Tài liệu Khảo sát quy trình đánh giá tác động ức chế enzym hmg coa reductase trên dịch đồng thể in vitro, in vivo và trên dòng tế bào hepg2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --------------------------------- BỘ Y TẾ Trần Thị Thiên Thanh KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ ENZYM HMG-COA REDUCTASE TRÊN DỊCH ĐỒNG THỂ IN VITRO, IN VIVO VÀ TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2 Luận văn Thạc sĩ Dược học Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ------------------------------ BỘ Y TẾ Trần Thị Thiên Thanh KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ ENZYM HMG-COA REDUCTASE TRÊN DỊCH ĐỒNG THỂ IN VITRO, IN VIVO VÀ TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2 Ngành: Dược lý – Dược lâm sàng Mã số: 8720205 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. TRẦN MẠNH HÙNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 . LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào. Tác giả TRẦN THỊ THIÊN THANH . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học Luận văn Thạc sĩ Dược học – Khoá: 2016-2018 Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng – Mã số: 8720205 KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ ENZYM HMGCOA REDUCTASE TRÊN DỊCH ĐỒNG THỂ IN VITRO, IN VIVO VÀ TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2 Học viên: Trần Thị Thiên Thanh Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trần Mạnh Hùng Mục tiêu: Khảo sát và thiết lập mô hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase in vitro, in vivo và trên dòng tế bào HepG2 Vật liệu và phương pháp: Ở mô hình in vitro, khảo sát hoạt tính HMG-CoA reductase theo nồng độ NADPH, số lượng gan chuột nhắt và so sánh hoạt tính enzym dịch đồng thể với bộ KIT Sigma thông qua tác động ức chế enzym của atorvastatin. Ở mô hình in vivo, chuột được gây tăng lipid huyết và tăng hoạt tính HMG-CoA reductase bằng triton WR-1339 (tyloxapol) liều 250 mg/kg. Định lượng lipid huyết và hoạt tính HMG-CoA reductase sau 24 giờ tiêm tyloxapol. Tế bào HepG2 được ủ với acid oleic (50 µM tới 2 mM) trong 24 giờ, xác định tỷ lệ sống, nồng độ lipid và hoạt tính HMG-CoA reductase. Kết quả và bàn luận: Trong quy trình định lượng HMG-CoA reductase, nồng độ NADPH tối ưu là 20 µM, dịch đồng thể từ 3 gan trở lên để đảm bảo hoạt tính enzym. IC50 của atorvastatin đối với enzym dịch đồng thể và bộ KIT lần lượt là 11,68 và 14,51 ng/ml. Tiêm tyloxapol liều 250 mg/kg trong 24 giờ làm tăng nồng độ lipid huyết và tăng 1,5 lần hoạt tính HMG-CoA reductase. Tế bào HepG2 ủ với acid oleic 1 mM có tỷ lệ sống giảm 30% và nồng độ cholesterol tăng 3,4 lần với nhóm chứng. Atorvastatin được sử dụng là thuốc đối chứng trong mô hình in vivo và trên dòng tế bào HepG2. Kết quả: Mô hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase in vitro, in vivo và trên dòng tế bào HepG2 phù hợp để nghiên cứu, khảo sát các dược chất có tiềm năng điều trị RLLH. iii . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học Final Essay for the Master of Pharmacy Degree– Course: 2016-2018 Specialization: Pharmacology – Clinical Pharmacy – Code: 8720205 INVESTIGATION OF HMG-COA REDUCTASE INHIBITORY ACTIVITY ASSAY IN VITRO, IN VIVO AND IN HEPG2 CELLS LINE Student: Tran Thi Thien Thanh Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Tran Manh Hung Purpose: The thesis is aimed at investigating and establishing a model of HMG-CoA reductase inhibitory activity in vitro, in vivo and in HepG2 cell line. Materials and Methods: In in vitro model, HMG-CoA reductase activity was examined with respect to various concentrations of NADPH and number of mice’s livers using Sigma KIT, which relies on the inhibitory activity of atorvastatin. In in vivo setting, hyperlipidemia was induced by single intravenous injection of triton WR-1339 (tyloxapol) at the dose of 250 mg/kg. After 24 hours of tyloxapol injection, lipid concentrations and HMG-CoA reductase activity were identified. HepG2 cells were exposed to oleic acid (from 50 µM to 2 mM) in 24 hours, cell viability together with lipid concentration and HMG-CoA reductase activity were examined. Results: In the quantification procedure of HMG-CoA reductase, the optimal NADPH concentration was 20 µM and the homogeneous enzyme was made from at least 3 mice’s livers. IC50 values of atorvastatin against enzyme from homogeneous enzyme and Sigma KIT were 11,68 and 14,51 ng/ml, respectively. Intravenous injection of 250 mg/kg tyloxapol within 24 hours increased lipid concentration and led to a 1.5-fold rise of HMG-CoA reductase activity. HepG2 after exposure to 1 mM oleic acid in 24 hours exhibited 30% decrease in cell viability, but its cholesterol level elevated 3,4-fold higher than the control group. These effects were compared to those of the positive control atorvastatin. Conclusion: The model of HMG-CoA reductase inhibitory activity in vitro, in vivo and in HepG2 Cells were suitable for studies of inhibitory effects of potential bioactive compounds against HMG-CoA reductase. iv . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học MỤC LỤC CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 1.1. RỐI LOẠN LIPID HUYẾT .............................................................................3 1.1.1. Chu trình tổng hợp cholesterol..................................................................3 1.1.2. Lipoprotein và sự vận chuyển lipid ..........................................................4 1.1.3. Nguyên nhân gây RLLH ...........................................................................5 1.2. HMG-CoA REDUCTASE ...............................................................................9 1.2.1. Cấu trúc .....................................................................................................9 1.2.2. Vai trò của HMG-CoA reductase ...........................................................11 1.3. TỔNG QUAN VỀ DÒNG TẾ BÀO HEPG2 ................................................11 1.4. GIỚI THIỆU VỀ BỘ KIT HMG-COA REDUCTASE..................................13 1.4.1. Thành phần bộ KIT .................................................................................13 1.4.2. Nguyên tắc hoạt động .............................................................................13 1.4.3. Tính toán kết quả. ...................................................................................14 1.5. MÔ HÌNH TĂNG LIPID HUYẾT BẰNG TYLOXAPOL ...........................14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................16 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .......................................................................16 2.1.1. Động vật thử nghiệm ..............................................................................16 2.1.2. Dòng tế bào thử nghiệm ..........................................................................16 2.1.3. Hóa chất và thuốc thử nghiệm ................................................................16 2.1.4. Trang thiết bị nghiên cứu ........................................................................17 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................18 2.2.1. Quy trình thu hỗn dịch enzym từ gan chuột nhắt....................................18 2.2.2. Phương pháp định lượng hoạt tính HMG-CoA reductase ......................20 v . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học 2.2.3. Khảo sát định lượng hoạt tính HMG-CoA reductase trong dịch đồng thể ...........................................................................................................................23 2.2.4. So sánh tác động ức chế HMG-CoA reductase của atorvastatin giữa enzym dịch đồng thể và bộ KIT Sigma. .......................................................................24 2.2.5. Xây dựng mô hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase và tăng lipid cấp tính in vivo ..................................................................................................28 2.2.6. Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase và tác động tăng tổng hợp cholesterol trên dòng tế bào HepG2 ..........................................30 2.3. PHÂN TÍCH SỐ LIỆU THỐNG KÊ .............................................................32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..............................................................33 3.1. KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE IN VITRO......................................................................................33 3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ NADPH lên hoạt tính HMG-CoA reductase ...33 3.1.2. Ảnh hưởng của số lượng gan chuột lên hoạt tính HMG-CoA reductase 34 3.2. SO SÁNH TÁC ĐỘNG CỦA HMG-COA REDUCTASE TRONG DỊCH ĐỒNG THỂ VÀ TRONG BỘ KIT THƯƠNG MẠI............................................35 3.2.1. Khảo sát tác động ức chế của atorvastatin với HMG-CoA reductase trong dịch đồng thể .....................................................................................................35 3.2.2. Khảo sát tác động ức chế HMG-CoA reductase trong bộ KIT enzym của atorvastatin ........................................................................................................37 3.3. MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE IN VIVO 39 3.3.1. Khảo sát tác động của tyloxapol trên lipid huyết ....................................39 3.3.2 Mô hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase và tác dụng tăng lipid huyết cấp tính in vivo của tyloxapol .................................................................40 3.4. MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE VÀ TĂNG TỔNG HỢP CHOLESTEROL TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2 ........................42 vi . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học 3.4.1. Ảnh hưởng acid béo lên tỷ lệ sống của tế bào HepG2 ............................42 3.4.2. Ảnh hưởng của acid béo lên nồng độ cholesterol, triglycerid trên dòng tế bào HepG2 ........................................................................................................43 3.4.3. Ảnh hưởng của acid béo lên hoạt tính HMG-CoA reductase .................44 3.4.4. Mô hình tăng tổng hợp cholesterol trên dòng tế bào HepG2 bằng acid béo ...........................................................................................................................44 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................46 4.1. KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE IN VITRO......................................................................................46 4.2. SO SÁNH HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE CỦA DỊCH ĐỒNG THỂ VỚI BỘ KIT THƯƠNG MẠI ..............................................................................47 4.3. QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE IN VIVO ...............................................................................................................................47 4.4. MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE VÀ TĂNG TỔNG HỢP CHOLESTEROL TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2. .......................49 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................51 5.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................51 5.2. ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................52 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….53 PHỤ LỤC…………………………………………………………………………..61 vii . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Giới hạn các thành phần lipid trong máu ...................................................3 Bảng 1.2. Khuyến cáo điều trị tăng cholesterol máu bằng thuốc ...............................7 Bảng 1.3. Cấu trúc của các loại HMG-CoA reductase .............................................10 Bảng 1.4. Thành phần bộ KIT HMG-CoA reductase ...............................................13 Bảng 2.1. Danh mục hoá chất và thuốc thử sử dụng trong đề tài .............................16 Bảng 2.2. Thành phần định lượng protein toàn phần bằng bộ KIT Biuret ...............20 Bảng 2.3. Thành phần thể tích phản ứng trong một mẫu cuvet 1ml .........................21 Bảng 2.4. Thể tích phản ứng định lượng hoạt tính HMG-CoA reductase của bộ KIT Sigma ........................................................................................................................22 Bảng 2.5. Hỗn hợp phản ứng khảo sát sự ảnh hưởng của NADPH lên hoạt tính HMGCoA reductase ...........................................................................................................23 Bảng 2.6. Hỗn hợp phản ứng khảo sát sự ảnh hưởng của số lượng gan lên hoạt tính HMG-CoA reductase ................................................................................................24 Bảng 2.7. Hỗn hợp phản ứng đánh giá tác động ức chế của atorvastatin với HMGCoA reductase trong dịch đồng thể ...........................................................................26 Bảng 2.8. Hỗn hợp phản ứng đánh giá tác động ức chế của atorvastatin với HMGCoA reductase trong bộ KIT Sigma..........................................................................27 Bảng 3.1. Sự thay đổi độ hấp thu ở các nồng độ NADPH khác nhau ......................33 Bảng 3.2. Sự thay đổi độ hấp thu ở các mẫu có số lượng gan khác nhau .................34 Bảng 3.3. Tác động ức chế của atorvastatin với HMG-CoA reductase trong dịch đồng thể..............................................................................................................................35 Bảng 3.4. Tác động ức chế của atorvastatin với HMG-CoA reductase trong bộ KIT Sigma ........................................................................................................................37 Bảng 3.5. Nồng độ cholesterol và triglycerid theo thời gian ....................................39 Bảng 3.6. Các chỉ số lipid huyết của các lô ..............................................................40 Bảng 3.7. Sự thay đổi độ hấp thu giữa các lô ...........................................................41 viii . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học Bảng 3.8. Mật độ quang đo được ở các mẫu có nồng độ acid béo khác nhau ..........42 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của acid béo lên nồng độ lipid trong dòng tế bào HepG2 .....43 Bảng 3.10. Hoạt tính HMG-CoA reductase ở các nồng độ acid béo khác nhau.......44 Bảng 3.11. Nồng độ lipid giữa các lô .......................................................................44 Bảng 3.12. Hoạt tính HMG-CoA reductase giữa các lô ...........................................45 ix . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NADPH lên hoạt tính HMG-CoA reductase 33 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của số lượng gan chuột lên hoạt tính HMG-CoA reductase ...................................................................................................................................34 Biểu đồ 3.3. Tác dụng ức chế HMG-CoA reductase dịch đồng thể của atorvastatin ...................................................................................................................................36 Biểu đồ 3.4. Đường tuyến tính phụ thuộc của hoạt độ HMG-CoA reductase in vitro vào nồng độ atorvastatin ...........................................................................................36 Biểu đồ 3.5. Tác dụng ức chế HMG-CoA reductase trong bộ KIT của atorvastatin 38 Biểu đồ 3.6. Đường tuyến tính phụ thuộc của hoạt độ HMG-CoA reductase trong bộ KIT vào nồng độ atorvastatin ...................................................................................38 Biểu đồ 3.7. Nồng độ cholesterol, triglycerid, HDL-C và LDL-C giữa các lô........40 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng tyloxapol lên hoạt tính HMG-CoA reductase ...................41 Biểu đồ 3.9. Tỷ lệ sống giữa các lô có nồng độ acid béo khác nhau ........................42 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm…………………………………………………..18 Sơ đồ 2.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase in vivo……..28 Sơ đồ 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase trên dòng tế bào HepG2……………………………………………………………………………...30 x . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ATP Adenosine triphosphate BSA Bovine serum albumin DMEM Dulbecco’s modified eagle medium DMSO Dimethyl sulfoxide DTT Dithiothreitol HDL High-density lipoprotein HDL-C HDL-Cholesterol HMG-CoA β-hydroxy β-methylglutanyl coenzyme A IC50 Inhibitor concentration 50% Nồng độ ức chế 50% LDL Low-density lipoprotein Lipoprotein tỉ trọng thấp LDL-C LDL-Cholesterol NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PCSK9 Proprotein convertase subtilsinkexin type 9 RLLH Lipoprotein tỉ trọng cao Rối loạn lipid huyết SEM Standard error of mean TG Triglyceride IV Intravenous Tiêm tĩnh mạch VLDL Very-low-density lipoprotein Lipoprotein tỉ trọng rất thấp xi . Sai số chuẩn của trung bình Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, bệnh xơ vữa động mạch (XVĐM) và động mạch vành (ĐMV) là nguyên nhân chính gây tử vong ở các nước phát triển và tỷ lệ tử vong này ngày một gia tăng [1]. Theo số liệu của Tổ chức Y tế thế giới, năm 2010, Việt Nam có 100.000 người tử vong do bệnh ĐMV (khoảng 300 người tử vong do bệnh này mỗi ngày) và dự báo đến năm 2020, các bệnh tim mạch, đặc biệt là XVĐM sẽ trở thành nguyên nhân hàng đầu về gánh nặng bệnh tật trên toàn thế giới [1], [5], [35], [49]. Rối loạn lipid huyết (RLLH) chính là yếu tố nguy cơ quan trọng hàng đầu dẫn đến việc hình thành, phát triển bệnh lý xơ vữa động mạch, gây các biến chứng nặng nề như nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não. Bên cạnh việc thay đổi lối sống, chế độ ăn uống thì điều trị bệnh bằng thuốc là liệu pháp hàng đầu đem lại hiệu quả điều trị. Có nhiều nhóm thuốc được sử dụng để điều trị RLLH như niacin, ezetimib, nhóm fibrat, nhựa gắn acid mật, nhưng với hiệu quả cao với các chứng cứ lâm sàng vững chắc thì nhóm thuốc ức chế b-hydroxyl-b-methylglutaryl Coenzym A reductase (HMG - CoA reductase) (statin) được sử dụng phổ biến nhất. Với vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp cholesterol, HMG-CoA reductase trở thành đối tượng nghiên cứu chính trong việc nghiên cứu tìm ra thuốc mới trong điều trị RLLH. Hiện tại có nhiều đề tài trên thế giới như nghiên cứu của Hirangi và cộng sự (2011) [40], nghiên cứu của Chung và cộng sự (2007) [61] đã nghiên cứu các mô hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase in vitro; nghiên cứu của Vanitha Reddy Palvai và cộng sự (2014) [77], nghiên cứu Irudayaraj và cộng sự (2013) [43] đã đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase in vivo. Ngoài ra, những nghiên cứu về HMG-CoA reductase trên dòng tế bào HepG2 cũng được công bố ở nghiên cứu của Myung-A Jung và cộng sự (2015) [62], nghiên cứu Nan Wu và cộng sự (2013) [64], nghiên cứu của Funatsu và cộng sự (2001) [75]. Ngoài ra, ở nước ta, các đề tài bước đầu nghiên cứu và đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase đã được công bố ở các nghiên cứu của dược sĩ Nguyễn Dương Ngọc Thới (2017) [8] và dược sĩ Trương Đình Phước (2016) [7]. 1 . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học Với mục đích tiếp tục hoàn thiện những mô hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase in vitro, in vivo để sau đó sử dụng mô hình trong nghiên cứu sàng lọc các dược chất có tiềm năng điều trị RLLH, đề tài “KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ ENZYM HMG-CoA REDUCTASE TRÊN DỊCH ĐỒNG THỂ IN VITRO, IN VIVO VÀ TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2” được thực hiện với các mục tiêu như sau: • Khảo sát quy trình đánh giá tác động ức chế HMG-CoA reductase trên dịch đồng thể in vitro • So sánh hoạt tính HMG-CoA reductase của dịch đồng thể với bộ KIT Sigma • Xây dựng mô hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase in vivo và tăng lipid huyết cấp tính trên chuột nhắt bằng tyloxapol • Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase và tăng tổng hợp cholesterol trên dòng tế bào HepG2 bằng acid béo 2 . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. RỐI LOẠN LIPID HUYẾT RLLH là tình trạng tăng bất thường cholesterol và/hoặc triglycerid trong máu, và/hoặc kèm theo sự giảm nồng độ lipoprotein tỷ trọng cao (HDL-C) tăng nồng độ lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C), làm gia tăng quá trình vữa xơ động mạch [2], [4], [5], [6], [73], [74]. Bảng 1.1. Giới hạn các thành phần lipid trong máu [14] Thành phần Lipid Lý tưởng Giới hạn cao Nguy cơ cao Cholesterol < 5,2 mmol/L (200 mg/dL) 5,2-6,2 mmol/L (200-239 mg/dL) < 6,2 mmol/L (240 mg/dL) Triglycerid < 2,3 mmol/L (200 mg/dL) 2,3-4,5 mmol/L (200-400 mg/dL) 4,5-11,3 mmol/L (400-1000 mg/dL) LDL-C < 3,4 mmol/L (130 mg/dL) 3,4-4,1 mmol/L (130-159 mg/dL) >160 mg/dL HDL-C > 1,5 mmol/L (60 mg/dL) < 0,9 mmol/L (35 mg/dL) 1.1.1. Chu trình tổng hợp cholesterol Cholesterol được tổng hợp chủ yếu ở gan, ruột. Ngoài ra, cholesterol còn được tổng hợp ở thượng thận, tinh hoàn, buồng trứng, da, hệ thần kinh. Giống như acid béo, cholesterol được tổng hợp từ acetyl CoA [4], [21], [47]. Quá trình tổng hợp cholesterol có thể chia thành 4 giai đoạn: Giai đoạn 1: sự tạo thành mevalonat từ acetat Phản ứng đầu tiên là phản ứng ngưng tụ hai phân tử acetyl CoA tạo thành phân tử acetoacetyl CoA. Tiếp theo, acetoacetyl CoA ngưng tụ với một phân tử acetyl CoA nữa để tạo thành b-hydroxyl-b-methylglutaryl Coenzym A (HMG-CoA) nhờ HMGCoA synthetase làm xúc tác. 3 . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học Tiếp theo là phản ứng chuyển HMG-CoA thành mevalonat (gốc thioeste chuyển thành alcol) nhờ xúc tác của HMG-CoA reductase có coenzym là NADPH và H+. Giai đoạn này là giai đoạn được nghiên cứu sâu trong điều hòa sinh tổng hợp cholesterol. Nhiều thuốc có tác dụng ức chế tổng hợp cholesterol đều có tác dụng ở giai đoạn này. Giai đoạn 2: sự tạo thành isopren hoạt hóa (mạch 5C) Trước hết, mevalonat được phosphoryl hóa 3 lần nhờ 3 ATP sau đó khử CO2 và một phosphat để cho ra một đơn vị isopren hoạt hóa. Giai đoạn 3: sự tạo thành squalen Squalen được tạo thành từ 6 đơn vị isopren hoạt hóa ngưng tụ với nhau. Đầu tiên, isopentenyl pyrophosphat ngưng tụ với dimethylallyl pyrophosphat tạo thành farnesyl pyrophosphat (15C). Sau đó, hai phân tử farnesyl pyrophosphat ngưng tụ tạo thành squalen (30C) và giải phóng 2 pyrophosphat. Giai đoạn 4: sự tạo thành cholesterol Dưới tác dụng của squalenmonoxygenase, squalen được gắn thêm oxy dưới dạng epoxid tạo thành squalen 2,3-epoxid. Squalen 2,3-epoxid sau đó có thể biến đổi thành nhiều cách. Ở động vật, dưới tác dụng của enzym đóng vòng tạo thành lanosterol. Qua nhiều phản ứng khử gốc –CH3 lanosterol biến đổi thành cholesterol (27C). Ở thực vật, qua nhiều phản ứng có thể tạo thành stigmasterol. Ở một số nấm có thể tạo ergosterol [4], [18], [21], [47]. 1.1.2. Lipoprotein và sự vận chuyển lipid Tính chất chung của các lipid là không tan trong nước. Trong các tế bào, tổ chức và các dịch sinh vật, lipid luôn ở dạng phức hợp với protein gọi là lipoprotein (Lp). Lp tan trong nước do đó được lưu thông trong huyết tương của máu. Vì vậy, Lp là những phân tử mang nhiệm vụ vận chuyển lipid từ nơi sản xuất tới nơi sử dụng hoặc tích trữ. Bằng phương pháp điện di trên giá polyacrylamid, lipoprotein được phân tách thành 4 loại (bắt đầu từ thành phần di chuyển xa nhất tới thành phần di chuyển chậm 4 . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học nhất): alpha lipoprotein (α- Lp), beta lipoprotein (β- Lp), tiền beta-lipoprotein (pre-βLp) và các chylomicron di chuyển ít và thực tế dừng lại ở điểm xuất phát khi điện di [18]. Lipoprotein có 2 nguồn gốc nội sinh và ngoại sinh. Gan tổng hợp các Lp nội sinh từ các sản phẩm của lipid, glucid và các acid amin. Quá trình này xảy ra trên bề mặt của hệ thống lưới trong chất nguyên sinh của tế bào gan. Lp ngoại sinh được tạo ra từ ruột, có thể được chuyển hóa ở gan [4], [18], [27]. 1.1.3. Nguyên nhân gây RLLH RLLH có thể do nguyên nhân tiên phát: đột biến các gen mã hóa các apoprotein hay LDL-receptor. Đột biến này thường kèm theo LDL huyết tăng cao kèm theo các biểu hiện trên lâm sàng như u vàng, xơ vữa động mạch. RLLH thứ phát là hậu quả từ lối sống, chế độ ăn, ảnh hưởng bởi một số bệnh như đái tháo đường, suy thận, hay ảnh hưởng bởi các thuốc như thuốc lợi tiểu, β-blocker… [5], [73]. 1.1.4. Điều trị Mục tiêu điều trị Nồng độ LDL-C là mục tiêu điều trị cơ bản [11]. • Đối với bệnh nhân nguy cơ tim mạch rất cao: Mục tiêu LDL-C < 1,8 mmol/L (70mg/dL) hoặc giảm ít nhất 50% nếu LDL-C ban đầu từ 1,8 - 3,5 mmol/L (70 - 135 mg/dL) được xem xét. • Đối với bệnh nhân có nguy cơ tim mạch cao: Mục tiêu LDL-C < 2,6 mmol/L (100 mg/dL) hoặc giảm ít nhất 50% nếu LDL-C ban đầu ở giữa 2,6 và 5,2 mmol/L (100 và 200 mg/dL) được xem xét. • Đối với bệnh nhân nguy cơ trung bình hoặc thấp, LDL-C < 3,0 mmol/L (115 mg/dL) được xem xét. 5 . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học Điều trị không dùng thuốc Vai trò của lối sống và dinh dưỡng rất quan trọng trong dự phòng bệnh tim mạch. ESC (European Social of Cardiology) khuyến cáo thay đổi lối sống và lựa chọn thức ăn lành mạnh để điều trị nguy cơ tim mạch toàn thể [11]. Điều trị bằng thuốc • Nhóm thuốc ức chế HMG- CoA reductase (statin) Nhóm thuốc này là lựa chọn đầu tiên trong việc giảm nồng độ LDL-C và giảm nguy cơ bệnh mạch vành bằng cơ chế giảm tổng hợp cholesterol ở gan. Cơ chế tác động nhóm statin là ức chế hoạt tính của HMG-CoA reductase. Mức độ giảm LDL-C phụ thuộc vào liều và các statin khác nhau. Có rất nhiều nghiên cứu lâm sàng chứng minh hiệu quả giảm biến cố tim mạch cũng như tỷ lệ bệnh nhân tử vong trong dự phòng nguyên phát cũng như thứ phát. Ngoài ra statin còn cho thấy giúp làm chậm tiến trình xơ vữa động mạch [6], [11], [18], [45], [48], [74]. Một số phân tích gộp cho thấy lợi ích lâm sàng độc lập với mỗi loại statin tuỳ thuộc vào mức độ giảm LDL-C. Trong phân tích gộp CTT (The Cholesterol Treatment Trialist’s Collaboration) [21] với dữ liệu trên 170.000 bệnh nhân trên 26 trung tâm đã kết luận, cứ mỗi 1,0 mmol/L (tương đương 40 mg/dL) LDL-C giảm xuống, thì giúp giảm 10% bệnh nhân tử vong vì mọi lý do và giảm khoảng 20% bệnh nhân tử vong do biến cố tim mạch. Do đó sử dụng loại statin nên dựa vào mục tiêu LDL-C của bệnh nhân [11], [18]. 6 . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học Bảng 1.2. Khuyến cáo điều trị tăng cholesterol máu bằng thuốc [11] Khuyến cáo Mức độ khuyến cáo Mức độ chứng cứ Kê đơn statin đến liều cao nhất theo khuyến cáo hoặc liều dung nạp cao nhất đển đạt được mục tiêu. I A Trong trường hợp không dung nạp statin, ezetimib hoặc thuốc gắn acid mật hoặc phối hợp các thuốc này nên được xem xét. IIa C Nếu không đạt được mục tiêu, phối hợp statin với thuốc ức chế hấp thu cholesterol nên được xem xét. IIa B Nếu không đạt được mục tiêu, phối hợp statin với thuốc gắn acid mật có thể xem xét. IIb C Ở bệnh nhân nguy cơ rất cao với LDL-C tăng kéo dài mặc dù điều trị liều statin cao nhất dung nạp được, phối hợp với ezetimid hoặc ở bệnh nhân không dung nạp statin, thuốc ức chế PCSK9 có thể được xem xét. IIb C Statin được dung nạp tốt khi sử dụng. Tuy nhiên, đau đầu, đau cơ, rối loạn tiêu hóa là các tác dụng phụ hay gặp. Statin cũng gây gây ra tăng men gan (1-1,5%), tăng nhẹ creatinin kinase (<1% viêm đa cơ, yếu cơ). Các thuốc chuyển hóa qua gan cần theo dõi tương tác khi sử dụng với các thuốc khác. • Nhựa gắn acid mật (resin) Nhóm này rất an toàn, được chứng minh giảm nguy cơ bệnh mạch vành. Các thuốc trong nhóm này bao gồm: colestipol, cholestyramin, colesevelam. Resin không hấp thu được bởi hệ tiêu hóa, do đó không gây độc toàn thân. Nhóm này làm giảm nồng độ LDL-C phụ thuộc vào liều, với liều cao nhất 24 g cholestyramin, 20 g colestipol hoặc 4,5 g colesveram, LDL-C giảm 18-25%. Nhóm thuốc này không ảnh hưởng lên HDL-C nhưng có thể làm tăng triglycerid ở một số bệnh nhân. Trong các thử nghiệm lâm sàng, thuốc gắn acid mật góp phần chứng minh hiệu quả của giảm LDL-C trong giảm các biến cố tim mạch ở các bệnh nhân tăng cholesterol máu với lợi ích tỷ lệ thuận với mức độ giảm LDL-C [6], [11], [18], [45], [74]. Cơ chế tác động của resin gắn với acid mật ở ruột rồi thải qua phân nên tăng cường sử dụng cholesterol ở gan để tổng hợp acid mật mới bù vào chỗ mất. Từ đó làm giảm 7 . Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học nồng độ cholesterol huyết thanh. Do không hấp thu vào hệ tuần hoàn nên resin thường gây táo bón (20%), đầy hơi (15%). Ngoài ra chúng còn làm tăng triglycerid (3-10%), vì vậy cần lưu ý cho những bệnh nhân có nồng độ triglycerid cao. • Ezetimib Ezetimib can thiệp hấp thu phytosterol và cholesterol từ lòng ruột do ức chế protein vận chuyển NPC1L1 (Niemann-Pick C1-Like 1 Protein), ezetimib làm giảm 50% cholesterol dưới dạng chylomicron từ ruột non đến gan. Trong thử nghiệm lâm sàng, đơn trị ezetimib làm giảm 15-22% ở các bệnh nhân tăng cholesterol máu. Điều trị phối hợp ezetimib và statin làm giảm thêm 15-20% nồng độ LDL-C. Nghiên cứu SEAS (The Simvastatin and Ezetimibe in Aortic Stenosis) [67] đã chứng minh hiệu quả làm giảm biến cố tim mạch của ezetimib phối hợp với simvastatin trên đối tượng bệnh nhân hẹp động mạch chủ, hay nghiên cứu IMPROVE_IT (The Improved Reduction of Outcomes: Vytorin Efficacy International Triall) [22] trên đối tượng bệnh nhân sau mạch vành cấp và nghiên cứu SHARP (Study of Heart and Renal Protection) [69] trên bệnh nhân bệnh thận mạn cũng đem đến kết quả tương tự, ủng hộ việc sử dụng phối hợp statin và ezetimib để mang đến nhiều lợi ích hơn [6], [11], [18], [45], [74]. • Niacin Niacin là một vitamin nhóm B giúp cải thiện nồng độ lipid huyết. Niacin thường được sử dụng để điều trị RLLH do giá thành thấp, được sử dụng lâu và có nhiều bằng chứng lâm sàng làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch vành. Niacin dạng tinh thể làm giảm 15-25% nồng độ LDL-C huyết tương, giảm 30-60% nồng độ triglycerid huyết tương, đồng thời tăng 20-25% nồng độ HDL-C huyết tương [6], [11], [45], [74]. • Thuốc ức chế PCSK9 EMA (European Medicine Agency) và FDA (US Food and Drug Administration) đã chấp thuận hai kháng thể đơn dòng nhắm vào protein PCSK9 giúp kiểm soát LDL-C huyết tương. Hiệu quả làm giảm LDL-C từ 50-70% độc lập so với điều trị nền. Dữ 8 .