Tài liệu Khảo sát hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột và hoạt tính ức chế enzym hmg coa reductase của các cao chiết từ thân đậu bắp abelmoschus esculentus (l.) malvaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- VƯƠNG TỐ UYÊN KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ HẤP THU GLUCOSE QUA RUỘT VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM HMG-COA REDUCTASE CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ THÂN ĐẬU BẮP ABELMOSCHUS ESCULENTUS (L.) MALVACEAE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- VƯƠNG TỐ UYÊN KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ HẤP THU GLUCOSE QUA RUỘT VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM HMG-COA REDUCTASE CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ THÂN ĐẬU BẮP ABELMOSCHUS ESCULENTUS (L.) MALVACEAE Chuyên ngành: Dược Lý - Dược Lâm Sàng Mã số: 60720405 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. MAI PHƯƠNG MAI PGS.TS. HUỲNH NGỌC TRINH Thành phố Hồ Chí Minh - 2017 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn của cô PGS.TS. Mai Phương Mai và cô PGS.TS. Huỳnh Ngọc Trinh. Các số liệu, nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác trước đây. TP. Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng 09 năm 2017 Tác giả VƯƠNG TỐ UYÊN iii LỜI CẢM ƠN Để có được bản luận văn tốt nghiệp này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đ ến các thầy cô khoa Dược – trường Đ ại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, phòng đào tạo sau đại học, đặc biệt là cô PGS.TS. Mai Phương Mai và cô PGS.TS. Huỳnh Ngọc Trinh đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ em trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành đ ề tài “Khảo sát hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột và hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase của các cao chiết từ thân Đậu bắp Abelmoschus esculentus (L.) Malvaceae”. Em xin chân thành cảm ơn các quý thầy cô, các anh chị ở bộ môn Dược lý, bộ môn Dược liệu, bộ môn Sinh hóa, bộ môn Nghiên cứu khoa học, bộ môn Hóa Dược, Trung tâm Sâm và Dược liệu – khoa Dược, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài. Em xin chân thành cảm ơn bạn DS. Nguyễn Dương Ngọc Thới, DS. Vưu Thanh Tú Quyên, ThS.DS. Lê Thị Ngọc Thúy đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em rất mong nhận được sự đóng góp, phê bình của quý thầy cô, các anh chị và các bạn đồng nghiệp. iv Luận văn thạc sĩ dược học – Khóa 2015-2017 Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng – Mã số: 60720402 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ HẤP THU GLUCOSE QUA RUỘT VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM HMG-COA REDUCTASE CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ THÂN ĐẬU BẮP ABELMOSCHUS ESCULENTUS (L.) MALVACEAE Vương Tố Uyên Thầy hướng dẫn: PGS. TS. Mai Phương Mai PGS. TS. Huỳnh Ngọc Trinh Mục tiêu: Khảo sát hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột của các cao chiết từ thân Đậu bắp trên ruột non chuột nhắt trắng. Khảo sát hoạt tính ức chế HMG-CoA reductase của các cao chiết từ thân Đậu bắp trên mô hình in vitro và in vivo. Phương pháp: Chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino, giống đực, từ 6 – 8 tuần tuổi. Các cao chiết từ thân Đậu bắp. Áp dụng phương pháp lộn ngược ruột để khảo sát hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột của các cao chiết từ thân Đậu bắp. Sử dụng dịch đồng thể enzym từ gan chuột để khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMGCoA reductase của các cao chiết từ thân Đậu bắp trên mô hình in vitro và in vivo. Kết quả: Cả 2 cao đều thể hiện hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột, trong đó cao ethyl acetat có hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột mạnh hơn cao toàn phần. IC50 của cao toàn phần và cao ethyl acetat lần lượt là 9,27 mg/ml và 1,05 mg/ml. Cả 2 cao đều thể hiện hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase trên mô hình in vitro,. IC50 ước lượng đư ợc của atorvastatin là 7,77 ng/ml, của cao toàn phần là 1002,03 µg/ml và của cao ethyl acetat là 445,97 µg/ml. Ở liều 60 g dược liệu khô/kg, cao toàn phần và cao ethyl acetat thể hiện hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase in vivo lần lượt là 26,91% và 25,5% so với nhóm chứng bệnh. Kết luận: Cả 2 cao Đậu bắp đều thể hiện hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột ex vivo và hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro, in vivo. Từ khóa: Cao toàn phần, cao ethyl acetat, hấp thu glucose qua ruột, phương pháp lộn ngược ruột, enzym HMG-CoA reductase, dịch đồng thể. v The master of Pharmacology – Courses 2015 – 2017 Specialization: Pharmacology – Clinical Pharmacy – Code: 60720402 Vuong To Uyen Supervisor: Assoc. Prof. Mai Phuong Mai, PhD Assoc. Prof. Huynh Ngoc Trinh, PhD INVESTIGATION OF INTESTINAL GLUCOSE ABSORPTION INHIBITORY ACTIVITY AND ENZYM HMG-COA REDUCTASE INHIBITORY ACTIVITY OF EXTRACTS FROM ABELMOSCHUS ESCULENTUS (L.) MALVACEAE Objective: Investigation of intestinal glucose absorption inhibitory activity and HMG-CoA reductase inhibitory activity of extracts from Abelmoschus Esculentus (L.) Malvaceae in vitro and in vivo. Methods: Mice, male, Swiss albino, 6 – 8 weeks of age. Absortion studies were performed using the everted gut sac model from mouse jejunum to investigate the inhibition of intestinal glucose absorption of extracts from Abelmoschus Esculentus (L.) Malvaceae. Using the homogenate from mouse liver to investigate HMG-CoA reductase inhibitory activity of these extracts in vitro and in vivo. Results: Both extracts showed intestinal glucose absorption inhibition, extract from ethyl acetat inhibited intestinal glucose absorption more strongly. IC50 of extract from ethanol 50% is 9,27 mg/ml, extract from ethyl acetat is 1,05 mg/ml. Both extracts showed HMG-CoA reductase inhibitory activity in vitro; IC50 of atorvastatin is 7,77 ng/ml, extract from ethanol 50% is 1002,03 µg/ml, extract from ethyl acetat is 445,97 µg/ml. In vivo, both extracts from ethanol and ethyl acetat showed HMG-CoA reductase inhibitory activity 26,91% and 25,5%, respectively. Conclusion: Both extracts from Abelmoschus Esculentus (L.) Malvaceae showed the intestinal glucose absorption inhibitor activity ex vivo, enzym HMG-CoA reductase inhibitory activity in vitro and in vivo. Keywords: Extract from ethanol 50%, extract from ethyl acetat, intestinal glucose absorption, everted gut sac method, HMG-CoA reductase, homogenate. vi MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. ix DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. x DANH MỤC HÌNH................................................................................................. xi CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................... 1 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 2 2.1. QUÁ TRÌNH HẤP THU GLUCOSE QUA TẾ BÀO BIỂU MÔ RUỘT ......................... 2 2.1.1. Đại cương sự hấp thu các chất qua tế bào biểu mô ruột.................................................. 2 2.1.2. Các mô hình thực nghiệm nghiên cứu sự hấp thu glucose qua ruột................................ 7 2.1.3. Phương pháp sử dụng đoạn ruột được lộn ngược............................................................ 8 2.1.4. Phloridzin ........................................................................................................................ 9 2.2. QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP CHOLESTEROL VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYM HMGCOA REDUCTASE ................................................................................................................... 11 2.2.1. Quá trình tổng hợp cholesterol ...................................................................................... 11 2.2.2. Enzym HMG-CoA reductase ........................................................................................ 12 2.2.3. Thuốc ức chế HMG-CoA reductase .............................................................................. 14 2.2.4. Các thử nghiệm ức chế enzym HMG-CoA reductase từ dịch đồng thể enzym ............ 18 2.3. CÂY ĐẬU BẮP ................................................................................................................... 19 2.3.1. Tên gọi - Phân loại thực vật ........................................................................................... 20 2.3.2. Mô tả .............................................................................................................................. 20 2.3.3. Phân bố, thu hái và chế biến .......................................................................................... 20 2.3.4. Thành phần hóa học....................................................................................................... 21 2.3.5. Tác dụng dược lý ........................................................................................................... 21 CHƯƠNG 3. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 24 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................................. 24 3.1.1. Động vật thí nghiệm ...................................................................................................... 24 3.1.2. Dược liệu ........................................................................................................................ 24 3.1.3. Hóa chất và dung môi .................................................................................................... 26 3.1.4. Trang thiết bị – Dụng cụ ................................................................................................. 27 vii 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 27 3.2.1. Kiểm nghiệm dược liệu ................................................................................................. 27 3.2.2. Khảo sát hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột ...................................................... 30 3.2.3. Quy trình tạo dịch đồng thể enzym từ gan chuột nhắt .................................................. 34 3.2.4. Định lượng hàm lượng protein trong dịch đồng thể enzym gan thu được bằng phương pháp Biuret .............................................................................................................................. 36 3.2.5. Phương pháp định lượng hoạt tính HMG-CoA reductase ............................................. 37 3.2.6. Phương pháp định lượng lipid huyết ............................................................................. 38 3.2.7. Khảo sát hoạt tính ức chế HMG-CoA reductase trên mô hình in vitro ......................... 41 3.2.8. Khảo sát hoạt tính ức chế HMG-CoA reductase trên mô hình chuột tăng lipid huyết cấp tính ........................................................................................................................................... 42 3.3. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ THỐNG KÊ .............................................................................. 43 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................... 44 4.1. Kết quả chiết xuất dược liệu .............................................................................................. 44 4.2. Kiểm nghiệm dược liệu thân Đậu bắp (Abelmoschus esculentus L.) .............................. 45 4.2.1. Soi bột dược liệu............................................................................................................ 45 4.2.2. Các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu .................................................................................... 46 4.3. Khảo sát hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột........................................................ 51 4.3.1. Khảo sát hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột của cao toàn phần từ thân cây Đậu bắp ........................................................................................................................................... 51 4.3.2. Khảo sát hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột của cao ethyl acetat từ thân cây Đậu bắp ........................................................................................................................................... 54 4.4. Khảo sát hoạt tính ức chế HMG-CoA reductase trên mô hình in vitro ......................... 58 4.4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro của atorvastatin ................................................................................................................................................. 58 4.4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro của cao toàn phần Đậu bắp. .......................................................................................................................... 60 4.4.3. Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro của cao ethyl acetat Đậu bắp. ........................................................................................................................ 62 4.5. Khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase trên mô hình chuột tăng lipid huyết cấp tính ............................................................................................................................. 64 4.5.1. Tác dụng hạ lipid huyết ................................................................................................. 64 4.5.2. Hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase.............................................................. 66 CHƯƠNG 5. BÀN LUẬN ..................................................................................... 69 viii 5.1. Kiểm nghiệm dược liệu ....................................................................................................... 69 5.2. Khảo sát hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột........................................................ 69 5.3. Khảo sát hoạt tính ức chế HMG-CoA reductase trên mô hình in vitro ......................... 70 5.4. Khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase trên mô hình chuột tăng lipid huyết cấp tính. ............................................................................................................................ 71 5.4.1. Tác dụng hạ lipid huyết ................................................................................................. 71 5.4.2. Hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase.............................................................. 72 CHƯƠNG 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 73 ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh LDL-C Tiếng Việt Low-density lipoprotein Cholesterol Cholesterol trong lipoprotein tỷ trọng thấp LDL-R Low-density lipoprotein receptor Thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp HDL-C High-density lipoprotein Cholesterol trong lipoprotein Cholesterol tỷ trọng cao HMG-CoA Hydroxymethylglutaryl Coenzym A TG Triglyceride SGLT1/2 Sodium-glucose linked transporter Chất đồng vận chuyển Na+- 1/2 glucose 1/2 GLUT1/2/5 Glucose transporter 1/2/5 Chất vận chuyển glucose Papp 1/2/5 Tính thấm biểu kiến Apparent permeability EA Ethyl acetat IV Intravenous FC Folin-Ciocalteu’s phenol Tiêm tĩnh mạch Cao TP Cao toàn phần Ator 64 Atorvastatin liều 64 mg/kg x DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Điều trị RLLH bằng liệu pháp statin theo hướng dẫn của ATP-IV ........ 15 Bảng 2.2. Một số thông số dược lực, dược động của các thuốc nhóm statin .......... 16 Bảng 3.1. Pha giai mẫu chuẩn ................................................................................. 29 Bảng 3.2. Hỗn hợp phản ứng với thuốc thử FC ...................................................... 29 Bảng 4.1. Độ ẩm, độ tro của các cao Đậu bắp......................................................... 46 Bảng 4.2. Hàm lượng polyphenol của các cao Đậu bắp.......................................... 50 Bảng 4.3. Sự hấp thu glucose qua ruột của các nhóm chuột thử nghiệm ................ 51 Bảng 4.4. Sự hấp thu glucose qua ruột của các nhóm ủ với cao toàn phần ............ 53 Bảng 4.5. Sự hấp thu glucose qua ruột của các nhóm chuột thử nghiệm ................ 55 Bảng 4.6. Sự hấp thu glucose qua ruột của các nhóm ủ với cao ethyl acetat .......... 56 Bảng 4.7. Hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro của atorvastatin. 58 Bảng 4.8. Kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG -CoA reductase in vitro của cao toàn phần Đậu bắp.......................................................... 60 Bảng 4.9. Kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG -CoA reductase in vitro của cao ethyl acetat. .................................................................... 62 Bảng 4.10. Nồng độ cholesterol và triglycerid (mg/dl) của các nhóm chuột thử nghiệm...................................................................................................................... 64 Bảng 4.11. Kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG -CoA reductase trên mô hình chuột tăng lipid huyết cấp tính và điều trị trong 24 giờ ..... 66 xi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Các bộ phận của đường dạ dày – ruột ở chuột .......................................... 2 Hình 2.2. Cấu trúc giải phẫu biểu mô ruột non ......................................................... 3 Hình 2.3. Các con đường vận chuyển các chất qua màng......................................... 5 Hình 2.4. Mô hình tế bào của chất đồng vận chuyển Na+-glucose .......................... 6 Hình 2.5. Cấu trúc hóa học của phloridzin và phloretin ........................................... 9 Hình 2.6. Quá trình tổng hợp cholesterol ................................................................ 12 Hình 2.7. Vị trí của enzym HMG-CoA reductase trong tế bào............................... 13 Hình 2.8. Cấu trúc hóa học của atorvastatin ........................................................... 16 Hình 2.9. Cây Đậu bắp Abelmoschus esculentus (L.) Malvaceae ........................... 19 Hình 3.1. Sơ đồ chiết phân đoạn thân cây Đậu bắp (Abelmoschus esculentus L.) . 25 Hình 3.2. Các giai đoạn của kỹ thuật lộn ngược ruột và điền vào túi ruột.............. 32 Hình 4.1. Lông che chở đơn bào ............................................................................. 45 Hình 4.2. Mảnh mô mềm ........................................................................................ 45 Hình 4.3. Tinh thể Calci Oxalat .............................................................................. 45 Hình 4.4. Tinh bột hình trứng ................................................................................. 45 Hình 4.5. Mạch xoắn ............................................................................................... 45 Hình 4.6. Mạch điểm ............................................................................................... 45 Hình 4.7. Mạch vạch ............................................................................................... 45 Hình 4.8. Mạch mạng .............................................................................................. 45 Hình 4.9. Khối nhựa màu vàng ............................................................................... 45 Hình 4.10. Phản ứng tăng màu với NaOH 1% ........................................................ 46 Hình 4.11. Phản ứng với FeCl3 tạo dịch màu nâu đen ............................................ 46 xii Hình 4.12. Phản ứng với chì acetate trung tính cho tủa màu vàng nhạt.................. 47 Hình 4.13. Phản ứng với diazonium cho dung dịch màu nâu cam.......................... 47 Hình 4.14. Phản ứng với cyanidin cho dung dịch màu hồng nhạt .......................... 47 Hình 4.15. Sắc ký lớp mỏng cao toàn phần và ethyl acetat .................................... 48 Hình 4.16. Sắc ký hiệu lỏng hiệu năng cao của cao toàn phần và cao ethyl acetat 49 Hình 4.17. Đường chuẩn pyrogallol ........................................................................ 50 Hình 4.18. Tính thấm biểu kiến Papp của các nhóm chuột thử nghiệm ................... 52 Hình 4.19. Đường tuyến tính sự phụ thuộc % ức chế sự hấp thu glucose qua ruột vào nồng độ cao toàn phần....................................................................................... 54 Hình 4.20. Tính thấm biểu kiến Papp của các nhóm chuột thử nghiệm ................... 55 Hình 4.21. Đường tuyến tính sự phụ thuộc % ức chế sự hấp thu glucose qua ruột vào nồng độ cao ethyl acetat .................................................................................... 57 Hình 4.22. Đường tuyến tính sự phụ thuộc của % ức chế enzym HMG -CoA reductase vào nồng độ atorvastatin .......................................................................... 59 Hình 4.23. Đường tuyến tính sự phụ thuộc của % ức chế enzym HMG -CoA reductase vào nồng độ cao toàn phần ...................................................................... 61 Hình 4.24. Đường tuyến tính sự phụ thuộc của % ức chế enzym HMG -CoA reductase vào nồng độ cao ethyl acetat. ................................................................... 63 Hình 4.25. Nồng độ cholesterol huyết của các nhóm chuột thử nghiệm sau 24 giờ điều trị ...................................................................................................................... 64 Hình 4.26. Nồng độ triglycerid huyết của các nhóm chuột thử nghiệm sau 24 giờ điều trị ...................................................................................................................... 65 Hình 4.27. Hoạt tính enzym HMG-CoA reductase (nmol/phút) của các nhóm chuột thử nghiệm ............................................................................................................... 67 1 CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, mặc dù ngành Y học đã có rất nhiều tiến bộ vượt bậc trong nghiên cứu thuốc và điều trị các căn bệnh thời đại, tuy nhiên tỷ lệ mắc các bệnh rối loạn lipid huyết và đái tháo đường vẫn đang có xu hướng gia tăng trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Đái tháo đường và rối loạn lipid huyết là hai yếu tố nguy cơ chính liên quan đ ến bệnh tim mạch. Hơn nữa, đái tháo đường và rối loạn lipid huyết có mối liên hệ chặt chẽ với nhau [73]. Chính vì vậy, hiện nay xu hướng sử dụng các thảo dược có đồng thời hai tác dụng hạ glucose huyết và lipid huyết đang rất được quan tâm. Thân và quả Đậu bắp Abelmoschus esculentus (L.) Malvaceae đã được chứng minh có cả hai tác dụng này trong rất nhiều nghiên cứu [4], [5], [8], [11], [12], [13], [14]. Qua các nghiên cứu cho thấy, các cao chiết từ thân Đậu bắp, đặc biệt là cao chiết toàn phần bằng cồn 50% và cao chiết phân đoạn ethyl acetat có tác dụng hạ glucose huyết và hạ lipid huyết rất tốt. Tuy nhiên, cơ chế tác dụng trên glucose huyết và lipid huyết của Đậu bắp vẫn chưa được chứng minh. Với mong muốn chứng minh một trong những cơ chế làm hạ glucose huyết cũng như lipid huyết của Đậu bắp, chúng tôi thực hiện đề tài "Khảo sát hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột và hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase của các cao chiết từ thân Đậu bắp Abelmoschus esculentus (L.) Malvaceae". Nghiên cứu của chúng tôi gồm các mục tiêu: - Khảo sát hoạt tính ức chế hấp thu glucose qua ruột của các cao chiết từ thân Đậu bắp trên ruột non chuột nhắt trắng. - Khảo sát hoạt tính ức chế HMG-CoA reductase trên mô hình in vitro của các cao chiết từ thân Đậu bắp. - Khảo sát hoạt tính ức chế HMG-CoA reductase của các cao chiết từ thân Đậu bắp trên chuột tăng lipid huyết cấp tính. 2 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. QUÁ TRÌNH HẤP THU GLUCOSE QUA TẾ BÀO BIỂU MÔ RUỘT 2.1.1. Đại cương sự hấp thu các chất qua tế bào biểu mô ruột 2.1.1.1. Cấu trúc mô ruột non Chức năng chính của hệ tiêu hóa là tiêu hóa thức ăn, hấp thu các chất dinh dưỡng chính yếu như các loại đường và các acid amin, ngoài ra còn đóng vai trò như rào cản ngăn tác động có hại của enzym tiêu hóa, các chất độc và vi khuẩn, cuối cùng là giúp loại bỏ các chất không tiêu hóa hoặc không hấp thu được. Sự hấp thu các chất ở đường tiêu hóa xảy ra chính ở 3 vùng của ruột non bao gồm tá tràng, hỗng tràng và hồi tràng (hình 2.1) và ít hơn ở kết tràng, dạ dày và khoang miệng. Cả đoạn ruột non từ tá tràng đến hồi tràng đều có vai trò hấp thu carbohydrat. Mỗi vùng ruột có cấu trúc giải phẫu, thuộc tính sinh hóa và sinh lý riêng biệt [2]. Dây chằng Treitz là ranh giới giữa tá tràng và hỗng tràng. Sự phân chia thành hỗng tràng và hồi tràng chỉ là quy ước vì thực tế không có một ranh giới giải phẫu nào giữa hai đoạn này [2]. Manh tràng Dạ dày Tuỵ Tá tràng Ruột già Kết tràng Hỗng tràng Hồi tràng Hình 2.1. Các bộ phận của đường dạ dày – ruột ở chuột [27] 3 Niêm mạc ruột non có nhiều nếp gấp hình van. Bản thân niêm mạc được bao phủ bởi những nhung mao (hình 2.2). Mỗi mm2 niêm mạc có khoảng 20 đến 40 nhung mao. Mỗi nhung mao là một chỗ lồi hình ngón tay, dài khoảng 0,5 – 1 mm, được bao phủ bởi một lớp tế bào biểu mô hình cột. Trong nhung mao có một mạng lưới mao mạch và hạch bạch huyết. Bờ tự do của các tế bào biểu mô của nhung mao lại chia thành những vi nhung mao làm tăng diện tích hấp thu của ruột non vào khoảng 250 đến 300 m2 [2]. Số lượng lớn các sợi nhung mao này làm tăng diện tích bề mặt của ruột (gần 10 lần) tạo điều kiện cho sự hấp thu và tiêu hoá. Lông nhung lớp biểu mô sẽ thay mới mỗi 2 - 4 ngày [78]. Hình 2.2. Cấu trúc giải phẫu biểu mô ruột non [78] Những tế bào biểu mô ruột là một nhóm tế bào không đồng nhất gồm: tế bào ruột, tế bào đáy, tế bào nội tiết, tế bào Paneth, tế bào M. Tế bào ruột có số lượng nhiều nhất trong nhóm tế bào biểu mô. Loại tế bào này có vai trò chính trong sự tiêu hóa và hấp thu cả chất dinh dưỡng và các loại thuốc tại ruột non. 2.1.1.2. Các con đường vận chuyển các chất qua biểu mô ruột [78] Một chất có thể được hấp thu bằng con đư ờng xuyên bào hay vận chuyển qua đường gian bào. Vì con đường xuyên bào chiếm hơn 99,9% tổng diện tích bề mặt 4 nên hầu hết các chất được hấp thu bởi con đường này. Các cơ chế hấp thu các chất vào ruột được biểu diễn ở hình 2.3. Vận chuyển thụ động xuyên bào: các chất được hấp thu bằng con đường khuếch tán thụ động theo gradient nồng độ và cho thấy động học hấp thu có tính tuyến tính. Một phân tử muốn xuyên qua màng đỉnh và màng đáy bởi sự khuếch tán thụ động (con đường C) phải có thuộc tính hóa lý thích hợp. Những hợp chất thân dầu không ion hóa nhanh chóng đư ợc hấp thu bởi vì sự tương hợp của nó với lớp lipid kép. Những chất thân nước không thể hòa tan vào màng đôi lipid nên không thể đi qua màng tế bào. Với những chất rất thân dầu, tính thấm của ruột cũng giảm vì chúng không thể hòa tan vào lớp nước cố định trên bề mặt niêm mạc ruột. Vận chuyển xuyên màng qua trung gian protein: những hợp chất thân nước không thể đi qua lớp lipid kép nhưng chúng có thể được vận chuyển qua màng nhờ các chất mang chuyên biệt hoặc nhờ các protein vận chuyển chủ động (con đường D). Con đường vận chuyển này rất quan trọng cho sự hấp thu các chất dinh dưỡng như các monosaccharid, acid amin và di-/tri-peptid, cũng như các ion, muối mật và các nhóm thuốc đặc biệt. Cả chất mang và chất vận chuyển trung gian tích cực đều có thể bị bão hòa, nên đặc trưng của loại vận chuyển này là có động học hấp thu không tuyến tính. Vận chuyển tích cực có thể vận chuyển ngược gradient nồng độ. Vận chuyển chủ động đòi hỏi cung cấp năng lượng từ quá trình thủy phân ATP hay vận chuyển đồng thời với Na+ hay H+. Vận chuyển qua gian bào: cấu trúc lớp biểu mô tạo nên các lỗ thân nước giữa những tế bào hấp thu. Vì diện tích bề mặt của các lỗ thân nước chỉ chiếm 0,1 % tổng diện tích bề mặt, thuốc vận chuyển qua con đường này rất ít (con đường A). Con đường này chỉ phù hợp cho những phân tử thân nước có kích thước nhỏ. Vận chuyển qua con đư ờng này là một quá trình khuếch tán có kiểm soát và cho thấy động học hấp thu theo tuyến tính. Nhập bào: những kẻ hở nhỏ thường không thấm với các phân tử rất lớn như peptid, protein nên chúng có thể được vận chuyển theo con đường nhập bào thông qua các 5 receptor trung gian chuyên biệt hoặc không chuyên biệt. Nhập bào ít gặp ở ruột non người trưởng thành và không phải là một cơ chế quan trọng trong hấp thu thuốc. Hệ thống bơm ngược: P-glycoprotein bài xuất ra rất nhiều các thuốc vào lòng ruột sau khi đã được hấp thu. Màng đỉnh Màng đáy Hình 2.3. Các con đường vận chuyển các chất qua màng [78] (A): Vận chuyển qua gian bào (C): Vận chuyển thụ động xuyên bào (D): Vận chuyển xuyên màng qua trung gian protein 2.1.1.3. Cơ chế vận chuyển glucose qua ruột Năm 1961, Crane là người đầu tiên xây dựng thuyết đồng vận chuyển để giải thích sự vận chuyển chủ động [28]. Giả thuyết này nhanh chóng được kiểm tra, làm rõ và hoàn thiện [65]. Năm 1987, Wright và cộng sự đã xác định được chất đồng vận chuyển Na+- glucose (SGLT1; sản phẩm của gen SLC5A1). Trong cơ thể người, 11 gen quy đ ịnh cho 11 protein vận chuyển xuyên màng đã đư ợc tìm ra [80]. Trong đó có SGLT1 nằm ở bờ bàn chải của tế bào ruột non trưởng thành và ở cả biểu mô ống thận, chịu trách nhiệm hấp thu D-glucose và D-galactose. SGLT2 nằm ở tế bào biểu mô của ống thận gần, có vai trò tái hấp thu glucose sau khi glucose được lọc qua cầu thận. Carbohydrat được hấp thu chủ yếu dưới dạng monosaccharid và một phần rất nhỏ dưới dạng disaccharid. Các monosaccharid đư ợc hấp thu theo cơ chế vận chuyển tích cực thứ phát (đồng vận chuyển với Na+) và khuếch tán được tăng cường (hay khuếch tán thuận hóa). 6 Từ lòng ruột, glucose được vận chuyển qua bờ bàn chải vào tế bào biểu mô theo cơ chế vận chuyển tích cực thứ phát được biểu diễn ở hình 2.4. Ở phía ngoài bờ bàn chải, SGLT1 có hai vị trí gắn, một với glucose và một với ion Na+. Chỉ khi cả glucose và ion Na+ đã được gắn vào thì SGLT1 mới thay đổi hình dạng để đưa cả Na+ và glucose vào bên trong tế bào. Năng lượng để vận chuyển là do sự chênh lệch nồng độ ion Na+ giữa lòng ruột và tế bào biểu mô. Có nghĩa là khi Na+ khuếch tán từ lòng ruột vào tế bào, sẽ kéo theo glucose đi cùng; như vậy quá trình đó cung cấp năng lượng đ ể vận chuyển ngược bậc thang nồng đ ộ. Cơ chế này được gọi là sự đồng vận chuyển với Na+ của glucose hoặc cơ chế vận chuyển tích cực thứ phát [2]. Sự vận chuyển glucose qua ruột bởi SGLT1 bị ức chế bởi phloridzin. Sự chênh lệch điện hóa của Na+ được tạo ra và duy trì bởi Na+-K+ ATPase (bơm Na+) và bị ức chế bởi ouabain [36]. Khi nồng độ glucose ở trong tế bào tăng cao, glucose sẽ khuếch tán qua màng đáy bên của tế bào biểu mô để vào máu theo cơ chế khuếch tán được tăng cường [2]. Glucose đã vào tế bào và tích lũy bởi SGLT1 thì được mang xuyên qua màng đáy theo chất vận chuyển glucose 2 (GLUT2; SLC2A2). Màng mạc Màng thanh Nước Hình 2.4. Mô hình tế bào của chất đồng vận chuyển Na+-glucose [40] 7 2.1.2. Các mô hình thực nghiệm nghiên cứu sự hấp thu glucose qua ruột 2.1.2.1. Mô hình in vitro Việc tạo ra một mô hình in vitro với các đ ặc tính của niêm mạc ruột thật đòi h ỏi nhiều kĩ thuật phức tạp. Một trong các hệ thống đã đư ợc phát triển đ ể ứng dụng trong nghiên cứu hấp thu glucose qua ruột là phương pháp nuôi cấy tế bào, đặc biệt là các tế bào Caco-2. Những tế bào Caco-2 được nuôi cấy trên những bình nhựa có diện tích 25 cm2. Các tế bào được nuôi trong dịch nuôi cấy chuyên biệt với huyết thanh bào thai bò ở nhiệt độ 37 0C trong 21 ngày có sục CO2 5%. Mỗi ngày dịch đều được thay mới. Vào thời điểm thử nghiệm, dịch nuôi cấy được loại bỏ; các tế bào được ủ trong 3 giờ với dịch ủ có chứa glucose ở nhiệt độ 37 0C. Dịch ủ sau đó được trích ra để đo nồng độ glucose còn lại trong mẫu. Tế bào sau thử nghiệm được xử lý để đo tổng lượng protein. Đánh giá bằng sự giảm lượng glucose trong dịch ủ (µmol) trên 1 mg protein trong 3 giờ [39]. 2.1.2.2. Mô hình in vivo Chuột sau khi cho nhịn đói 24 giờ, được cho uống dung dịch glucose 1000 mg/kg có hay không có chất ức chế. Lấy máu đuôi chuột mỗi 30 phút trong vòng 2 giờ kể từ khi uống dung dịch đường. Và đem ly tâm để đo nồng độ glucose. Đánh giá bằng cách so sánh nồng đ ộ hấp thu glucose đ ỉnh và đư ờng đ ộng học nồng đ ộ hấp thu trong máu giữa nhóm chứng và nhóm có sử dụng chất thử nghiệm để tính toán và biện luận [68], [69], [70]. 2.1.2.3. Mô hình in situ Bỏ đói thú thử nghiệm 24 giờ trước thử nghiệm. Sau khi gây mê, tiến hành mở khoang bụng thú, truyền dịch một đo ạn ruột (dịch có chứa glucose và có hoặc không có chất ức chế hấp thu). Dịch truyền được ổn định nhiệt và lưu lượng dịch bằng những thiết bị chuyên biệt [35]. Sau đó đoạn ruột được buộc hai đầu và đặt về vị trí cũ. Sau 30 phút, dịch trong lòng ruột được lấy đem đo nồng độ glucose. Đồng thời, máu tĩnh mạch đuôi cũng đư ợc lấy để đo nồng độ glucose để đảm bảo có sự hấp thu glucose qua ruột. Đánh giá thông qua sự giảm nồng độ glucose trong dịch thử nghiệm giữa nhóm chứng và nhóm có sử dụng chất ức chế hấp thu glucose [69].