Tài liệu Khảo sát tác động trên sự tăng sinh in vitro của tế bào đơn nhân máu ngoại vi người (pbmcs) và hoạt tính chống oxy hóa của một số dược liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------- LÊ THỊ THẢO NGUYÊN KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRÊN SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI (PBMCs) VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU Luận văn Thạc sĩ Dược học Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------- LÊ THỊ THẢO NGUYÊN KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRÊN SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI (PBMCs) VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU Ngành: Dược lý và Dược lâm sàng Mã số: 8720205 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Thị Minh Thuận Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Lê Thị Thảo Nguyên iv Luận văn thạc sĩ – Khóa 2016 -2018 Ngành: Dược lý và Dược lâm sàng – Mã ngành: 8720205 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRÊN SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI (PBMCs) VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU Lê Thị Thảo Nguyên Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Minh Thuận Từ khóa: chiết xuất dược liệu, PBMCs, interleukin – 2, TCD3+/CD4+, TCD3+/CD8+, độc tế bào, chống oxy hóa. Mở đầu: Hệ miễn dịch đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân có hại. Tuy nhiên, khi hệ miễn dịch hoạt động thấp hoặc quá mức có thể gây ra các bệnh lý suy giảm miễn dịch, quá mẫn hoặc viêm, bệnh tự miễn. Hiện nay có nhiều dược liệu dùng trong điều trị các bệnh liên quan đến hệ miễn dịch, tuy nhiên cơ chế tác động còn chưa rõ. Đề tài được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của một vài dược liệu ở Việt Nam trên sự tăng sinh in vitro tế bào PBMCs, đồng thời khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các dược liệu này. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tế bào PBMCs được phân lập từ máu toàn phần người khỏe mạnh. Thử nghiệm MTT được dùng để khảo sát tác động của 13 cao cồn 96% dược liệu và 24 cao phân đoạn trên sự tăng sinh in vitro PBMCs. Định lượng interleukin – 2 (IL – 2) tiết ra bởi PBMCs trong môi trường có cao phân đoạn bằng phương pháp ELISA. Chọn cao ức chế mạnh nhất, đánh giá sự gây chết theo chu trình (apoptosis) và thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ và TCD3+/CD8+ bằng phương pháp đếm tế bào theo dòng. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao toàn phần và phân đoạn bằng thử nghiệm DPPH. Kết quả: 6 cao toàn phần ức chế và 2 cao toàn phần kích thích tăng sinh PBMCs đã được xác định. Các phân đoạn cao ức chế làm giảm sự tiết IL – 2, trong khi các cao kích thích không làm tăng IL – 2 so với nhóm chứng. Cao sài đất phân đoạn cloroform ức chế tăng sinh PBMCs mạnh nhất (IC50 =16,12 ppm), làm tỷ lệ apoptosis tăng 19,1% (p < 0,05) và tỷ lệ TCD3+/CD4+ giảm 4,18% so với nhóm chứng. Cao trầu không phân đoạn cloroform có tính chống oxy hóa mạnh gấp 2,1 lần (EC50 = 1,94 ppm) so với vitamin C. Kết luận: Cao sài đất cloroform ức chế tăng sinh PBMCs mạnh nhất với IC50 = 16,12 ppm. Kết quả trong nghiên cứu này là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo để xác định chất có hoạt tính ức chế tăng sinh PBMCs trong cây sài đất để ứng dụng trong điều trị các bệnh lý liên quan đến miễn dịch. v Master’s Thesis – Acedemic course: 2016 – 2018 Specialty: Pharmacology and Clinical Pharmacy – Code: 8720205 STUDY ON THE EFFECT OF SOME MEDICINAL PLANTS ON IN VITRO PROLIFERATION OF PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS AND THEIR ANTIOXIDANT ACTIVITY Thao Nguyen Le Thi Supervisor: Dr. Minh Thuan Nguyen Thi Keywords: plant extracts, PBMCs, Interleukine – 2, TCD3+CD4+, TCD3+CD8+, cytotoxicity, antioxidant. Introduction The immune system plays an essential role in safeguarding our body from surrounding detrimental factors in the environment. Nevertheless, when this system functions abnormally (underactive or overactive), it can result in immune-related diseases, namely immunodeficiency, hypersensitivity, inflammation, or autoimmune diseases. Medicinal plants have been used widely in the treatment of immune-related diseases, yet little is known about their mechanisms of action. Therefore, this study was conducted to study the effect of some medicinal plants on in vitro proliferation of peripheral blood mononuclear cells and their antioxidant activity. Materials and methods PBMCs isolated from whole blood of healthy donors. MTT assay was used to evaluate the effect of thirteen extracts in 96% ethanol and twenty four fractionated extracts on PBMCs in vitro proliferation. IL – 2 concentrations secreted by extracts – treated PBMCs were quantitated using ELISA. The plant extract that showed the strongest inhibitory effect on PBMCs in vitro proliferation was chosen to evaluate the apoptosis/necrosis and ratios of TCD3+/CD4+ and TCD3+/CD8+ of PBMCs. Antioxidant activities of 96% ethanol extracts and fractionated extracts were assessed using the DPPH method. Results Of the 13 ethanol 96% extracts, 6 extracts inhibited and 2 extracts stimulated the in vitro proliferation of PBMCs. The extracts with inhibitory effects reduced the amount of IL – 2, whilst the extracts with stimulatory effects were unable to increase the amount of IL – 2 compared to untreated cells (control). The chloroform extract of Wedelia chinesis showed strongest inhibitory activity with an IC50 value of 16.1 ppm, exerting an increase of 19.1% in apoptosis and a decrease of 4.18% in TCD3+/CD4+ ratio compared to untreated cells. The chloroform extract of Piper betle showed a strong antioxydant activity with an EC50 of 1.94 ppm, as 2.1 times higher than that of vitamin C. Conclusion The chloroform extract of Wedelia chinensis had a potential of being used in the treatment of autoimmune diseases. Further studies are needed to isolate and identify the compounds that contribute to this activity. vi MỤC LỤC 1.1. Tổng quan về mô hình PBMCs in vitro ...............................................................3 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm tế bào PBMCs ............................................................3 1.1.1. Cách phân lập PBMCs ...................................................................................4 1.1.2. Ứng dụng của PBMCs trong nghiên cứu khoa học .......................................4 1.1.2. Các phương pháp đo lường sự tăng sinh in vitro PBMCs ................................6 1.2. Stress oxy hóa ......................................................................................................8 1.3. Một số hợp chất có tính chống oxy hóa ...............................................................9 1.4. Các phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa in vitro ............................10 1.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .....................................................................10 1.5.1. Ứng dụng y học cổ truyền trong điều trị bệnh lý miễn dịch ...........................10 1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ..................................................................15 2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................21 vii 2.2. Hóa chất, thuốc thử, nguyên vật liệu..................................................................22 2.2.1. Các dược liệu khảo sát ....................................................................................22 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất - thuốc thử ..............................................................23 2.3.1. Thiết bị ............................................................................................................23 2.3.2. Dụng cụ ...........................................................................................................24 2.3.3. Hóa chất – thuốc thử .......................................................................................24 2.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...............................................................25 2.4.1. Quy trình điều chế cao toàn phần ethanol 96% ..............................................25 2.4.2. Phân lập PBMCs .............................................................................................27 2.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi DMSO lên sự tăng sinh in vitro PBMCs bằng thử nghiệm MTT ..............................................................................................27 2.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của các cao toàn phần ethanol trên sự tăng sinh in vitro PBMCs bằng thử nghiệm MTT.................................................................................28 2.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của các cao chiết phân đoạn trên sự tăng sinh in vitro PBMCs bằng thử nghiệm MTT.................................................................................30 2.4.6. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao dược liệu toàn phần và phân đoạn bằng thử nghiệm DPPH ............................................................................................31 2.4.7. Đánh giá tác động của cao chiết phân đoạn trên quá trình apoptosis/necrosis của PBMCs bằng phương pháp nhuộm Annexin V và Propidium iodide (PI). ........32 2.4.8. Đánh giá tác động của các cao chiết phân đoạn trên sự sản xuất Interleukin – 2 của PBMCs.............................................................................................................33 2.4.9. Đánh giá sự thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ và TCD3+/CD8+ trong các tế bào lympho T dưới tác động của cao chiết phân đoạn ức chế mạnh nhất sự tăng sinh tế bào PBMCs ...............................................................................................................34 2.4.10. Phân tích thống kê .........................................................................................35 viii 3.1. Dược liệu ............................................................................................................36 3.1.1. Độ ẩm và độ tro toàn phần ..............................................................................36 3.1.2. Chiết cao cồn toàn phần ..................................................................................37 3.2. Khảo sát độc tính của DMSO trên PBMCs........................................................38 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các cao chiết dược liệu toàn phần trên sự tăng sinh in vitro PBMCs ..................................................................................................40 3.4. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật các dược liệu có hoạt tính trên sự tăng sinh in vitro PBMCs ..................................................................................................50 3.5. Quy trình chiết các cao phân đoạn bằng phương pháp lắc phân bố lỏng – lỏng51 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các cao chiết phân đoạn trên sự tăng sinh in vitro PBMCs..............................................................................................................52 3.6.1. Nhóm cao có hoạt tính kích thích tăng sinh in vitro PBMCs .........................52 3.6.2. Nhóm cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs ...............................54 3.7. Phân tích sơ bộ các thành phần trong cao phân đoạn ........................................61 3.7.1. Nhóm cao có hoạt tính kích thích tăng sinh in vitro PBMCs .........................61 3.7.2. Nhóm cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs ...............................62 3.8. Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao dược liệu toàn phần và phân đoạn bằng thử nghiệm DPPH ....................................................................................63 3.9. Đánh giá tác động gây độc của cao chiết phân đoạn lên tế bào PBMCs bằng phương pháp nhuộm Annexin V và Propidium iodide (PI) ......................................65 3.10. Kết quả đánh giá tác động của các cao chiết phân đoạn trên sự sản xuất IL – 2 của PBMCs................................................................................................................66 ix 3.11. Kết quả đánh giá sự thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ và TCD3+/CD8+ trong các tế bào lympho T dưới tác động của cao chiết phân đoạn ức chế mạnh nhất sự tăng sinh tế bào PBMCs ....................................................................................................67 4.1. Độc tính của DMSO trên PBMCs ......................................................................69 4.2. Thử nghiệm MTT để đánh giá tác động của các cao chiết trên sự tăng sinh in vitro PBMCs..............................................................................................................70 4.2.1. Khả năng chống oxy hóa của cao dược liệu toàn phần và các cao phân đoạn71 4.3. Mối liên quan giữa khả năng chống oxy hóa và khả năng chống tăng sinh PBMCs in vitro .........................................................................................................72 4.4. Đánh giá về phân đoạn cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs .......72 4.5. Ảnh hưởng của các cao chiết phân đoạn lên sự sản xuất IL – 2 của PBMCs ....73 4.6. Đánh giá tác động gây độc của cao chiết phân đoạn lên tế bào PBMCs bằng phương pháp nhuộm Annexin V và PI......................................................................74 4.7. Đánh giá sự thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ và TCD3+/CD8+ trong các tế bào lympho T dưới tác động của cao chiết phân đoạn ức chế mạnh nhất sự tăng sinh tế bào PBMCs ...............................................................................................................75 x DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ tắt Từ nguyên ADN Acid deoxyribonucleic CL Chloroform DĐVN V Ý nghĩa tiếng Việt Cloroform Dược điển Việt Nam V DPPH 1,1 – diphenyl – 2 –picrylhydrazyl EA Ethyl acetate Ethyl acetat EC50 Effective concentration of 50% Nồng độ hiệu quả 50% IC50 Inhibition concentration of 50% Nồng độ ức chế 50% IFN - γ Interferon gamma IL – 2 Interleukin – 2 IL – 12 Interleukin -12 LSC Liquid scintillation counting Máy đếm phóng xạ MHC Major Histocompatibility Complex Phức hợp phù hợp mô chính Môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh MTNCHC MTT dye 3 – [4,5 – dimethylthiazol – 2 –yl] – 2, 5 – diphenyl tetrazolium bromide NK cells Natural Killer cells Các tế bào giết tự nhiên OD Optical density Mật độ quang PBMCs Peripheral blood mononuclear cells Tế bào đơn nhân máu ngoại biên xi PGE2 Prostaglandin E2 PI Propidium iodide PHA Phytohemagglutinin ROS Reactive Oxygen Species Các gốc oxy phản ứng RPMI – 1640 Roswell Park Memorial Institute medium 1640 Môi trường RPMI - 1640 Te Effector T cell Tế bào T hiệu ứng TP Toàn phần xii DANH MỤC HÌNH Hình 1-1. Máu ngoại vi sau khi chiết với môi trường tách tỷ trọng ...........................4 Hình 2-1. Nguyên tắc của thử nghiệm DPPH ...........................................................31 Hình 3-1. Độc tính của DMSO trên PBMCs. ...........................................................39 Hình 3-2. Ảnh hưởng của cao cam thảo bắc toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs ....40 Hình 3-3. Ảnh hưởng của cao muồng trâu toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs .......41 Hình 3-4. Ảnh hưởng của cao sài đất toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs ...............42 Hình 3-5. Ảnh hưởng của cao hoàng kỳ toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs ...........42 Hình 3-6. Ảnh hưởng của cao trầu không toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs ........43 Hình 3-7. Ảnh hưởng của cao tô mộc toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs ..............44 Hình 3-8. Ảnh hưởng của cao trà xanh toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs ............44 Hình 3-9. Ảnh hưởng của cao kim ngân hoa toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs....45 Hình 3-10. Ảnh hưởng của cao ngũ gia bì chân chim toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs ......................................................................................................................46 Hình 3-11. Ảnh hưởng của cao vàng đắng toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs .......46 Hình 3-12. Ảnh hưởng của cao đương quy toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs ......47 Hình 3-13. Ảnh hưởng của cao ngưu tất nam toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs ..48 Hình 3-14. Ảnh hưởng của cao thảo quyết minh toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs ...................................................................................................................................48 Hình 3-15. Ảnh hưởng của các phân đoạn cao hoàng kỳ lên sự tăng sinh PBMCs .52 Hình 3-16. Ảnh hưởng của các phân đoạn cao cam thảo bắc lên sự tăng sinh PBMCs ......................................................................................................................53 Hình 3-17. Ảnh hưởng của các phân đoạn sài đất lên sự tăng sinh PBMCs ............54 Hình 3-18. Ảnh hưởng của các phân đoạn tô mộc lên sự tăng sinh PBMCs ............55 xiii Hình 3-19. Ảnh hưởng của các phân đoạn ngũ gia bì chân chim lên sự tăng sinh PBMCs ......................................................................................................................56 Hình 3-20. Ảnh hưởng của các phân đoạn muồng trâu lên sự tăng sinh PBMCs ....57 Hình 3-21. Ảnh hưởng của các phân đoạn kim ngân hoa lên sự tăng sinh PBMCs .58 Hình 3-22. Ảnh hưởng của các phân đoạn trầu không lên sự tăng sinh PBMCs .....59 Hình 3-23. Tế bào PBMCs cụm lại trong mẫu có PHA (A) và không có PHA (B) .65 Hình 3-24. Tỷ lệ tế bào apoptosis ở nhóm chứng (A) và ở nhóm thử với cao sài đất phân đoạn cloroform ở nồng độ IC50 16,12 ppm (B) ................................................66 xiv DANH MỤC BẢNG Bảng 1-1. Một số dược liệu có hoạt tính ức chế miễn dịch ......................................11 Bảng 1-2. Một số dược liệu có hoạt tính tăng sinh miễn dịch ..................................12 Bảng 1-3. Một số dược liệu có hoạt tính chống oxy hóa ..........................................14 Bảng 1-4. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của các dược liệu trong nghiên cứu .............................................................................................................................16 Bảng 2-1. Đặc điểm người tình nguyện cho máu .....................................................21 Bảng 2-2. Danh mục các dược liệu được sử dụng trong nghiên cứu ........................22 Bảng 2-3. Danh sách dược liệu khảo sát được cung cấp bởi khoa Dược, Đại học Lạc Hồng ..........................................................................................................................25 Bảng 2-4. Danh sách dược liệu thu hái tại tỉnh Đồng Nai tháng 09/2017 ................26 Bảng 3-1. Kết quả thử độ ẩm của các mẫu bột dược liệu .........................................36 Bảng 3-2. Kết quả thử độ tro toàn phần của các mẫu bột dược liệu .........................37 Bảng 3-3. Hiệu suất chiết cao cồn toàn phần ............................................................38 Bảng 3-4. Độc tính của DMSO trên PBMCs ............................................................39 Bảng 3-5. Phân nhóm tác động cao cồn toàn phần các dược liệu lên sự tăng sinh in vitro PBMCs theo kết quả thử nghiệm MTT ............................................................49 Bảng 3-6. Kết quả hóa sơ bộ thành phần hóa thực vật của các cây dược liệu ..........50 Bảng 3-7. Bảng tổng kết các giá trị IC50 hoặc EC50 của các cao phân đoạn trên sự tăng sinh in vitro PBMCs ..........................................................................................60 Bảng 3-8. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của các phân đoạn dược liệu kích thích ............................................................................................................61 Bảng 3-9. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của các phân đoạn cao dược liệu ức chế PBMCs...........................................................................................62 xv Bảng 3-10. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của các phân đoạn cao dược liệu ức chế PBMCs...........................................................................................63 Bảng 3-11. Khả năng chống oxy hóa của các cao toàn phần và phân đoạn bằng thử nghiệm DPPH............................................................................................................64 Bảng 3-12. Ảnh hưởng của các cao chiết phân đoạn lên sự sản xuất IL – 2 của PBMCs ......................................................................................................................66 Bảng 3-13. Sự thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ và TCD3+/CD8+ của mẫu thử với cao sài đất cloroform và mẫu chứng ................................................................................68 1 MỞ ĐẦU Các bệnh lý liên quan đến rối loạn hệ miễn dịch ngày càng phổ biến. Nguyên nhân có thể do tình trạng suy giảm miễn dịch hoặc do đáp ứng miễn dịch quá mức cần thiết. Trong trường hợp sức đề kháng của cơ thể giảm, cơ thể dễ bị tấn công bởi các tác nhân gây bệnh bên ngoài như virus, vi khuẩn, nấm,… và dễ mắc các bệnh lý nhiễm trùng, viêm nhiễm, ung thư… Mặt khác, nếu đáp ứng miễn dịch trở nên quá mạnh, trong một số trường hợp chống lại chính cơ thể, gây ra các bệnh lý tự miễn (autoimmune diseases) như viêm khớp dạng thấp, thấp khớp, lupus, vảy nến, hen suyễn…[83]. Hiện nay, việc điều trị các bệnh lý suy giảm miễn dịch và bệnh tự miễn chủ yếu sử dụng các thuốc Tây Y. Tuy nhiên, việc sử dụng kéo dài các thuốc này cũng đem đến những bất lợi đáng kể cho bệnh nhân do những tác dụng phụ của thuốc, hơn nữa có thể làm tăng chi phí điều trị dài hạn. Trong dân gian, rất nhiều bài thuốc y học cổ truyền được người dân sử dụng từ hàng ngàn năm qua trong điều trị các bệnh lý liên quan đến bất thường hệ miễn dịch. Việc sử dụng các dược liệu trong y học cổ truyền mang lại những lợi ích nhất định cho bệnh nhân như giảm các tác dụng phụ khi sử dụng thuốc một cách đáng kể khi so sánh với dùng thuốc Tân dược. Điều này mở ra một hướng nghiên cứu mới đầy tiềm năng cho Dược học hiện đại bởi sự đa dạng và có sẵn của nguồn nguyên liệu dược liệu. Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm tìm hiểu, đánh giá tính hiệu quả của các dược liệu trong điều trị các bệnh liên quan đến hệ thống miễn dịch. Các nghiên cứu này có quy mô từ in vitro cho đến in vivo, được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả của các dược liệu có nguồn gốc tự nhiên trong sự tăng sinh, hoạt hóa các tế bào miễn dịch cho đến ức chế, giảm hoạt tính của chúng [4],[16],[28],[38],[41],[78]. Một trong những mô hình được sử dụng rộng rãi là mô hình in vitro nuôi cấy tế bào miễn dịch đơn nhân phân lập từ máu ngoại vi người (PBMCs) để thử hoạt tính làm tăng sinh hoặc ức chế miễn dịch của dược liệu. 2 Với mong muốn tìm kiếm ra dược liệu có khả năng kích thích hoặc ức chế sự tăng sinh tế bào lympho miễn dịch để ứng dụng trong điều trị, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát tác động trên sự tăng sinh in vitro của tế bào đơn nhân máu ngoại vi người (PBMCs) và hoạt tính chống oxy hóa của một số dược liệu” với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Khảo sát tác động của các cao chiết toàn phần dược liệu trên sự tăng sinh in vitro tế bào đơn nhân được phân lập từ máu ngoại vi người (PBMCs) bằng phương pháp MTT 2. Khảo sát tác động của các cao chiết phân đoạn dược liệu trên sự tăng sinh in vitro PBMCs bằng phương pháp MTT 3. Đánh giá tác động của các cao chiết phân đoạn trên sự sản xuất IL–2 của PBMCs. 4. Đánh giá tác động chống oxy hóa của các cao chiết phân đoạn dược liệu bằng phương pháp DPPH 5. Đánh giá tác động gây độc của cao chiết phân đoạn ức chế mạnh nhất sự tăng sinh tế bào PBMCs bằng phương pháp dùng Annexin V/PI 6. Đánh giá sự thay đổi tỷ lệ T CD3+/CD4+ và T CD3+/CD8+ trong các tế bào lympho T dưới tác động của cao chiết phân đoạn ức chế mạnh nhất sự tăng sinh tế bào PBMCs 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về mô hình PBMCs in vitro 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm tế bào PBMCs Các tế bào đơn nhân máu ngoại biên người (human peripheral blood mononuclear cells – PBMCs) là tế bào máu có một nhân tròn (ví dụ lymphocytes, monocytes, natural killer cells (NK cells) hoặc dendritic cells). Phần tế bào tương ứng với hồng cầu và tế bào đa nhân (neutrophiles, basophils, và eosinophils) được loại bỏ khỏi máu toàn phần nhờ ly tâm chênh lệch tỷ trọng. Dung dịch Ficoll với tỷ trọng 1,077 g/mL tách máu toàn phần thành 2 phần; PBMCs chiếm phần tế bào nằm ở phân đoạn tỳ trọng thấp hơn 1,077 (lớp trên), trong khi hồng cầu và tế bào đa nhân có tỷ trọng cao hơn và được tìm thấy ở lớp dưới. PBMCs là một hỗn hợp các tế bào bao gồm tế bào lympho (lympho T, lympho B và tế bào NK), monocyte và tế bào dendritic. Tần suất các tế bào này biến động giữa cá nhân nhưng thông thường tế bào lympho (lymphocyte) sẽ trong khoảng 70 – 90%, monocyte từ 10 – 20%, tế bào dendritic khá hiếm chiếm khoảng 1 – 2%. Tần suất các loại tế bào trong dân số lymphocyte bao gồm 70 – 85% T CD3+, 5 – 10% lympho B CD19+, khoảng 5 – 20% tế bào NK CD3-CD16+CD56+ . T CD3+ bao gồm T CD3+CD4+ (25 – 60% PBMCs) và T CD3+CD8+ (5 – 30% PBMCs) với tỷ lệ khoàng 2:1. T CD4+ hay còn gọi là tế bào T giúp đỡ có thể được chia ra thành các subtype chức năng dựa trên biểu hiện cytokines, marker bề mặt hoặc yếu tố phiên mã. Sau khi được hoạt hóa, T CD4+ có thể biệt hóa thành các tế bào hiệu ứng thuộc tiểu quần thể tế bào T (subset effector cell) bao gồm Th1, Th2, Th17, Th9, Th22, tế bào nang và các loại Treg khác nhau. T CD4+ đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch và viêm. Nhiều yếu tố sinh lý như tình trạng dinh dưỡng, nồng độ hormon và tình trạng nhiễm trùng hay viêm sẽ ảnh hưởng đến mức độ hoạt động của các tế bào miễn dịch. Vì thế, các thành phần của PBMCs sẽ phụ thuộc vào người cho và tình trạng sinh lý của người cho. So với việc dùng các dòng tế bào, điều này có thể dẫn tới dao 4 động giữa các thí nghiệm khi người cho máu khác nhau. Tuy có sự chênh lệch dữ liệu thu được khi các người tình nguyện cho máu khác nhau, kết quả thu được sẽ phản ánh tính khái quát và đại diện trong dân số nói chung [55]. 1.1.1. Cách phân lập PBMCs PBMCs được phân lập từ máu toàn phần hoặc máu đã tách huyết tương được bổ sung chất chống đông như heparin, EDTA, citrat, ADC – A hoặc citrat phosphat dextrose (CPB). Máu được pha loãng với PBS pH ~ 7,2 theo tỷ tệ 1:1 hoặc 1:2. Độ tinh khiết của PBMCs càng cao khi máu được pha loãng càng nhiều. Cho 10 mL dung dịch tỷ trọng d = 1,077 g/mL vào đáy ống nghiệm, ly tâm ở 400×g ở 20 oC trong 25 phút. Sau ly tâm, PBMCs sẽ là lớp nằm ở bề mặt phân cách giữa dung dịch tỷ trọng và huyết tương. Thu PBMCs và rửa với PBS 2 lần để loại bỏ dung dịch tỷ trọng và tiểu cầu. Tế bào thu được có thể dùng cho phân tích ngay hoặc bảo quản và trữ trong nitơ lỏng [55]. Hình 1-1. Máu ngoại vi sau khi chiết với môi trường tách tỷ trọng 1.1.2. Ứng dụng của PBMCs trong nghiên cứu khoa học 1.1.2.1. Mô hình in vitro sàng lọc thuốc mới trên hệ miễn dịch PBMCs được dùng để sàng lọc, nghiên cứu các thuốc, hợp chất tiềm năng với khả năng điều hòa miễn dịch có ứng dụng trong điều trị các bệnh lý miễn dịch theo hướng là ức chế miễn dịch, kích thích miễn dịch hoặc kháng viêm. Các hướng nghiên cứu này thường đo lường sự thay đổi về mức độ tăng sinh in vitro của tế bào PBMCs, sự thay đổi trong sản xuất các cytokin, thay đổi trong biểu hiện gen, thay 5 đổi hình thái học tế bào, các dấu ấn bề mặt, các tế bào nhóm dưới trong quần thể PBMCs [70]. 1.1.2.2. Đánh giá độc tính của thuốc mới Đây có thể coi là ứng dụng quan trọng nhất của PBMCs trong nghiên cứu, giúp đánh giá độc tính của các hợp chất thuốc mới tiềm năng trên hệ miễn dịch. Độc tính của thuốc trên PBMCs có thể gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng, thậm chí đe dọa tính mạng của bệnh nhân, bao gồm ức chế và độc trên hệ miễn dịch. PBMCs là công cụ quan trọng trong các nghiên cứu tiền lâm sàng giúp xác định giới hạn liều của các thuốc mới [70]. Nhiều nghiên cứu trên các thuốc hoặc chất điều trị ung thư thường sử dụng PBMCs như tế bào thường để đánh giá độc tính chọn lọc của thuốc hoặc hợp chất trên tế bào ung thư và ít hoặc không gây độc tính trên tế bào thường. Thông số để đánh giá là chỉ số chọn lọc (Selectivity Index – SI) được biểu diễn bằng tỷ số của IC50 của tế bào thường và IC50 của tế bào ung thư. Chỉ số SI càng lớn, chất hoặc thuốc càng chọn lọc trên tế bào ung thư [19]. 1.1.2.3. Nghiên cứu so sánh song song Các nhà nghiên cứu cần tế bào PBMCs bình thường và tế bào PBMCs có bệnh lý để so sánh trong nghiên cứu song song nhằm tìm hiểu cơ chế ở mức độ phân tử của một đáp ứng có hại cụ thể, từ đó giúp quá trình nghiên cứu thuốc mới tiến triển nhanh hơn với hiệu quả cao hơn và độc tính trên hệ miễn dịch thấp [70]. 1.1.2.4. Liệu pháp tái sinh Các tế bào tiền thân đa năng (multipotent progenitor cells) được xác định là một thành phần của PBMCs, các tế bào này có thể biệt hóa thành tế bào khác mặc dù khả năng kém hơn tế bào gốc [86]. Bên cạnh đó, PBMCs có thể có hiệu ứng tái sinh thông qua tương tác với các dân số tế bào khác và có thể được tái lập trình thành tế bào vạn năng với khả năng biệt hóa thành bất kỳ loại tế bào nào [32]. 1.1.2.5. Liệu pháp miễn dịch ung thư Năm 2018, hiệp hội ung thư lâm sàng Hoa Kỳ đã trao giải cho một liệu pháp mới điều trị ung thư dựa trên PBMCs. Đối với liệu pháp này, còn gọi là liệu pháp CAR T-cell (Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell), tế bào T được phân lập từ bệnh