Tài liệu Khảo sát khả năng diệt côn trùng của nấm sợi phân lập từ đất vườn tỉnh bình dương

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NĂM HỌC 2015-2016 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DIỆT CÔN TRÙNG CỦA NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN TỈNH BÌNH DƯƠNG TÊN SINH VIÊN: LÊ THỊ NHÀN NGƯỜI HƯỚNG DẪN: THS. NGUYỄN ANH DŨNG Bình Dương, tháng 3 năm 2016 UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập – Tự do – Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1. Thông tin chung - Tên đề tài: khảo sát khả năng diệt côn trùng của nấm sợi phân lập từ đất vườn tỉnh Bình Dương. - Sinh viên thực hiện: Lê Thị Nhàn - Lớp: C13SH01 - Khoa: Tài nguyên Môi trường - Chuyên ngành đào tạo: Sư phạm Sinh học - Năm thứ: 3 - Số năm đào tạo: 3 - Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Anh Dũng. 2. Mục tiêu đề tài Phân lập, khảo sát và tuyển chọn được mô ̣t số chủng nấm sợi có khả năng diệt côn trùng phân lập từ đất vườn tỉnh Bình Dương 3. Tính mới và sáng tạo Sử dụng nấm diệt côn trùng góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường, đồng thời trong quá trình phân lập làm đa dạng vốn gen của nấm sợi. 4. Kết quả nghiên cứu Qua quá trình phân lập, làm thuần đã thu được 20 chủng nấm sợi. Trong đó có 8 chủng thuộc chi Aspergillus, 1 chủng thuộc chi Pyricularia, 1 chủng thuộc chi Penicillium, và 1 số chủng chưa thấy trong khóa định loại của Lương Đức Phẩm (2003). Với thí nghiệm khảo sát khả năng diệt côn trùng của 20 chủng nấm sợi, có thể thấy: - Đối với Sâu quy: các chủng L5.1, L3, CT2 có khả năng tiêu diệt sâu quy mạnh nhất. - Đối với Dế: các chủng Đ3.2, CT2, Đ6.1 có tỉ lệ tiêu diệt dế mạnh nhất. - Đối với Cào cào: các chủng Đ3.2, Đ6.1, CT2 có khả năng tiệt diệt cào cào mạnh nhất. 5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài. Tìm ra những chủng nấm sợi có khả năng diệt côn trùng , cũng như làm nguồn nguyên liệu để sản xuất chế phẩm sinh học diêt côn trùng, góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường. 6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ họ tên tác giả, nhan đề và các yếu tố về xuất bản nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có). Ngày.....tháng......năm 2016 Sinh viên chịu trách nhiệm chính thực hiện đề tài (ký, họ và tên) Lê Thị Nhàn UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập – Tự do – Hạnh phúc THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 1. SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN - Họ và tên: Lê Thị Nhàn - Ngày, tháng, năm sinh: 10/11/1995 - Nơi sinh: Bình Thuận - Lớp: C13SH01 - Chuyên ngành đào tạo: Sư phạm Sinh học - Khóa học: 2013 – 2016 - Khoa: Tài nguyên Môi trường - Địa chỉ liên hệ: phường Phú Hòa, Thành phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương. - Điện thoại: 0974366623 - Email: [email protected] 2. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP  Năm thứ nhất - Ngành học: Sư phạm Sinh học - Khoa: Khoa học Tự nhiên - Kết quả xếp loại học tập: Khá - Sơ lược thành tích: Nhận học bổng khuyến khích của khoa.  Năm thứ hai - Ngành học: Sư phạm Sinh học - Khoa: Khoa học Tự nhiên - Kết quả xếp loại học tập: Khá Ngày.....tháng......năm 2016 Xác nhận của lãnh đạo Khoa (ký, họ và tên) Ngày.....tháng......năm 2016 Sinh viên chịu trách nhiệm chính thực hiện đề tài (ký, họ và tên) Lê Thị Nhàn MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về nấm sợi…………………………………………………………3 1.1.1. Vị trí phân loại……………………………………………………………3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm sợi…………………………………………..4 1.1.3. Khả năng diệt côn trùng của nấm sợi…………………………….............5 1.2. Nghiên cứu về khả năng diệt côn trùng của nấm sợi trong và ngoài nước...6 1.2.1. Những nghiên cứu trong nước………………………………………….....6 1.2.2. Những nghiên cứu ngoài nước……………………………………..……...6 Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu………………….……………………………………………....….…..…8 2.1.1. Dụng cụ…………………………………………………………….….........8 2.1.2. Máy móc…………………………………………………………….....…....8 2.2.3. Môi trường nuôi cấy……………….……………………………….….……8 2.2 Nội dung nghiên cứu………………………………………………………..…....9 2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………….…....9 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu…………………………………………..………....9 2.3.2. Phương pháp phân lập mẫu…………………………….………………...10 2.3.3. Khảo sát khả năng diệt côn trùng của các chủng nấm sợi…………..……10 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và làm thuần các chủng nấm sợi từ các mẫu………………...……12 3.2. Khảo sát khả năng diệt côn trùng của các chủng nấm sợi thu được……….12 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN Năm học 2015 - 2016 1. Tên đề tài: Khảo sát khả năng diệt côn trùng của nấm sợi phân lâ ̣p từ đất vườn tỉnh Bình Dương. 2. Mã số: (do cán bộ quản lý ghi) 3. Loại hình nghiên cứu:  Cơ bản  Ứng dụng  Triển khai 4. Lĩnh vực nghiên cứu: Khoa học Xã hội và Nhân văn Khoa học Kỹ thuật và Công nghệ Kinh tế Khoa học Tự nhiên Khoa học Giáo dục 5. Thời gian thực hiện: 6 tháng Từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 3 năm 2016 6. Đơn vị quản lý về chuyên môn: Khoa: Bộ môn: Tài Nguyên Môi Trường Sinh học ứng dụng 7. Giáo viên hướng dẫn: Họ và tên: Học vị: Nguyễn Anh Dũng Thạc sĩ Đơn vị công tác (Khoa, Phòng): Khoa Tài Nguyên Môi Trường Địa chỉ nhà riêng: Điện thoại nhà riêng: Di động: E-mail: 090 786 03 88 [email protected] 8. Nhóm sinh viên thực hiện đề tài: Sinh viên chịu trách nhiệm chính: Lê Thị Nhàn Email: [email protected] MỞ ĐẦU SĐT: 097 436 66 23 Viê ̣t Nam là nước ở vùng nhiê ̣t đới, có khí hâ ̣u nóng ẩm mưa nhiều, là điều kiê ̣n thuâ ̣n lợi cho phát triển nông nghiê ̣p. Tuy nhiên đó cũng là điều kiê ̣n cho nhiều loài côn trùng phát triển và phá hoại mùa màng. Theo thống kê thì hàng năm, côn trùng hại cây trồng đã làm giảm 14% tổng sản lượng của các ngành nông, lâm nước ta. Côn trùng làm giảm năng suất, chất lượng cây trồng [17][18]. Để ngăn ngừa sự phá hoại của côn trùng với mùa màng thì biê ̣n pháp phổ biến nhất là sử dụng các loại thuốc trừ sâu hóa học. Đây là phương pháp hiệu quả nhanh và cao tuy nhiên việc sử dụng thuốc hóa học bừa bãi, không đúng liều là một tác nhân chọn lọc làm xảy xa hiện tượng lờn thuốc ở côn trùng có hại. Bên cạnh đó thuốc hóa học còn tiêu diệt các sinh vật khác, kể cả các loài có lợi. Nhưng quan trọng hơn là việc lạm dụng thuốc hóa học còn ảnh hưởng tới sức khỏe con người, làm ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái [17][18]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra có khoảng hơn 700 loài nấm thuộc 90 giống như Bauveria, Metarhizium, Verticillium, Hirsutella, Culinomyces, Zoophthora, Nomuraea, Aspergillus, Aschersonia, Paecilomyces, Tolypocladium, Leptolegnia, Coelomyces, Lagenidium.v.v… với khả năng kí sinh cũng như sinh ra những hoạt chất sinh học gây đô ̣c với côn trùng [8][9][12][13][14][15]. Chính vì vâ ̣y với mong muốn thu nhận một số chủng nấm sợi có khả năng diê ̣t côn trùng từ đó tạo ra những chế phẩm trừ sâu sinh học an toàn nhằm hạn chế sự ô nhiễm môi trường do trừ sâu, cũng như xây dựng nền nông nghiê ̣p sạch hơn. Chúng tôi tiến hành đề tài “ Khảo sát khả năng sinh diệt côn trùng của nấm sợi phân lâ ̣p từ đất vườn tỉnh Bình Dương”.  Mục tiêu đề tài Phân lập, khảo sát và tuyển chọn được mô ̣t số chủng nấm sợi có khả năng diệt côn trùng phân lập từ đất vườn tỉnh Bình Dương.  Nhiệm vụ của đề tài - Phân lập các chủng nấm sợi thu nhận từ đất vườn. - Khảo sát khả năng diệt côn trùng của các chủng nấm sợi phân lập được. - Tuyển chọn 3-5 chủng nấm sợi có khả năng diệt côn trùng tốt. - Phân loại đến chi các chủng nấm sợi đã tuyển chọn.  Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: + Các chủng nấm sợi phân lập từ đất, thân, cành mục, lá. + Một số nhóm côn trùng đối chứng phá hoại mùa màng dùng làm thí nghiê ̣m: sâu quy hay còn gọi là Super worm (Zaphobas morio Fabricius) mua tại cửa hàng chim cảnh; cào cào lúa (oxya sp.) và dế mèn (Gryllus sp. và Acheta sp.) bắt tại ruô ̣ng lúa. - Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát khả năng diệt côn trùng (sâu quy, dế mèn, cào cào) của một số chủng nấm sợi trong quy mô phòng thí nghiệm.  Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài - Thời gian: từ tháng 9/2015 – 3/2016. - Địa điểm: đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Nông nghiệp chất lượng cao, Khoa Tài nguyên Môi trường, Trường Đại học Thủ Dầu Một. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về nấm sợi 1.1.1. Vị trí phân loại Về phân loại nấm, hiện nay có hai hệ thống phân loại nấm được sử dụng phổ biến hơn cả là: Hệ thống phân loại hình thái học và hệ thống phân loại phát sinh, với nhiều khóa phân loại được sử dụng như: Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Barnett và cộng sự (1972), Ainsworth G.C và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby (1995).[16] Cho đến nay chưa có hệ thống phân loại nấm nào được các nhà nấm học thống nhất công nhận.Tuy nhiên hệ thống phân loại của G.C. Anisworth (1973) là được sử dụng rộng rãi hơn cả. Theo hệ thống phân loại này, Giới Nấm ( Fungi) được chia thành 2 ngành: - Ngành Nấm nhầy (Myxomycota) - Ngành Nấm thật (Eumycota) + Ngành phụ Mastigomycotina: lớp Chytridiomycetes, lớp Hyphochytridiales, lớp Plasmodiophoromycetes, lớp Oomycetes, lớp Laboulbeniomycetes, lớp Discomycetes, lớp Plectomycetes, lớp Pyrenomycetes, lớp Loculoascomycetes. + Ngành phụ Deuteromycotina: lớp Blastomycetes, lớp Hyphomycetes. + Ngành phụ Zygomycotina: lớp Zygomycetes, lớp Trichomycetes. + Ngành phụ Ascomycotina: lớp Hemiascomycetes. + Ngành phụ Basidiomycotina: lớp Teliomycetes, lớp Hymenomycetes, lớp Coelomycetes, lớp Gasteromycetes. Người ta ước tính trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài. Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài.Riêng các loài nấm thuộc lớp Nấm bất toàn ở nước ta hiện chỉ mới phát hiện được 338 loài thuộc 306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Việc phân loại nấm sợi chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý, hóa sinh và phương thức sinh sản.[12] 1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm sợi Nấm sợi là vi sinh vật có nhân chuẩn. Hệ nấm có cấu tạo khuẩn ty dạng sợi, sợi nấm (hypha) là những ống dài phân nhánh hay không phân nhánh, có hay không có vách ngăn ngang (septum), đường kính sợi từ 3-3,5 µm. Các sợi nấm phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể. [19] Hình 1.1. Cấu trúc nấm sợi[23] Cấu trúc sợi nấm gồm có thành tế bào, màng, tế bào chất và nhân. Thành tế bào nấm sợi chứa kitin-cellulose hoặc kitin-glucan.[20] Hệ nấm sợi phất triển thành các dạng khuẩn lạc khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm. Khuẩn lạc nấm sợi thường có dạng hình tròn hoặc gần tròn. Bề mặt khuẩn lạc có thể mượt, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những vết khứa xuyên tâm hoặc lồ lõm không đều. Mép khuẩn lạc trơn, răng cưa. [21] Một số nấm sợi có thể tiết sắc tố vào môi trường hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm.Các đặc điểm hình thái khác có tính đặc trưng cho loài như bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết, sắc tố hòa tan.[19] Phương thức dinh dưỡng của nấm sợi là hấp phụ qua màng, không có cơ quan tiêu hóa, không có khả năng quang hợp.Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và động vật. Hình 1.2. Hình thái một số dạng bào tử của nấm sợi Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính. Bào tử vô tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong đó bào tử trần là phổ biến nhất. Trong sinh sản hữu tính, nấm sợi có các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp.[20] Nấm sợi được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học như: enzyme, các chất kháng sinh, các axit hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và đem lại lợi ích kinh tế cao. Bên cạnh đó, từ nấm sợi còn có các chất có khả năng phân giải nguồn cacbohidrat ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất.[1][16][20] 1.1.3. Khả năng diệt côn trùng của nấm sợi Nấm kí sinh côn trùng thường tác động đến những loại mô nhất định như tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease, lipase) của nấm. Chúng lây lan từ con ốm sang con khỏe mạnh thông qua tiếp xúc trực tiếp hay qua nguồn thức ăn có chứa mầm bệnh. Nấm gây bệnh theo con đường chính là bào tử nảy mầm phát triển thành hệ sợi ăn sâu vào khoang bụng, qua đường tiêu hóa, thông qua các khí quản và chúng phủ kín các lỗ khí côn trùng làm chúng chết. Nấm còn gây bệnh cho côn trùng bằng cách tiết độc tố và các enzyme thủy phân. Do vậy việc dùng bào tử nấm này, rồi sản xuất hàng loạt, dùng trong nông nghiệp bảo vệ cây trồng là rất hiệu quả (Madelin 1963; Feng và cs 1954). [10] 1.2. Nghiên cứu về khả năng diệt côn trùng của nâm sợi trong và ngoài nước 1.2.1. Những nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, năm 1996, Tạ Kim Chỉnh khi thử nghiệm nấm sợi Metarhizium trên mối Coptotermus formosanus cho thấy mối chết do nấm sau 3 ngày đạt 91,35% ở nồng độ 18 x 107bt/ml (Tạ Kim Chỉnh, 1996). Hiện nay, có hơn 100 chi với hơn 700 loài nấm ký sinh côn trùng khác nhau và nhiều loài trong số đó có tiềm năng lớn trong quản lý dịch hại côn trùng (Roberts, 1989). Trong các loài nấm ký sinh gây bệnh ở côn trùng có nấm Paecilomyces javanicus thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes) giống Paecilomyces (Phạm Thị Thùy, 2004). Nấm P. javanicus có thể ký sinh nhiều loài thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ cánh nửa cứng Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp (2014)(4): 105-112 106 (Hemiptera), bộ cánh màng (Hymenoptera), bộ cánh vẩy (Lepidoptera) và bộ 2 cánh (Diptera) (Trần Văn Mão, 2002). Nguyễn Dương Khuê và cộng sự (1998) tại Viện Khoa học Lâm nghiệp đã thử nghiệm bào tử nấm Metarhizium để diệt mối Coptotermes formosanus trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả cho thấy mối chết 76,2% sau 2 tuần phun và 94,4% sau 3 tuần phun. Từ năm 1998 đến năm 2002, Trịnh Văn Hạnh và cộng sự (2001) ở Trung tâm nghiên cứu phòng trừ mối đã tuyển chọn được nhiều chủng nấm Metarhizium có khả năng gây chết mối trong điều kiện phòng thí nghiệm với hàm lượng bào tử thích hợp là 0,005g/100 cá thể mối. Phạm Thị Thùy và cộng sự (2002) đã sử dụng nấm Metarhizium để phòng trừ bọ dừa (Brontispa sp.) ở Bến Tre và kết quả cho thấy khả năng phòng trừ đạt 78% sau 7 ngày phun.[7] 1.2.2. Những nghiên cứu ngoài nước Năm 1815, lần đầu tiên Agostino Bassi (Italia) đã mô tả tỉ mỉ về nấm trắng Muscardin (B. bassian) gây bệnh trên tằm và đưa ra biện pháp ngăn ngừa. Các loài nấm sợi được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực phòng trừ sinh học như Beauveria basiana (Blas), Paecilomyces fumosoroeus thuộc lớp nấm bất toàn, do tính gây bệnh cao ở nhiều loài côn trùng. Vào những năm 70 của thế kỉ XX, Liên xô (cũ) là nước có số lượng công trình nghiên cứu ứng dụng nấm diệt côn trùng lớn nhất thế giới. Ở Úc thử nghiệm diệt sâu hại mía, diệt loài mối Coptotemes bằng M.anisopliae.Ở Trung Quốc người ta sử dụng nấm P.farinosus, B.bassiana, M.anisopliae phòng trừ Dendrolimus tabulaeformic.[7] Năm 1969, Hamil và cs đã xác định được độc tố diệt côn trùng của nấm bạch cương Beaveria bassiana và đặt tên độc tố này là Beavericin, độc tố này đã làm cho nhiều loài côn trùng bị chết. Theo Bidochka và Khachatourians thì sản phẩm của B. bassiana là hai acid hữu cơ oxalic và citric khi nuôi trên môi trường chứa chitin, chúng tham gia vào hòa tan các protein biểu bì của côn trùng. [10] Khi nghiên cứu về nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium muscarium để chống lại ruồi trắng khoai lang (được coi là một vector truyền virus từ các loài thực vật) ở phòng thí nghiệm và nhà kính, Cuthbertson (2009) đã tách chiết được 5 chất hóa học có khả năng diệt ruồi trắng. Roditakis và cs (2007) nhận thấy chủng Lecanicillium longisporum kiểm soát rệp xanh Myzus persicae trên cây đào. Nấm L. longisporum tác động lên đầu rệp, nảy mầm và xâm lược vào lớp biểu bì của rệp. [10] Năm 2002, Liu và cs nhận thấy 2 chủng B. bassiana và M. anisoplise rất nhạy cảm với ấu trùng con trưởng thành của quần thể rệp cây Lygus lineolaris. Migiro và cộng sự (2010) cho thấy 2 chủng này có khả năng diệt ruồi Liriomyza huidobrensis và kiểm soát dịch do loài này gây ra rất cao. [10] Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Dụng cụ Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, pipet, que cấy, que gạt, bông không thấm nước, bông thấm nước, khoan nút chai, đèn cồn, cốc thủy tinh, phiến kính, lá kính, bình phun sương,.... 2.1.2. Máy móc Tủ c ấy vô trùng, cân, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp, kính hiển vi,... 2.2.3. Môi trường nuôi cấy[6] + MT1 : MT Czapek – Dox: Nuôi cấy, giữ giống nấm sợi.[6] Glucose 20g KH2PO4 1,5g NaNO3 3,5g KCL 0,5g MgSO4.7H2O 0,5g FeSO4.7H2O 0,1g (vết) Agar 20g Nước cất 1000ml pH = 6,5-7 + MT2: Malt Extract Agar ( MEA) : Dùng để phân loại nấm sợi. [6] Malt Extract 20g Pepton 1g Glucose 20g Agar 20g Nước cất 1000ml pH= 5 + MT3 : PGA [6]. Glucose 30g Agar 20 g Nước cất 1000ml Khoai tây 200g + MT4: Môi trường nuôi côn trùng. [22] - Nuôi sâu quy: các loại trái cây chín: chuối, cám gạo.v.v… - Nuôi dế: Cám gạo, cám mì, nước phun sương. - Nuôi cào cào: Cám, cỏ và nước phun sương hay khay nước. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Thu các mẫu đất, thân mục, cành mục, lá mục tại nhà vườn ở một số huyện tại tỉnh Bình Dương. - Tiến hành phân lập và làm thuần các chủng nấm sợi từ các mẫu. - Khảo sát khả năng diệt côn trùng của các chủng nấm sợi thu được. 2.3.Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu. [2][13] Mẫu được lấy ngẫu nhiên tại các vị trí khác nhau (mỗi vị trí cách nhau ít nhất 2m). Lấy mẫu đất tại các lớp đất mặt (0,1-0,2cm), thân mục, cành mục, lá. Dùng dụng cụ vô trùng để lấy mẫu đất (không sâu quá 5cm), lá mục, thân mục, cành mục. Các mẫu thu được vào các túi nilon vô trùng, buộc kín miệng túi, đánh số, ghi tên mẫu,… Sau đó các mẫu được chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập không quá 24h sau khi lấy mẫu. 2.3.2. Phương pháp phân lập mẫu, làm thuần, bảo quản và giữ giống. [2][13] Dùng dụng cụ vô trùng lấy 1 gam đất (thân, cành, lá mục) cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất đã vô trùng, lắc đều. Tiếp tục dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch lọc truyền cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất đã vô trùng, tiến hành pha loãng ở 10-3, 10-4. Dùng pipet vô trùng hút 0,1ml dịch lọc ở độ pha loãng10 -3, 10-4lên bề mặt môi trường PGA đã chuẩn bị sẵn trong các đĩa petri. Dùng que cấy trang trang đều dịch trên bề mặt môi trường, gói lại bằng giấy báo, để ở nhiệt độ phòng. Sau 3-5 ngày mang các đĩa petri ra quan sát, đếm số lượng và đánh dấu khuẩn lạc nấm sợi. Dùng que cấy vô trùng tách riêng rẽ mẫu nấm sợi từ các khuẩn lạc đã được đánh dấu sang các đĩa petri có chứa môi trường PGA đã chuẩn bị trước. Sau 3-5 ngày nuôi cấy, lấy ra kiểm tra, loại bỏ những đĩa petri bị nhiễm, giữ lại các đĩa petri có các chủng nấm thuần. Tiến hành cấy các chủng nấm đã thuần vào ống thạch nghiêng chứa môi trường PGA đã chuẩn bị trước để bảo quản và giữ giống trong tủ lạnh. 2.3.3. Khảo sát khả năng diệt côn trùng của các chủng nấm sợi [1][6]. - Nguyên tắc: khả năng diệt côn trùng của các chủng nấm sợi được đánh giá thông qua tỉ lệ côn trùng chết. - Mỗi chủng nấm sợi được nuôi cấy trên môi trường MT3 để thu bào tử. + Lô thí nghiêm: ̣ Chuẩn bị các thùng xốp kích thước Dài X Rô ̣ng X Cao : 30 X 20 X 40 với môi trường thích hợp để nuôi các loại côn trùng cần nghiên cứu như trên (mục 11.1). Mỗi thùng xốp chỉ nuôi 1 loại côn trùng với số lượng là sâu quy 100 con, dế 30 con, cào cào 30 con. Sau đó tiến hành thí nghiê ̣m bằng cách phun 30 ml dịch nước cất chứa bào tử nấm với mâ ̣t đô ̣ bào tử là 108 CFU/ml. Hàng ngày theo dõi, ghi nhận và kiểm tra số lượng côn trùng chết sau đó tính toán kết quả ngay tại thời điểm đó. Tiếp tục theo dõi sau 15 ngày thì dừng thí nghiê ̣m và tính toán kết quả. Mỗi nghiê ̣m thức trên mỗi loại côn trùng được lă ̣p lại 3 lần.. + Lô đối chứng: Cũng tương tự như lô thí nghiê ̣m nhưng dịch phun xịt là 30 ml nước cất. Mỗi nghiê ̣m thức cũng lă ̣p lại 3 lần. Tính toán kết quả: Với công thức CV% = (d/D) X 100 Trong đó: CV% : hiê ̣u suất d: côn trùng chết đi trong mỗi nghiê ̣m thức sau 15 ngày. D: Số côn trùng khi thí thí nghiê ̣m ban đầu Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và làm thuần các chủng nấm sợi từ các mẫu. Có hơn 20 mẫu nấm sợi được phân lập và làm thuần từ các mẫu đất, lá mục, cành mục,... lấy từ đất vườn tỉnh Bình Dương. Qua quan sát vi thể, cuống sinh bào tử, thể sợi và bào tử nấm trên kính hiển vi, đối chiếu với khóa định loại của Lương Đức Phẩm (2003), các mẫu nấm sợi thuđược thuộc nhiều chủng khác nhau. Bảng 3.1.Bảng thống kê các chủng nấm sợi thuộc các chi. STT Chi Các chủng nấm 1 Aspergillus T1, T5, L1.1, L3, L4, L5.1, Đ3.2, Đ6.2. 2 Penicillium CT2 3 Pyricularia Đ6.1 3.2. Khảo sát khả năng diệt côn trùng của các chủng nấm sợi thu được Với thí nghiệm khảo sát khả năng diệt côn trùng của 20 chủng nấm sợi thu được, nhận thấy hầu hết các chủng nấm sợi đều có khả năng tiêu diệt côn trùng, đối với mỗi loại côn trùng khác nhau khả năng diệt chúng của mỗi loại nấm cũng khác nhau. - Đối với Sâu quy: Bảng 3.2. Tỉ lệ sâu quy chết trong nghiệm thức thí nghiệm theo thời gian Thời gian 3 ngày 5 ngày 100% 100% STT Chủng nấm 1 L5.1 2 L3 78% 91% 3 CT2 73% 100% 4 Đối chứng 0% 0% + Sau 3 ngày phun bào tử nấm ở các lô thí nghiệm tỉ lệ sâu quy chết đã đạt trên 50% ở hầu hết các chủng nấm sợi, chiếm tỉ lệ 75%. Trong đó có các chủng diệt sâu quy mạnh như L5.1 (100%), L3 (78%), CT2 ( 73%). Trong khi đó, ở lô đối chứng tỉ lệ sâu quy chết là 0%. a) c) d) b)