣợc học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. HUỲNH NGỌC THỤY Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 . . LỜ C M ĐO N Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Đặng Thị Lệ Thủy . . TÓM TẮT LUẬN VĂN T ẠC SĨ DƢỢC HỌC KHÓA 2017 – 2019 Chuyên ngành: Dƣợc liệu - Dƣợc học cổ truyền, mã số: 8720206 Tên đề tài: hảo s t th nh phần h họ hƣớng t ụng sinh họ ủ rễ ây Quăng - Alangium salviifolium (L.f.) Wangerin Alangiaceae Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Huỳnh Ngọc Thụy Học viên thực hiện: Đặng Thị Lệ Thủy Mở đầu: Các công trình khoa học trên thế giới về loài Alangium salviifolium (L.f) Wang., Alangiaceae cho thấy nhiều tác dụng dƣợc lý đáng quý. Tuy nhiên hiện nay chỉ có vài nghiên cứu về loài cây này tại Việt Nam. Đề tài tiến hành chiết xuất, sàng lọc và phân lập các hợp chất có trong rễ Alangium salviifolium (L.f) Wang. hƣớng tác dụng sinh học nhằm cung cấp thêm thông tin để có thể ứng dụng loài cây này làm thuốc. Đối tƣợng nghiên cứu Rễ cây Quăng (Alangium salviifolium (L.f) Wang.) thu hái tại Quảng Nam (09/2017). Phƣơng ph p nghiên ứu Định danh, lựa chọn nguyên liệu, kiểm tra độ tinh khiết nguyên liệu, khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật. Khảo sát hóa học hƣớng tác dụng chống oxy hóa (mô hình DPPH, ức chế xanthin oxydase). Phân lập, tinh chế, định danh và đánh giá hoạt tính sinh học chất tinh khiết. Kết quả Xác định nguyên liệu: Định danh nguyên liệu chính xác là rễ cây Quăng. Chiết xuất và đánh giá tác dụng sinh học 5 kg rễ cây Quăng, chiết ngấm kiệt thu đƣợc 450 g cao cồn, tiến hành chiết phân bố lỏng – lỏng thu đƣợc 60 g cao diclorometan (cao A), 9 g cao ethyl acetat (cao B), 67 g alkaloid toàn phần (cao D). Phân đoạn A3 và A5 từ cao A, phân đoạn D3.1 và D3.3 từ cao D có HTCO cao hơn các phân đoạn khác nên chọn phân lập các hợp chất tinh khiết. Phân lập và xác định các hợp chất tinh khiết Từ cao A1 thu đƣợc hỗn hợp stigmasterol và β-Sitosterol (AS1; 36,18 mg). Từ cao A3 thu đƣợc mansonon H (AS7, 11 mg); dehydrooxoperezinon (AS8, 5 mg) và β-Sitosterol glucosid (AS9; 31,2 mg). Từ cao A5 thu đƣợc 25 mg AS4. Từ cao D3 thu đƣợc 2 mg AS5 và angustinin (AS6; 18,58 mg). Thử tác dụng sinh học Hợp chất angustinin AS6 c HTCO mạnh trên mô hình DPPH (IC50 = 32,5 µM), trên mô hình ức chế xanthin oxydase c ng c tác dụng khá tốt (IC50 = 110,7 µM). Mansonon H (AS7) và dehydrooxoperezinon (AS8) không có HTCO trên 2 mô hình DPPH và ức chế xanthin oxydase. Bàn luận: Cần tiếp tục các thử nghiệm về tác dụng sinh học trên các chất tinh khiết và phân lập chất từ các phân đoạn giàu tiềm năng. . . SUMMARY THESIS OF MASTER OF PHARMACY – Course: 2017 – 2019 Major: Pharmacognosy - Traditional Pharmacy – Code: 8720206 BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION FROM ROOT OF Alangium salviifolium (L.f.) Wangerin Alangiaceae Instructor: Huynh Ngoc Thuy, Assoc. Prof., Dr Student: Dang Thi Le Thuy Introduction: In scientific lituretures, Alangium salviifolium (L.f) Wang. has been reported to have potential efficacy against many diseases, however there are some study about this plant in Viet Nam. This study was conducted on root. Materials: Roots of Alangium salviifolium (L.f) Wang. were collected on 9/2017 in Quang Nam. Methods: Extraction, seperation, isolation and purification were done as routine work. Structure elucidation was based on NMR and MS spectrometric methods. In vitro screening of fractions, isolated compounds for antioxidant effects (DPPH and xanthin oxydase inhibition). Results: Chemical composition and bio-assay screening : 5 kg of root powder was extracted with 96% ethanol to yield 450 g extract, which succesively portioned with solvent to obtain 60 g dichlorometane (fraction A), 9 g ethyl acetate (fracti B), 67g total alkaloid fractions (fraction D). Screening in vitro antioxidant effect on all fractions. Fraction A3 and A5 from fraction A, fraction D3.1 and D3.3 from fraction D had high reduce ability so to isolate. Isolation and structure elucidation Fraction A1 was obtained a mixture of sterol (AS1; 36,18 mg). Fraction A3 was obtained mansonon H (AS7, 11 mg); dehydrooxoperezinon (AS8, 5 mg) và β-Sitosterol glucosid (AS9; 31,2 mg). Fraction A5 was obtained AS4 (25 mg). Fraction D3 was obtained AS5 (2 mg ) and angustinin (AS6; 18,58 mg). Bio-assay testing: Angustinin (AS6) showed high ability in DPPH radical scavenging (IC50 = 32,5 µM) and in xanthin oxydase inhibitory (IC50 = 110,7 µM). Mansonon H (AS7) và dehydrooxoperezinon (AS8) did not show ability in DPPH and xanthine oxxydase. Conclusion: Alangium salviifolium (L.f) Wang. has potetial on treatment diseases such as cancer, gout, hepatitis... Futher studies about the effect of constituents from this plant have to be conducted. . . MỤC LỤC MỤC LỤC ..........................................................................................................................i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................................v DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ vii DANH MỤC BẢNG .........................................................................................................x ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................2 1.1. THỰC VẬT HỌC ................................................................................................2 1.1.1. Vị trí phân loại ...........................................................................................2 1.1.2. Đặc điểm họ Alangiaceae ..........................................................................2 1.1.3. Đặc điểm chi Alangium ..............................................................................3 1.1.4. Đặc điểm loài Alangium salviifolium .........................................................4 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC .................................................................................5 1.3. TÁC DỤNG DƢỢC LÝ ....................................................................................10 1.3.1. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm .........................................................10 1.3.2. Tác dụng chống oxy hóa ..........................................................................11 1.3.3. Tác dụng kháng viêm, giảm đau ..............................................................12 1.3.4. Tác dụng độc tế bào, kháng ung thƣ ........................................................13 1.3.5. Tác dụng chống loét dạ dày .....................................................................14 1.3.6. Tác dụng bảo vệ gan ................................................................................14 1.3.7. Tác dụng hạ đƣờng huyết.........................................................................14 1.3.8. Tác dụng lợi tiểu ......................................................................................15 1.3.9. Một số tác dụng khác ...............................................................................15 1.4. CÔNG DỤNG ....................................................................................................15 1.5. GỐC TỰ DO VÀ MÔ HÌNH THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA ..........16 1.5.1. Gốc tự do ..................................................................................................16 1.5.2. Mô hình DPPH .........................................................................................17 1.5.3. Mô hình thử tác dụng ức chế enzym xanthin oxydase.............................18 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................20 . . 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................20 2.2. DUNG MÔI, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ ..............................................................20 2.2.1. Dung môi, hóa chất ..................................................................................20 2.2.2. Máy móc, thiết bị .....................................................................................21 2.2.2.1. Máy móc, trang thiết bị cho phân tích hóa học ....................................21 2.2.2.2. Máy móc, trang thiết bị cho khảo sát sinh học .....................................21 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU ......................................................................22 2.3.1. Khảo sát về thực vật học, định danh loài .................................................22 2.3.2. Thử tinh khiết ...........................................................................................22 2.3.3. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật của dƣợc liệu rễ Quăng ............23 2.3.4. Chiết xuất .................................................................................................23 2.3.5. Sàng lọc sinh học và phân lập các chất tinh khiết ...................................23 2.3.5.1. Chiết xuất để sàng lọc sinh học ............................................................23 2.3.5.2. Sàng lọc sinh học..................................................................................23 2.3.5.3. Phân lập các hợp chất tinh khiết...........................................................27 2.3.6. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc ......27 2.3.6.1. Kiểm tra độ tinh khiết các hợp chất phân lập đƣợc..............................27 2.3.6.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc.....................................28 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ..................................................................................................30 3.1. KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC ..........................................................................30 3.1.1. Đặc điểm hình thái .........................................................................................30 3.1.2. Đặc điểm vi học .............................................................................................31 3.1.3. Giải trình tự DNA để định danh ....................................................................34 3.2. THỬ TINH KHIẾT ..............................................................................................36 3.3. KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT ...................................36 3.4. CHIẾT XUẤT ......................................................................................................37 3.5. SÀNG LỌC TÁC DỤNG SINH HỌC .................................................................40 3.5.1. Mô hình DPPH ..............................................................................................40 3.5.1.1. Sàng lọc cao toàn phần, cao A, cao B, cao D, cao E ..............................40 . . 3.5.1.2. Sàng lọc các cao phân đoạn A1, A2, A3, A4, A5, A6 ...........................41 3.5.1.3. Sàng lọc các cao phân đoạn D1, D2, D3 ................................................42 3.5.1.4. Sàng lọc các cao phân đoạn D3.1, D3.2, D3.3, D3.4, D3.5 ...................43 3.5.2. Mô hình ức chế xanthin oxydase ...................................................................45 3.5.2.1. Sàng lọc cao toàn phần, cao A, cao B, cao D, cao E ..............................45 3.5.2.2. Sàng lọc các cao phân đoạn cao A1, A2, A3, A4, A5, A6 .....................45 3.5.2.3. Sàng lọc các cao phân đoạn D1, D2, D3 ................................................46 3.5.2.4. Sàng lọc các cao phân đoạn D3.1, D3.2, D3.3, D3.4, D3.5 ...................47 3.6. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT .....................................................48 3.6.1. Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao A .....................................................48 3.6.2. Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao D ....................................................52 3.7. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT .............................................................................55 3.7.1. Hợp chất AS1.................................................................................................55 3.7.2. Hợp chất AS4.................................................................................................55 3.7.3. Hợp chất AS5.................................................................................................56 3.7.4. Hợp chất AS6.................................................................................................56 3.7.5. Hợp chất AS7, AS8 .......................................................................................57 3.7.6. Hợp chất AS9.................................................................................................59 3.8. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC ......................60 3.8.1. Hợp chất AS1.................................................................................................60 3.8.2. Hợp chất AS4.................................................................................................62 3.8.3. Hợp chất AS5.................................................................................................64 3.8.4. Hợp chất AS6.................................................................................................66 3.8.5. Hợp chất AS7.................................................................................................70 3.8.6. Hợp chất AS8.................................................................................................73 3.8.7. Hợp chất AS9.................................................................................................76 3.9. THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC .............78 3.9.1. Mô hình DPPH ..............................................................................................78 3.9.2. Thử nghiệm trên mô hình ức chế xanthin oxydase .......................................79 . . BÀN LUẬN .....................................................................................................................82 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................................86 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................90 PHỤ LỤC ........................................................................................................................96 . . DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ tắt Chữ nguyên Ý nghĩ Độ hấp thu 1 Abs Absorbance 2 ABTS 2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazilin-6-sulfonat) 3 APCI Atmospheric-pressure chemical ionization 4 br broad Đỉnh rộng 5 COSY Collerated Spectroscopy Phổ tƣơng quan 1H-1H 6 d doublet Đỉnh đôi 7 DĐVN Dƣợc điển Việt Nam 8 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 9 DMSO Dimethyl sulfoxid 10 DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 11 EC50 Effective concentration 50% 12 FRAP Ferric ion Reducing Antioxidant Power 13 HDLcholesterol High Density Lipoprotein Cholesterol 14 HMBC Heteronuclear Multiple Bond Corelation 15 HPLC High Performance Liquid Chromatography 16 HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation 17 HTCO Hoạt tính chống oxy hóa 18 IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% 19 J Coupling constan Hằng số ghép 20 LPS Lipo polysaccharid 21 m multiplet 22 MHz Mega hertz . Cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao Đỉnh phức tạp . 23 MOLT-3 T lymphoblastic leukaemia 24 MS Mass Spectrometry Phổ khối 25 NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân 26 PDA Photodiode Array Dãy diod quang 27 PGE2 Prostaglandin E2 28 ppm Parts per million 29 RAW-264,7 Dòng tế bào đại thực bào 30 s singlet 31 SGOT Serum Glutamo-oxalo Transaminase 32 SGPT Serum Glutamic-pyruvic Transaminase 33 SKOV-3 Dòng tế bào ung thƣ buồng trứng 34 SKC Sắc ký cột 35 SKĐ Sắc ký đồ 36 SKLM Sắc ký lớp mỏng 37 t triplet 38 TT Thuốc thử 39 TNF-α Tumor necrosis factor α 40 TLTK Tài liệu tham khảo 41 UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography 42 UV-Vis Ultraviolet and Visible Tử ngoại khả kiến 43 VLC Vacuum Liquid Chromatography Sắc ký cột chân không 44 VS Vanillin-acid sulfuric 45 XO Xanthin oxydase . Đỉnh đơn Đỉnh ba Yếu tố hoại tử khối u α . DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vị trí phân loại loài Alangium salviifolium .......................................................2 Hình 1.2. Lá, quả, hoa, gai của cây Quăng [59]. ..............................................................5 Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm thử tác dụng ức chế XO trên đĩa 96 giếng ..........................26 Hình 3.4. Lá, quả, gai của cây Quăng .............................................................................30 Hình 3.5. Biểu bì dƣới lá Quăng mang lông che chở và lỗ khí ......................................31 Hình 3.6. Vi phẫu và sơ đồ lá Quăng ..............................................................................32 Hình 3.7. Các điểm đặc trƣng của vi phẫu lá Quăng ......................................................32 Hình 3.8. Vi phẫu và sơ đồ rễ Quăng..............................................................................33 Hình 3.9. Các cấu tử của bột rễ Quăng ...........................................................................34 Hình 3.10. Sắc ký đồ kiểm tra các phân đoạn cao chiết Ethyl acetat-methanol-nƣớc (100:17:13) ......................................................................................................................37 Hình 3.11. Sơ đồ chiết xuất bột rễ Quăng .......................................................................39 Hình 3.12. Kết quả thử DPPH trên bản mỏng các cao TP, A, B, D, E ...........................40 Hình 3.13. Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế DPPH của cao TP, cao A, cao B, cao D, cao E ở nồng độ 15,625 µg/ml.........................................................................................41 Hình 3.14. Kết quả thử DPPH trên bản mỏng các cao A1, A2, A3, A4, A5, A6 ...........41 Hình 3.15. Biều đồ so sánh tác dụng ức chế DPPH của cao A1, cao A2, cao A3, cao A4, cao A5 và cao A6 ở nồng độ 15,625 µg/ml . ............................................................42 Hình 3.16. Kết quả kiểm tra SK M các cao D1, D2, D3.. .............................................42 Hình 3.17. Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế DPPH của cao D1, cao D2 và cao D3 ở nồng độ 15,625 µg/ml ......................................................................................................43 Hình 3.18. Kết quả sàng lọc tác dụng ức chế DPPH trên SK M của các cao D3.1, D3.2, D3.3, D3.4, D3.5. ..............................................................................................................44 Hình 3.19. Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế DPPH của cao D3.1, cao D3.2, cao D3.3, D3.4 và D3.5 ở nồng độ 15,625 µg/ml ............................................................................44 Hình 3.20. Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế xanthin oxydase của cao TP, cao A, cao B, cao D, cao E ở nồng độ 200 µg/ml. .................................................................................45 Hình 3.21. Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế xanthin oxydase của cao A1, cao A2, cao A3, cao A4, cao A5 và cao A6 ở nồng độ 200 µg/ml .....................................................46 . . Hình 3.22. Biều đồ so sánh tác dụng ức chế xanthin oxydase của cao D1, cao D2 và cao D3 ở nồng độ 100 µg/ml ..................................................................................................46 Hình 3.23. Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế xanthin oxydase của cao D3.1, cao D3.2, cao D3.3, D3.4 và D3.5 ở nồng độ 100 µg/ml ................................................................47 Hình 3.24. Sắc ký đồ các phân đoạn của cao A3 ............................................................49 Hình 3.25. Sắc ký đồ các phân đoạn của cao A3.6 .........................................................50 Hình 3.26. Sắc ký đồ các phân đoạn của cao A.5 ...........................................................52 Hình 3.27. Sắc ký đồ các phân đoạn của cao D3.1 .........................................................53 Hình 3.28. Sắc ký đồ các phân đoạn của cao D3.3 .........................................................55 Hình 3.29. Sắc ký đồ kiểm tinh khiết AS1 .....................................................................55 Hình 3.30. Sắc ký đồ kiểm tinh khiết AS4 .....................................................................56 Hình 3.31. Sắc ký đồ kiểm tinh khiết AS5 .....................................................................56 Hình 3.32. Sắc ký đồ kiểm tinh khiết AS6 .....................................................................56 Hình 3.33. Kết quả thử tinh khiết AS6 bằng UPLC .......................................................57 Hình 3.34. Sắc ký đồ kiểm tinh khiết AS7 và AS8.........................................................58 Hình 3.35. Kết quả thử tinh khiết AS7 bằng HPLC .......................................................58 Hình 3.36. Kết quả thử tinh khiết chất AS8 bằng HPLC ................................................59 Hình 3.37. Sắc ký đồ kiểm tinh khiết chất AS9 ..............................................................60 Hình 3.38. Sơ đồ kết quả các hợp chất phân lập đƣợc từ rễ Quăng................................60 Hình 3.39. Phổ HR-MS (ESI-) của AS1 .........................................................................61 Hình 3.40. Công thức của stigmasterol ...........................................................................61 Hình 3.41. Phổ 1H-NMR của AS1 ..................................................................................62 Hình 3.42. Phổ HR-MS (ESI-) của AS4 .........................................................................63 Hình 3.43. Phổ HR-MS (ESI+) của AS5 ........................................................................65 Hình 3.44. Phổ UV của AS6 ...........................................................................................67 Hình 3.45. Phổ HR-MS (ESI+) của AS6 ........................................................................67 Hình 3.46. Cấu trúc của AS6 và các tƣơng tác HMBC, COSY chính. ...........................69 Hình 3.47. Phổ UV của AS7 ...........................................................................................70 Hình 3.48. Phổ HR-MS (ESI+) của AS7 ........................................................................71 . . Hình 3.49. Cấu trúc của AS7 và các tƣơng tác HMBC, COSY chính. ...........................72 Hình 3.50. Phổ UV của AS8 ...........................................................................................73 Hình 3.51. Phổ HR-MS (ESI-) của AS8 .........................................................................74 Hình 3.52. Cấu trúc của AS8 và các tƣơng tác HMBC chính ........................................75 Hình 3.53. Phổ HR-MS (APCI-) của AS9 ......................................................................76 Hình 3.54. Cấu trúc của AS9 ..........................................................................................77 Hình 3.55. Đƣờng phi tuyến tƣơng quan giữa nồng độ và % ức chế DPPH của quercetin .........................................................................................................................................79 Hình 3.56. Đƣờng phi tuyến tƣơng quan giữa nồng độ và %ức chế DPPH của AS6 ....79 Hình 3.57. Đƣờng phi tuyến tƣơng quan giữa nồng độ và % ức chế XO của allopurinol .........................................................................................................................................80 Hình 3.58. Đƣờng phi tuyến tƣơng quan giữa nồng độ và % ức chế XO của AS6 ........80 Hình 3.59. Sơ đồ kết quả các hợp chất phân lập đƣợc từ rễ Quăng................................81 . . DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học các bộ phận dùng của cây Quăng ....................................5 Bảng 1.2. Công thức một số alkaloid không thuộc nhóm isoquinolin ..............................6 Bảng 1.3. Công thức một số alkaloid thuộc nhóm isoquinolin .........................................6 Bảng 1.4. Công thức của một số terpen trong Alangium salviifolium .............................9 Bảng 1.5. Flavonoid và những hợp chất khác [44], [65]. ...............................................10 Bảng 2.6. Thành phần thử DPPH trong cuvet .................................................................24 Bảng 2.7. Thành phần thử tác dụng ức chế XO trong giếng của đĩa 96 .........................26 Bảng 2.8. Thành phần thử tác dụng ức chế XO trong cuvet ...........................................26 Bảng 2.9. Chƣơng trình rửa giải của hệ thống UPLC .....................................................28 Bảng 2.10. Chƣơng trình rửa giải của hệ thống HPLC ...................................................28 Bảng 3.11. Kết quả kiểm tinh khiết bột rễ Quăng ...........................................................36 Bảng 3.12. Kết quả thành phần hóa thực vật bột rễ Quăng ............................................36 Bảng 3.13. Kết quả % ức chế DPPH cao TP, A, B, D, E ................................................40 Bảng 3.14. Kết quả % ức chế DPPH cao A1, A2, A3, A4, A5, A6 ................................42 Bảng 3.15. Kết quả % ức chế DPPH cao D1, D2, D3 ....................................................43 Bảng 3.16. Kết quả % ức chế DPPH cao D3.1, D3.2, D3.3, D3.4, D3.5 ........................44 Bảng 3.17. Kết quả % ức chế XO cao TP, A, B, D, E ....................................................45 Bảng 3.18. Kết quả % ức chế XO cao A1, A2, A3, A4, A5, A6 ....................................45 Bảng 3.19. Kết quả % ức chế XO các cao D1, D2, D3 ...................................................46 Bảng 3.20. Kết quả % ức chế xanthin oxydase cao D3.1, D3.2, D3.3, D3.4, D3.5 ........47 Bảng 3.21. Kết quả các phân đoạn sắc ký cột cao A3 ....................................................48 Bảng 3.22. Kết quả các phân đoạn sắc ký cột cao A3.6. ................................................50 Bảng 3.23. Kết quả các phân đoạn sắc ký cột cao A5 ....................................................51 Bảng 3.24. Kết quả các phân đoạn sắc ký cột cao D3.1 .................................................52 Bảng 3.25. Kết quả các phân đoạn sắc ký cột cao D3.3 .................................................54 Bảng 3.26. So sánh dữ liệu phổ của AS1 và stigmasterol...............................................61 Bảng 3.27. Dữ liệu phổ của AS4 .....................................................................................63 Bảng 3.28. Dữ liệu phổ của AS5 .....................................................................................65 Bảng 3.29. So sánh dữ liệu phổ NMR của AS6 và angustinin .......................................69 Bảng 3.30. So sánh dữ liệu phổ NMR của AS7 và mansonon H ....................................73 Bảng 3.31. So sánh dữ liệu phổ NMR của AS8 và dehydrooxoperezinon .....................75 Bảng 3.32. So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của AS9 và β-Sitosterol glucosid ................77 Bảng 3.33. Kết quả thử nghiệm trên mô hình DPPH của AS6, AS7, AS8 và quercetin 78 Bảng 3.34. Giá trị IC50 của AS6 và quercetin trong mô hình DPPH ..............................79 Bảng 3.35. Kết quả thử nghiệm ức chế xanthin oxydase của AS6 và allopurinol ..........79 . . Bảng 3.36. Giá trị IC50 của AS6 và allopurinol trong thử nghiệm ức chế xanthin oxydase ............................................................................................................................80 Bảng 4.37. Kết quả IC50 (µg/ml) thử độc tính tế bào của mansonon H và chất đối chiếu .........................................................................................................................................84 . . ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Quăng Alangium salviifolium (L.f.) Wang., Alangiaceae) là cây đặc hữu ở các quốc gia Đông Á, Đông Nam Á và đƣợc dân địa phƣơng Ấn Độ, Thái Lan, Cam-Pu-Chia, Philippin…dùng chữa các bệnh thấp khớp, sốt, bệnh ngoài da, rối loạn tiêu hóa, tiểu đƣờng, cao huyết áp…[56], [59]. Đặc biệt Alangium salviifolium .f. Wang. đã đƣợc đƣa vào Dƣợc điển Ấn Độ [25], [13]. Nhiều nghiên cứu đã công bố về thành phần hóa học các bộ phận dùng của Quăng chứa các nhóm hợp chất chính nhƣ terpen, flavonoid, alkaloid…[13], [44], [51]. Những nghiên cứu thử tác dụng sinh học c ng cho các kết quả rất ấn tƣợng về tác dụng chống oxy hóa (rễ có IC50 = 11,26±1,29 µg/ml), kháng khuẩn, kháng viêm, thể hiện tính độc mạnh trên nhiều dòng tế bào, chống trầm cảm… [31], [40], [44]. Ở Việt Nam, cây Quăng trƣớc đây mọc nhiều ở vùng đồng bằng Quảng Nam, Quảng Ngãi, ngƣời dân địa phƣơng thƣờng hái quả vào mùa hè để ăn, quả c vị chua ngọt đặc biệt nhƣng cơm quả mỏng, ít đƣợc chú ý, giá trị làm gỗ kém, Quăng rừng đã và đang bị ngƣời dân chặt bỏ để lấy đất canh tác nên ngày một ít dần, c nguy cơ biến mất dù c nhiều tác dụng chữa bệnh trong dân gian nhƣ long đờm, cầm tiêu chảy, trừ giun. Tại thành phố Hồ Chí Minh, Biên Hòa, Côn Đảo c ng chỉ còn rải rác vài cây [6], [8]. Là một trong những vùng có thể phát triển cây thuốc giá trị này nhƣng hiện nay ở Việt Nam mới chỉ c vài đề tài nghiên cứu về thành phần hóa học và thử tác dụng sinh học loài Alangium salviifolium (L.f.) Wang..Tiếp nối đề tài của một luận văn cao học khóa 2016-2018 đã khảo sát vỏ thân cây Quăng ở Quảng Ngãi nhằm đƣa ra các bằng chứng khoa học để có thể đƣa cây Quăng trở thành một nguyên liệu làm thuốc, đề tài “ S TT N P ẦN RỄ CÂY QUĂN ỌC T EO ƢỚN T C DỤN SN ẢO ỌC CỦ - Alangium salviifolium (L.f.) Wangerin Alangiaceae” đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: - Sàng lọc in vitro tác dụng chống oxy hóa trên hai mô hình DPPH và ức chế xanthin oxydase của cao toàn phần, các cao phân đoạn từ rễ cây Quăng ở Quảng Nam. - Chiết xuất, phân lập các hợp chất tinh khiết, xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc, thử tác dụng chống oxy hóa trên hai mô hình DPPH và ức chế xanthin oxydase của các hợp chất phân lập đƣợc. . . C ƢƠN 1.1. 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU THỰC VẬT HỌC 1.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại của Armen Takhtajan, loài Quăng Alangium salviifolium) thuộc chi Alangium, họ Thôi chanh (Alangiaceae), bộ Sơn thù du Cornales , lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), giới Thực vật (Plantae) [6], [58]. Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) (Magnoliphyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Bộ Sơn thù du Cornales Họ Thôi chanh (Alangiaceae) Chi Alangium Alangium barbatum Alangium chinense Alangium salviifolium Alangium kurzii Alangium ridleyyi Hình 1.1. Vị trí phân loại loài Alangium salviifolium 1.1.2. Đặ điểm họ Alangiaceae Họ Thôi chanh còn gọi là họ Thôi ba, cây thân gỗ hoặc bụi. á đơn nguyên hay phân thùy, gốc lá thƣờng lệch, không có lá kèm, mọc cách. Hoa lƣỡng tính, tập hợp thành xim, thƣờng màu trắng vàng, thơm, đều, mẫu 4 -5, cánh hoa hình sợi dài thƣờng cuộn ra ngoài lúc nở. Các nhị nhiều bằng hay nhiều hơn số cánh hoa 2-3 lần, xen kẽ với cánh . . hoa. Bộ nhụy gồm hai lá noãn hợp thành bầu hạ 1-2 ô. Đài hình ống. Quả hạch một hạt ở trong đài và triền đài tồn tại [6], [8], [46], [52], [58]. Họ Alangiaceae chỉ có 1 chi là Alangium [6], [8], [46], [58]. 1.1.3. Đặ điểm chi Alangium Chi Alangium tên tiếng Việt là Thôi ba, Thôi chanh, Quăng; theo tiếng Tamin ở Ấn Độ là Alangi. Cây gỗ, cây nhỡ hoặc bụi lớn, không có gai, nhẵn hay có lông mịn. Lá mọc so le không c lá kèm, nguyên hay chia thùy, thƣờng không cân ở gốc, mỏng, dai, có gân lông chim hay chân vịt. Hoa đều, tập hợp thành cụm hoa xim ở nách lá, dạng ngù và phân nhánh, ít hoa không cuống hay có cuống. Hoa lƣỡng tính, màu trắng hay vàng với cuống có khớp. Đài cụt với 4-10 răng tam giác. Tràng có 4-10 cánh hoa, kéo dài, thƣờng hình dải, xếp van. Nhị xen kẽ với cánh hoa, bằng số cánh hoa, có khi nhiều gấp 2-3 lần, rời hay hơi dính nhau. Bầu hạ 1 (2) ô. Quả hạch dạng bầu dục – trứng hay hình cầu, kèm theo các vết tích của lá đài và đĩa mật, có một hạt, vỏ quả ngoài nạc hay dai, vỏ quả trong hóa sừng hay hóa gỗ [6], [7], [8], [37], [46], [52], [58]. Chi Alangium gồm khoảng 20 loài, phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới hoặc ôn đới ẩm của châu Á, châu Phi nhiệt đới, châu Đại dƣơng, Madagascar, New Guinea, miền đông Australia, New Caledonia, Fiji, nhƣng tập trung nhiều ở Đông Nam Á. Tại Việt Nam có 6 loài trong đ 4 loài dùng làm thuốc [6], [7], [8], [29], [46], [58]. Một số loài thuộc chi Alangium Alangium barbatum (R. Br.) Alangium barbatum var. decipiens (Evr.) Tard.-Bl. Alangium chinense (Lour.) Rehd. Alangium kurzii Craib Alangium ridleyi King Alangium salviifolium (L.f.) Wang. Alangium tonkinensis Gagn. [6], [7], [8], [58]. . . 1.1.4. Đặ điểm loài Alangium salviifolium Tên khoa học: Alangium salviifolium (L.f.) Wang. thuộc họ Thôi chanh Alangiaceae (Cornaceaae) [6], [8], [43]. Đồng danh: các đồng danh và thứ (loài phụ) của Alangium salviifolium (L.f.) Wang là Alangium decapetalum Lam., Alangium lamarckii Thwaits., Alangium latifolium Miq.ex C.B. Clarke., Alangium mohillae Tul., Alangium salvifolium subsp. decapetalum (Lam.) Wang., Alangium sundanum var. Miqueliana Kurz., Alangium tomentosum Lam., Grewia salviifolia L.f., Karangolum mohillae (Tul.) Kuntze. và Karangolum salvifolium (L.f.) Kuntze. [43], [58]. Tên Việt Nam: Quăng [6], [8]. Tên khác: Quăng lông, Thôi chanh lá xôn, Thôi ba lông xám, Quăng gai [6], [8]. Tên nƣớc ngoài: Sage leaved alangium (tiếng Anh) [59]. Mô tả: Cây thân gỗ, trung bình hay cao lớn tới 18 m, bề mặt vỏ cây sần sùi và màu nâu nhạt; cành cây màu xám hoặc nâu tím, nhẵn hoặc c lông, thƣờng c gai nhánh nhọn dài tới 12 mm, nhiều cành ít phát triển. Lá đơn, nguyên, mọc so le, dài 10-20 cm, hình bầu dục hay xoan ngƣợc, thuôn dài, khá dai, rất nhẵn ở mặt trên, c lông mềm nhiều hay ít ở mặt dƣới, tròn ở gốc, thuôn lại dần dần và c m i cứng rõ hay không. Cuống lá ngắn, dài 0,6-1,2 cm, c lông hay nhẵn. Hoa đều, lƣỡng tính, màu trắng, màu kem, thơm nhẹ, xếp thành chùm 3-5 cái ở nách lá, 6-10 cánh hoa, dài 2,5 cm, c lông vàng ở mặt ngoài. oài phụ var. hexapetalum (Lam.) Wang. có 6 cánh hoa, lá tròn dài; var. decapetalum (Lam.) Wang. c 10 cánh hoa, lá thon; bộ nhị gồm 12-32 nhị, dài 5-14 mm, bộ nhụy: 1-2 lá noãn tạo thành bầu dƣới. Quả mọng dạng bầu dục gần nhƣ hình cầu hay dạng trứng, đƣờng kính 15-20 mm, bao bởi các thùy đài, màu đỏ tía khi chín, vị ngọt hơi chua. Hạt c nội nh [6], [8], [37], [46], [52], [58], [59], [65]. . . Hình 1.2. Lá, quả, hoa, gai của cây Quăng [59]. Phân bố: Alangium salviifolium có nguồn gốc từ Tây Phi, Madagascar, Nam và Đông Á (Trung Quốc, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ, Philippin), châu Úc nhiệt đới, các đảo Comoros nhƣng phổ biến ở châu Á nhiệt đới, từ Ấn Độ đến Trung Quốc, Thái Lan, Philippin, Indonesia và Papua New Guinea. Ở Ấn Độ, đƣợc tìm thấy trên khắp các khu rừng Hyderabad và khu bảo tồn Sitamatawildlife, Rajasthan đặc biệt là vùng Tây Ghats [46], [52], [56] ,[58]. Ở Việt Nam có ở Quảng Nam, Quảng Ngãi, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Biên Hòa, Thành phố Hồ Chí Minh [6], [8], [54]. Bộ phận dùng: lá (Folium), hoa (Flos), vỏ thân (Cortex), vỏ rễ (Cortex Radicis), rễ (Radix), gỗ và quả (Lignum et Fructus) [6], [8], [26], [43], [46], [48], [54], [55], [56], [70]. 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC Những nghiên cứu thành phần hóa học đã xác định nhiều nhóm hợp chất trong các bộ phận của loài Alangium salviifolium như Bảng 1.1. [20], [26], [28], [29], [32], [43], [44], [48], [51], [54], [56], [59], [62], [63], [64], [65], [72]. Bảng 1.1. Thành phần hóa học các bộ phận dùng của cây Quăng Cơ qu n Thành phần hóa học Rễ Alkaloid (cephaelin, tubulosin, isotubulosin, psychotrin và alangisid). Vỏ rễ Alkaloid (alangicin, d-methylpsychotrin, flavonoid, stigmasterol and ß-sitosterol. Thân Flavonoid, terpenoid, alkaloid, steroid Vỏ thân Alkaloid, steroid, tannin, flavonoid Lá Alkaloid (alangimarkin, ankorin, deoxytubulosin, alangisid), tannin, flavonoid [salicin, kaempferol, kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid (astragalin)], terpenoid, steroid (alangol, alengol), phenolic glycosid (salviifosid A, B, C), . marckin, marckidin, lamarckinin),