Tài liệu Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của lá nho biển (folium coccolobae uviferae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BỘ Y TẾ ----------------- NGUYỄN THU ÁNH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ NHO BIỂN (Folium Coccolobae uviferae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BỘ Y TẾ ----------------- NGUYỄN THU ÁNH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ NHO BIỂN (Folium Coccolobae uviferae) Chuyên ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 60 72 04 06 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. VÕ VĂN LẸO Thành phố Hồ Chí Minh - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Nguyễn Thu Ánh TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược sĩ – năm học 2015 – 2017 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ NHO BIỂN (Folium Coccolobae uviferae) Nguyễn Thu Ánh Người hướng dẫn khoa học: TS. Võ Văn Lẹo Mở đầu Nho biển, Coccoloba uvifera Linn. Polygonaceae, là một cây thuộc họ Polygonaceae. Từ lâu, tại các nước thuộc vùng biển Địa Trung Hải, Nho biển đã được sử dụng như một dược liệu để điều trị tiêu chảy, kiết lỵ, kích ứng da, hen suyễn nhưng ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của dược liệu này. Do vậy, chúng tôi tiến hành luận văn “Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của lá Nho biển Coccoloba uvifera Linn.” với mục đích phân lập các hợp chất từ lá cây Nho biển theo định hướng chống oxy hóa trên mô hình DPPH nhằm khẳng định giá trị sử dụng của cây này. Đối tượng: Lá Nho biển Coccoloba uvifera Linn. Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc bằng mô hình DPPH, ngấm kiệt ngược dòng, chiết phân bố lỏng – lỏng, sắc ký cột nhanh, kết tinh lại và một số phương pháp khác. Kết quả và bàn luận Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa bằng thử nghiệm DPPH trên các cao phân đoạn của lá Nho biển cho thấy cao ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất (66,56 %). Lá Nho biển (12 kg) sau khi qua những kỹ thuật như ngấm kiệt, lắc phân bố, sắc ký cột và những kỹ thuật tinh chế khác kết hợp các dữ liệu phổ UV, MS, NMR thu được 905,6 mg quercetin, 47,53 mg avicularin, 24,51 mg quercitrin, 279,62 mg quercetin và 38,77 mg myricetin. Kết quả đo IC50 của các chất phân lập được như sau: myricetin (2,12 µg/ml), quercetin (2,19 µg/ml), acid ascorbic (2,29 µg/ml), avicularin (2,56 µg/ml), cao ethyl acetat (3,00 µg/ml), quercitrin (3,82 µg/ml), isoquercitrin (3,94 µg/ml). Kết luận Kết quả làm sáng tỏ thành phần hóa học của lá Nho biển, tạo tiền đề cho công tác thử các tác động dược lý sau này cũng như góp phần nâng cao giá trị sử dụng lá Nho biển. Thesis of master of pharmacy, course: 2015 – 2017 Major: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION FOR THE ANTIOXIDANT CONSTITUENTS OF FOLIUM COCCOLOBAE UVIFERAE Nguyen Thu Anh Supervisor: Dr. Vo Van Leo Introduction Coccoloba uvifera Linn. has been used as a medicine in Mediterranean, to treat bleeding, dysentery, skin irritation and asthma. However, in Vietnam, there is no research on the chemical compositions and the pharmacological activities of the leaves of this plant. For this reason, we carried out the research “Bioactive-guided isolation for the antioxidant constituent of Coccoloba uvifera Linn.”, to reach some goals such as extraction, isolation, structural elucidation of some isolated substances for the antioxidant acitivity on DPPH of the leaves of Coccoloba uvifera Linn. Materials: the leaves of Coccoloba uvifera Linn. Methods DPPH assay, maceration, distribution of liquid-liquid extraction, vacuum liquid chromatography, methods of recrystallization. Results and discussions The results of DPPH method showed that ethyl acetate had the highest antioxidant activity (66,56 %). The leaf of Coccoloba uvifera Linn. (12 kg) was macerated with 80 % alcohol, by using some common methods, especially Vaccum liquid chromatography, methods of recrystallization, combined with UV, MS, NMR, we isolated 905,6 mg of quercetin, 47,53 mg avicularin, 24,51 mg quercitrin, 279,62 mg quercetin and 38,77 mg myricetin IC50 values of isolated substances were as follows: myricetin (2,12 µg/ml), quercetin (2,19 µg/ml), ascorbic acid (2,29 µg/ml), avicularin (2,56 µg/ml), ethyl acetat extract (3,00 µg/ml), quercitrin (3,82 µg/ml), isoquercitrin (3,94 µg/ml). Conclusion The result clarified more obviously about chemical components of C.uvifera, it laid the basis for control experiments and pharmacological testings. i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ..................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ vi DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ vii MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................3 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC ...............................................................3 1.1.1 Vị trí phân loại ...............................................................................................3 1.1.2 Đặc điểm của họ Polygonaceae (Họ Rau răm) [2] ........................................3 1.1.3 Đặc điểm của chi Coccoloba [16, 22, 23, 26] ...............................................4 1.1.4 Đặc điểm về thực vật học của cây Nho biển .................................................5 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................................7 1.2.1 Thành phần hóa học của chi Coccoloba [19, 34] ..........................................7 1.2.2 Thành phần hóa học của cây Nho biển ..........................................................8 1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG CỦA CÂY NHO BIỂN ............10 1.3.1 Tác dụng dược lý .........................................................................................10 1.3.2 Tính vị, công năng .......................................................................................13 1.3.3 Công dụng của Nho biển trong y học cổ truyền ..........................................13 1.4 TỔNG QUAN VỀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA – GỐC TỰ DO ....................13 1.4.1 Khái niệm về gốc tự do [15] ........................................................................13 1.4.2 Bản chất của gốc tự do [12] .........................................................................14 1.4.3 Tác động của gốc tự do và liên quan đến bệnh tật con người .....................14 1.4.4 Các chất chống oxy hóa ...............................................................................15 1.4.5 Tác động chống oxy hóa của flavonoid .......................................................16 1.4.6 Thử nghiệm đánh giá HTCO in vitro [33, 37].............................................16 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................22 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..........................................................................22 2.1.1 Nguyên liệu..................................................................................................22 2.1.2 Dung môi và hóa chất ..................................................................................22 ii 2.1.3 Dụng cụ, trang thiết bị .................................................................................22 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................23 2.2.1 Nghiên cứu thực vật học ..............................................................................23 2.2.2 Thử tinh khiết [7] .........................................................................................24 2.2.3 Xác định chất chiết được trong dược liệu....................................................24 2.2.4 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật .....................................................24 2.2.5 Chiết xuất cao toàn phần .............................................................................25 2.2.6 Tách các phân đoạn bằng chiết phân bố lỏng – lỏng...................................25 2.2.7 Phương pháp sàng lọc tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in vitro ........25 2.2.8 Phân lập và tinh chế các chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa. ...............27 2.2.9 Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được. ...........................................28 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................30 3.1 NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC ..................................................................30 3.1.1 Đặc điểm hình thái lá Nho biển ...................................................................30 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu của lá Nho biển...............................................................30 3.1.3 Soi bột lá Nho biển (40X)............................................................................32 3.2 THỬ TINH KHIẾT ..........................................................................................32 3.2.1 Xác định độ ẩm ............................................................................................32 3.2.2 Xác định độ tro ............................................................................................32 3.3 HÀM LƯỢNG CHẤT CHIẾT ĐƯỢC TRONG LÁ NHO BIỂN ...................33 3.4 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC ..............................................................................33 3.4.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật .....................................................33 3.4.2 Chiết xuất và phân lập các chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa ............34 3.4.3 Kiểm tra khả năng chống oxy hóa của các cao chiết phân đoạn .................35 3.4.4 Phân lập chất từ cao EA ..............................................................................38 3.4.5 Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được bằng SKLM .......................41 3.4.6 Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được bằng UPLC ........................43 3.4.7 Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được ............................................45 3.4.8 Tóm tắt kết quả của quá trình chiết xuất và phân lập ..................................73 iii 3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỒNG OXY HÓA TRÊN CHẤT TINH KHIẾT....................................................................................................73 3.5.1 Định tính bằng SKLM .................................................................................73 3.5.2 Thử HTCO của các chất phân lập bằng phương pháp DPPH .....................74 BÀN LUẬN ..............................................................................................................82 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................................84 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................86 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ tắt Ý nghĩa Chữ nguyên 1 13 13 Cộng hưởng từ hạt nhân C13 2 1 1 Cộng hưởng từ hạt nhân proton 3 br broad Đỉnh rộng 4 d doublet Đỉnh đôi 5 dd Doublet of doublets Đỉnh đôi kép 6 DĐVN Dược điển Việt Nam 7 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 8 DMSO dimethyl sulfoxid 9 DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 10 EA Ethyl acetat 11 HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị nhân qua nhiều nối 12 HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ tương tác dị nhân qua một nối 13 HTCO Hoạt tính chống oxy hóa 14 IC50 Inhibitor concentration 50% Nồng độ ức chế 50% 15 IR Infrared Specroscopy Phổ hồng ngoại 16 J Coupling constant Hằng số ghép 17 m multiplet Đỉnh đa, đỉnh bội 18 MDA Malonyl dialdehyd 19 MeOH Methanol 20 MHz Mega hertz 21 MS Mass Spectroscopy Phổ khối 22 NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 23 ppm parts per million Phần triệu 24 PDA Photodiode Array Dãy diod quang 25 s singlet Đỉnh đơn 26 SKC Sắc ký cột 27 SKĐ Sắc ký đồ 28 SKLM Sắc ký lớp mỏng C-NMR H-NMR C-Nuclear Magnetic Resonance H-Nuclear Magnetic Resonance v STT Chữ tắt Ý nghĩa Chữ nguyên Đỉnh ba 29 t triplet 30 TLTK Tài liệu tham khảo 31 TT Thuốc thử 32 UPLC Ultra PerformanceLiquid Chromatography Sắc ký lỏng siêu cao áp 33 UV-Vis Ultraviolet and Visible Tử ngoại khả kiến 34 VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký (cột) chân không 35 VS Vanillin-acid sulfuric vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số loài của chi Coccoloba .............................................................................. 5 Bảng 1.2. Thành phầ n hóa ho ̣c có trong quả Nho biể n .......................................................... 9 Bảng 1.3. Hoa ̣t tiń h chố ng oxi hóa của Nho biể n ................................................................ 11 Bảng 2.4. Cách pha mẫu đo của phương pháp DPPH ......................................................... 26 Bảng 3.5. Kết quả thử tinh khiết của bột lá Nho biển .......................................................... 33 Bảng 3.6. Hàm lượng chất chiết được của dược liệu lá Nho biển (%) ................................ 33 Bảng 3.7. Kết quả chiết phân bố cao cồn............................................................................. 35 Bảng 3.8. Kết quả thử nghiệm HTCO bằng phương pháp DPPH trên các mẫu cao ........... 37 Bảng 3.9. Các phân đoạn của cao EA thu được qua VLC ................................................... 38 Bảng 3.10. Các hệ dung môi kiểm tra độ tinh khiết COC-1, COC-2, COC-3, COC-4 và COC-5 .................................................................................................................................. 42 Bảng 3.11. Kết quả phân tích UPLC của COC-1, COC-2, COC-3, COC-4, COC-5 .......... 44 Bảng 3.12. So sánh dữ liệu phổ NMR của COC-1 và quercetin (đo trong DMSO-d6) [30] .... 47 Bảng 3.13. So sánh dữ liệu phổ NMR của COC-2 và avicularin (đo trong DMSO-d6) [18] ... 52 Bảng 3.14. So sánh dữ liệu phổ NMR của COC-3 và quercitrin (đo trong DMSO-d6) [18] .... 58 Bảng 3.15. So sánh dữ liệu phổ NMR của COC-4 và isoquercitrin (đo trong DMSO-d6) [11] .. 64 Bảng 3.16. So sánh dữ liệu phổ NMR của COC-5 và myricetin (đo trong DMSO-d6) [25] .... 70 Bảng 3.17. Kết quả thử HTCO của cao EA ......................................................................... 75 Bảng 3.18. Kết quả thử HTCO của acid ascorbic ................................................................ 76 Bảng 3.19. Kết quả thử HTCO của Quercetin ..................................................................... 77 Bảng 3.20. Kết quả thử HTCO của Myricetin ..................................................................... 78 Bảng 3.21. Kết quả thử HTCO của Avicularin .................................................................... 79 Bảng 3.22. Kết quả thử HTCO của Quercitrin .................................................................... 80 Bảng 3.23. Kết quả thử HTCO của Isoquercitrin ................................................................ 81 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vị trí phân loại của cây Nho biển (Coccoloba uvifera L.) ..................................... 3 Hình 1.2 Cây Nho biển Coccoloba uvifera Linn. .................................................................. 6 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học thường gặp trong một số loài thuộc chi Coccoloba ................... 7 Hình 1.4 Flavonoid trong lá Nho biể n ................................................................................... 8 Hình 1.5 Anthocyanidin trong lá Nho biể n............................................................................ 8 Hình 1.6 Anthranoid trong lá Nho biể n ................................................................................. 9 Hình 1.7. Terpenoid và phytosterol trong lá Nho biể n .......................................................... 9 Hình 1.8. Thành phầ n hóa ho ̣c ha ̣t Nho biể n ....................................................................... 10 Hình 1.9. Phản ứng trung hòa gốc DPPH ............................................................................ 18 Hình 2.10 Sơ đồ nghiên cứu chung ..................................................................................... 23 Hình 2.11. Sơ đồ chiết xuất cao cồn toàn phần lá Nho biển ................................................ 25 Hình 3.12. Lá Nho biể n Coccoloba uvifera L., Polygonaceae ............................................ 30 Hình 3.13. Vi phẫu phiến lá Nho biể n ................................................................................. 31 Hình 3.14. Cấu tạo giải phẫu lá Nho biển ............................................................................ 31 Hình 3.15. Hình ảnh soi bột lá Nho biển ............................................................................. 32 Hình 3.16. Sơ đồ chiết xuất dược liệu Nho biển .................................................................. 34 Hình 3.17. Sơ đồ chiết phân bố lỏng – lỏng với cao cồn Nho biển ..................................... 34 Hình 3.18. SKLM kiểm tra các cao phân bố ....................................................................... 35 Hình 3.19. SKĐ của các cao phân đoạn Nho biển với TT DPPH ....................................... 36 Hình 3.20. Biểu đồ kết quả thử HTCO của các phân đoạn cao chiết .................................. 37 Hình 3.21. SKĐ các phân đoạn của cao EA qua cột VLC .................................................. 39 Hình 3.22. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ các phân đoạn cột VLC ................................... 41 Hình 3.23. SKĐ kiểm tra độ tinh khiết của COC-1, COC-2, COC-5 .................................. 42 Hình 3.24. SKĐ kiểm tra độ tinh khiết của COC-3, COC-4 ............................................... 43 Hình 3.25. SKĐ của UPLC COC-1, COC-2, COC-3, COC-4, COC-5 ............................... 45 Hình 3.26. Phổ MS của COC-1 ........................................................................................... 45 Hình 3.27. Phổ UV (MeOH) của COC-1............................................................................. 46 Hình 3.28. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của COC-1 ............................................ 48 Hình 3.29. Phổ 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của COC-1 (δC 90-175 ppm)................. 49 Hình 3.30. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của COC-1 ............................................. 49 viii Hình 3.31. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của COC-1 (δH 6,1-7,8 ppm) ................. 50 Hình 3.32. Phổ MS của COC-2 ........................................................................................... 50 Hình 3.33. Phổ UV (MeOH) của COC-2............................................................................. 51 Hình 3.34. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của COC-2 (δC 60-180 ppm)................. 53 Hình 3.35. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của COC-2 ............................................. 54 Hình 3.36. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của COC-2 (δH 5,4-7,7 ppm) ................. 54 Hình 3.37. Phổ DEPT (DMSO-d6, 125 MHz) của COC-2 (60 – 125 ppm) ....................... 55 Hình 3.38. Phổ MS của COC-3 ........................................................................................... 56 Hình 3.39. Phổ UV (MeOH) của COC-3............................................................................. 56 Hình 3.40. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của COC-3 (δC 90-180 ppm)................. 59 Hình 3.41. Phổ 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của COC-3 (δC 15-75 ppm)................... 60 Hình 3.42. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của COC-3 ............................................. 60 Hình 3.43. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của COC-3 (δH 6,1-7,4 ppm) ................. 61 Hình 3.44. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của COC-3 (δH 0,7-5,4 ppm) ................. 61 Hình 3.45. Phổ MS của COC-4 ........................................................................................... 62 Hình 3.46. Phổ UV (MeOH) của COC-4............................................................................. 62 Hình 3.47. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của COC-4 ............................................. 65 Hình 3.48. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của COC-4 (δH 6,0-7,8 ppm) ................. 66 Hình 3.49. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của COC-4 (δH 3,0-5,8 ppm) ................. 66 Hình 3.50. Phổ 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của COC-4 ............................................ 67 Hình 3.51. Phổ 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của COC-4 (δH 60-180 ppm) ................ 67 Hình 3.52. Phổ MS của COC-5 ........................................................................................... 68 Hình 3.53. Phổ UV (MeOH) của COC-5............................................................................. 68 Hình 3.54. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của COC-5 ............................................ 71 Hình 3.55. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của COC-5 ............................................. 72 Hình 3.56. Phổ DEPT (DMSO-d6, 125 MHz) của COC-5 (95 – 175 ppm) ....................... 72 Hình 3.57. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân lập các chất .......................................................... 73 Hình 3.58. SKĐ của các chất được phân lập với TT DPPH ................................................ 74 Hình 3.59. HTCO của cao EA ............................................................................................. 75 Hình 3.60. HTCO của acid ascorbic .................................................................................... 76 Hình 3.61. HTCO của Quercetin ......................................................................................... 77 Hình 3.62. HTCO của Myricetin ......................................................................................... 78 ix Hình 3.63. HTCO của Avicularin ........................................................................................ 79 Hình 3.64. HTCO của Quercitrin......................................................................................... 80 Hình 3.65. HTCO của Isoquercitrin..................................................................................... 81 1 MỞ ĐẦU Việt Nam là một quốc gia có tiềm năng lớn về dược liệu trong khu vực Đông Nam Á và trên thế giới. Đến năm 2016, Việt Nam đã có trên 5000 loài thực vật được sử dụng làm thuốc; trong đó có gần 200 loài có tiềm năng khai thác và phát triển trồng để đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nước và hướng tới xuất khẩu. Với thế mạnh về nguồn tài nguyên dược liệu, cộng đồng dân tộc Việt Nam đã tích lũy được những kinh nghiệm và truyền thống lâu đời trong sử dụng các loại cây, con làm thuốc góp phần hình thành nên một kho tàng tri thức khổng lồ mang bản sắc riêng theo từng dân tộc, từng vùng miền. Thế giới đang có xu hướng sử dụng các hợp chất thiên nhiên có trong cây cỏ, nhằm hạn chế tối đa việc đưa các chất hóa học tổng hợp vào cơ thể gây độc hại. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, khoảng 80% dân số ở các nước đang phát triển sử dụng y học cổ truyền hoặc thuốc từ thảo dược để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Tuy nhiên, điều kiện sống hiện nay đang bị ô nhiễm, nhiều yếu tố gây stress đã làm gia tăng gốc tự do trong cơ thể và hệ thống chất oxy hóa nội sinh không đủ sức cân bằng, gây ra các bệnh lý như tim mạch, bệnh thần kinh, đục thủy tinh thể, thoái hóa điểm vàng ở mắt, các bệnh ung thư và các hiện tượng lão hóa. Khi đó, cơ thể bạn cần được bổ sung các chất chống oxy hóa để tạo lập lại cân bằng giữa chất chống oxy hóa và các gốc tự do. Do đó, việc tìm ra các chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên để làm thuốc phòng và chữa các bệnh trên là nhiệm vụ của ngành Dược nhằm nâng cao sức khỏe và tuổi thọ con người cũng như giải quyết nhu cầu thực tế của người dân trong xã hội. Từ lâu, Nho biển đã được sử dụng trong y học cổ truyền tại các nước thuộc vùng biển Địa Trung Hải. Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của Nho biển bao gồm flavonoid, anthocyanidin, anthranoid, các hợp chất terpenoid và phytosterol; nhưng số lượng nghiên cứu còn ít. Chủ yếu các nghiên cứu tập trung về tác dụng dược lý của lá Nho biển như hạ đường huyết, chống tia cực tím, kháng khuẩn, kháng nấm, 2 chống oxy hóa, v.v… Trong số đó, tác dụng hạ đường huyết đã được chứng minh trong bằng sáng chế “Phương pháp điều chỉnh lượng đường huyết bằng Coccoloba uvifera” được nhiều sự quan tâm bởi đây có thể là một phương thuốc điều trị mới không có tác dụng phụ trong quá trình điều trị so với các thuốc tân dược đang sử dụng vốn có khá nhiều tác dụng phụ. Tuy nhiên, ở Việt Nam, việc sử dụng lá Nho biển chưa được biết đến và gần như không có công trình nghiên cứu nào về cây này. Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của lá Nho biển” với các mục tiêu sau: 1. Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn chiết từ lá Nho biển. 2. Phân lập và xác định cấu trúc của các hoạt chất chính từ cao có tác dụng chống oxy hóa mạnh thông qua sàng lọc trên mô hình DPPH. 3. Thử hoạt tính chống oxy hóa của chất tinh khiết thu được sau khi phân lập. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Vị trí phân loại Theo hệ thống Takhtajan (2009), cây Nho biển có vị trí phân loại như sau [40] : Giới Plantae (Giới thực vật) Ngành Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan) Lớp Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan) Phân lớp Caryophyllidae (Phân lớp Cẩm chướng) Bộ Polygonales (Bộ Rau răm) Họ Polygonaceae (Họ Rau răm) Chi Coccoloba P. Browne Loài Coccoloba uvifera L. (Nho biển) Hình 1.1 Vị trí phân loại của cây Nho biển (Coccoloba uvifera L.) 1.1.2 Đặc điểm của họ Polygonaceae (Họ Rau răm) [2] Phần lớn là cỏ sống nhiều năm nhờ củ, đôi khi là dây leo, có vài trường hợp là cây gỗ. Cành có thể biến đổi thành lá (diệp chi) trong khi đó lá thu hẹp thành vẩy và rụng sớm. Rễ có thể phồng lên thành củ. Lá đơn, mọc so le. Phiến nguyên, hình mũi tên hoặc có thùy hình chân vịt; cuống lá rộng ở đáy, có bẹ chìa. Cụm hoa xim 2 ngả hoặc 1 ngả, thu hẹp thành đầu hay thành vòng giả ở nách lá hoặc thành chùm, gié ở ngọn cành. Hoa lưỡng tính, đều, không có cánh hoa. Bao hoa là những phiến cùng màu dạng lá đài hay cánh hoa xếp 2 vòng, mỗi vòng có 3 phiến 4 hoặc 5 phiến xếp xoắn, tiền khai năm điểm. Bộ nhị có 2 kiểu: kiểu vòng và kiểu xoắn ốc. Kiểu vòng: 6 nhị xếp trên 2 vòng, xen kẽ với các phiến của bao hoa. Đôi khi có vài thay đổi: ở Rheum, vòng ngoài có 6 nhị, vòng trong có 3 nhị; ở Rumex, hoa chỉ có 6 nhị của vòng ngoài, vòng trong bị trụy. Kiểu xoắn ốc có 5 – 8 nhị. Bộ nhụy có 3 hay 2 lá noãn tạo thành bầu trên, có 3 cạnh hay hình thấu kính, 1 ô, 1 noãn thẳng đính ở đáy. Vòi nhụy rời. Quả bế, có 3 cạnh hay hình thấu kính, được bao bọc bởi các lá đài còn lại. Đôi khi lá đài có thể mọng lên và quả trở thành một quả mọng giả. Hạt có nội nhũ bột, mầm thẳng hay cong với xu hướng nằm bên ngoài nội nhũ. Phân loại: Họ Rau răm được chia làm 3 phân họ: Polygonoideae, Eriogonoideae và Symmerioideae. Các loài thuộc Polygonoideae thường không có tổng bao hoa, có bẹ chìa, một số bẹ chìa có tua lông; gồm 15 – 20 chi và 590 loài. Trong số gần 30 chi, 520 loài thuộc phân họ Eriogonoideae chỉ tập trung ở khu vực Châu Mỹ. Phân họ Symmerioideae với 1 loài Symmeria paniculata được tìm thấy ở miền Bắc Nam Mỹ và Tây Phi. Ở Việt Nam có khoảng 11 chi: Aconogonum, Antenoron, Antigonum, Cephalophilon, Chylocalyx, Coccoloba, Fagopyrum, Fallopia, Homalocladium (Muehlenbeckia), Persicaria, Polygonum, Reynoutria, Rheum, Rumex, Truellum; khoảng 45 loài. Giá trị kinh tế: Làm cây cảnh, lấy gỗ (Triplaris), lương thực (Coccoloba uvifera, Fagopyrum, Rheum rhabarbarum, Rumex acetosa). 1.1.3 Đặc điểm của chi Coccoloba [16, 22, 23, 26] Chi Coccoloba rất đa dạng, hiê ̣n nay có trên 120 loài, đươ ̣c phát hiê ̣n ở Châu My.̃ Trong đó phổ biế n nhấ t là 3 loài: Coccoloba pubescens, Coccoloba swartzii, Coccoloba uvifera. Phân bố chủ yế u ở vùng nhiê ̣t đới, câ ̣n nhiê ̣t đới bao gồm vùng Caribe, Trung My,̃ Nam My.̃ 5 Các loài thuộc chi Coccoloba có thể là cây bu ̣i hoă ̣c cây gỗ, hầ u hế t là cây thường xanh và đơn tính. Cây mang hoa đực chỉ mang mô ̣t vài hoa ta ̣i mỗi nút của cu ̣m hoa trong khi hoa cái đươ ̣c sinh ra đơn lẻ ta ̣i các nút trên tru ̣c cu ̣m hoa. Bao hoa đươ ̣c xẻ thùy, đế hoa phát triể n thành quả bế . Bảng 1.1. Một số loài của chi Coccoloba Loài Tên tiếng anh Phân bố C. ascendens Duss ex Lindau Ascending seagrape Panama, Colombia, Venezuela, Peru C. barbadensis Jacq. Barbados seagrape Mexico, Cuba, Hondurat, Haiti C. costata C.Wright Ribbed seagrape Peru, Cuba, Mehico C. diversifolia Jacq. Tietongue Trung My,̃ Nam Mỹ C. mollis Casar. Soft seagrape Panama, vùng Nam Mỹ C. pubescens L. Grandleaf seagrape Dominicana, Peru, Haiti C. swartzii Meisn. Red seagrape Mehico, Brazil, Venezuela,…. C. uvifera L. Seagrape Trung Mỹ, Nam Mỹ, Đông Nam Á 1.1.4 Đặc điểm về thực vật học của cây Nho biển Đặc điểm thực vật Tên Khoa học: Coccoloba uvifera L. (Polygonaceae) Tên Việt Nam: Nho biển Đồ ng danh: Coccolobis uvifera (L.) Crantz, Coccolobis uvifera (L.) Jacq., Polygonum uvifera L. [31] Tên nước ngoài: Bay grape, Sea grapes, Beagrape (Jamaica), Seegrape (Colombia), Guaiabara (Haiti, Dominicana), Mazana (Mexico), Uva de playa (Tây Ban Nha), Seetraube (Đức), …[22] Cây gỗ, tàng râ ̣m, cao 2-15 m; cành mập mạp, có gai thịt có lông. Lá có phiế n tròn, to 12-15cm, dày, bìa nguyên; cuố ng lá mâ ̣p ma ̣p có be ̣ chià ngắ n, đỏ. Gân lá hình lông chim, màu đỏ. 6 Hoa đơn tiń h, khác gố c. Hoa da ̣ng chùm dài 10 – 20 cm, thơm màu lu ̣c vàng; tiể u nhu ̣y 8; và tiể u nhu ̣y lép; noañ có 3 vòi ngu ̣y ngắ n. Trái trong đài đồ ng trưởng phù mâ ̣p, to 1 cm. Khi chưa chín, quả có màu trắ ng xanh, khi chín, quả có màu hồ ng tím. [3, 41] Cây có thể cao 2-15 m Lá Nho biể n Hoa Nho biể n Quả Nho biển Hình 1.2 Cây Nho biển Coccoloba uvifera Linn. Phân bố - sinh thái – bộ phận dùng Sinh thái: Nho biển là cây ưa sáng, có khả năng chịu mặn, chịu hạn. Mùa hoa thường từ tháng 4 – 6, mùa thay lá tháng 3 – 4. Phân bố: Nho biển có nguồn gốc từ Trung Mỹ. Hiện nay được trồng rộng rãi trên các nước nhiệt đới và câ ̣n nhiê ̣t, nhiề u nhấ t ở: vùng biể n Caribe, Nam My,̃ Đông Nam Á, Ú c. Ở Việt Nam, cây được trồng nhiều ở dọc bờ biển: Đà Nẵng, Bình Định, Nha Trang, Bình Thuận, Vũng Tàu và một số đảo ở Hoàng Sa, Trường Sa. [31] Bộ phận dùng: Nhiề u bô ̣ phâ ̣n của cây Nho biể n đươ ̣c sử du ̣ng: rễ, vỏ cây, lá cây, trái, ha ̣t.