Tài liệu Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dpph và xây dựng quy trình định lượng acid ganoderic a trong bào tử nấm linh chi (ganoderma lucidum spore)

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  PHAN THÀNH TRÍ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA DPPH VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID GANODERIC A TRONG BÀO TỬ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum spore) LUẬN VĂN CAO HỌC Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã ngành: 8720210 Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  PHAN THÀNH TRÍ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA DPPH VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID GANODERIC A TRONG BÀO TỬ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum spore) LUẬN VĂN CAO HỌC Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã ngành: 8720210 Thầy hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU LẠC THỦY Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Người cam đoan Phan Thành Trí . . i Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học - Khóa: 2017 -2019 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA DPPH VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID GANODERIC A TRONG BÀO TỬ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum spore ) Học viên: Phan Thành Trí Thầy hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy Mở đầu: Hiện nay bào tử nấm Linh chi được sử dụng ngày càng nhiều, với mong muốn góp phần vào việc kiểm tra chất lượng cũng như nghiên cứu thêm một số hoạt tính sinh học của cao chiết từ bào tử, đề tài tiến hành xây dựng quy trình định lượng acid ganoderic A, xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm bào tử nấm Linh chi và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao chiết từ bào tử Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng: acid ganoderic A và các cao chiết từ bào tử nấm Linh chi. Phương pháp nghiên cứu: Acid ganoderic A được định lượng bằng phương pháp HPLC với kỹ thuật rửa giải đẳng dòng. Xây dựng và đề xuất một số chỉ tiêu kiểm nghiệm bào tử nấm Linh chi dựa vào các chuyên luận trong Dược điển Việt Nam V. Khảo sát hoạt tính chống oxy với thuốc thử là DPPH các cao chiết từ bào tử. Kết quả: Quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính (5,0 – 60,0 ppm, R ≥ 0,995), độ chính xác (RSD ≤ 2,0 %), độ đúng (98,07 – 104,5 %). Xây dựng được một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cảm quan; mất khối lượng do làm khô; độ tro; định tính; định lượng acid ganoderic A. Phân đoạn cao chiết bằng aceton có khả năng chống oxy hóa mạnh nhất IC50 là 335,7 ppm. Kết luận: Xây dựng được quy trình định lượng acid ganoderic A và đề xuất được một số chỉ tiêu kiểm nghiệm bào tử nấm Linh chi. Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa với thuốc thử DPPH cho thấy phân đoạn cao chiết bằng aceton cho khả năng chống oxy hóa mạnh nhất (kém vitamin C 19,8 lần). . . Master’s Thesis – Academic course: 2017 – 2019 INVESTIGATE ANTIOXIDANT ACTIVITY DPPH AND DEVELOPING A QUANTITATIVE PROCESS OF GANODERIC A ACID IN SPORE OF GANODERMA LUCIDUM. Phan Thanh Tri Supervisor: PhD. Nguyen Huu Lac Thuy Introduction: Currently, spore of Ganoderma lucidum are being used more and more, with the desire to contribute to the quality control and study some more biological activities of spore extract, the thesis also developed a quantitative process of ganoderic A acid, develop some criteria for testing spore of Ganoderama lucidum and investigate antioxidant activity extracted from spores. Matericals and Methods: Materical: ganoderic A acid and extracts from spore of Ganoderma lucidum. Method: ganoderic A acid is quantified by HPLC with isocratic elution technique, some criteria for testing spore of Ganoderma lucidum were developed based on monographs in Vietnamese Pharmacopoeia V. The antioxidant activity of spore of Ganoderma lucidum were investigated in vitro by 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay. Results: The method was validated in terms of system suitability, selectivity, linearity (5.0 – 60.0 ppm, R ≥ 0.995), precision (RSD ≤ 2,0 %), and accuracy (recovery: 98.07 – 104.5 %). some criteria for testing spore of Ganoderma lucidum were developed: description, loss on drying, total ash, determination, assay of ganoderic A acid. Acetone extract showed the highest antioxidant activity (IC50 = 335.7 ppm) Conclusion: The quantitative process of ganoderic A acid and some criteria for testing spore of Ganoderma lucidum were developed. The results of investigation of antioxidant activity showed that acetone extract has highest activity (below than Vitamin C 19.8 times) . . MỤC LỤC MỤC LỤC ..................................................................................................................v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ ..............................................................x ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI .............................................................................. 3 1.2. TỔNG QUAN VỀ BÀO TỬ NẤM LINH CHI .............................................................. 6 1.3. TỔNG QUAN VỀ ACID GANODERIC A ................................................................. 12 1.4. TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA ................................................ 15 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................18 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 18 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 20 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................29 3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GAA TRONG BTNLC – DỰ THẢO QUY TRÌNH ................................................................................................. 29 . i. 3.2. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG GAA TRONG MỘT SỐ MẪU BTNLC ...................... 43 3.3. XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM BTNLC ..................................... 45 3.4. DỰ THẢO TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM BTNLC ................................................. 47 3.5. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA VỚI THUỐC THỬ DPPH CỦA CAO CHIẾT TỪ BTNLC ............................................................................................................. 50 3.6. BÀN LUẬN .................................................................................................................. 59 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................62 4.1. KẾT LUẬN................................................................................................................... 62 4.2. ĐỀ NGHỊ ...................................................................................................................... 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................64 PHỤ LỤC . . i Luận văn Thạc sĩ Dược học Danh mục chữ viết tắt DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu và chữ viết tắt Từ nguyên Tiếng Việt ACN Acetonitril Acetonitrile BTNLC Bào tử nấm Linh chi DC Dịch chiết DM Dung môi DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl GAA Ganoderic acid A HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography IC50 Nồng độ ức chế 50% N Số đĩa lý thuyết PDA Photodiode array PĐ Dãy điod quang Phân đoạn Rt Retention time Thời gian lưu Diện tích pic S SEM Scanning electron microscope Kính hiển vi điện tử quét SKĐ Sắc ký đồ TP Toàn phần Ultraviolet – Visible UV-Vis Quang phổ tử ngoại – khả kiến . ii . Luận văn Thạc sĩ Dược học Danh mục các bảng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tác dụng, điều trị của một số hoạt chất trong nấm Linh chi.......................5 Bảng 1.2. Hàm lượng % hoạt chất chính trong thể quả và bào tử Linh chi. ..............7 Bảng 1.3. Các nghiên cứu phân lập polysaccharid từ bào tử .....................................9 Bảng 2.4. Pha dãy dung dịch chuẩn khảo sát khoảng tuyến tính .............................24 Bảng 2.5. Dãy dung dịch thử để xác định IC50 của cao BTNLC..............................28 Bảng 3.6. So sánh lượng GAA chiết được từ các mẫu bào tử ..................................31 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát dung môi chiết GAA ....................................................32 Bảng 3.8. So sánh GAA chiết được của phương pháp siêu âm và đun hồi lưu .......33 Bảng 3.9. So sánh GAA chiết được trong những khoảng thời gian khác nhau ........33 Bảng 3.10. Các thông số sắc ký trong các điều kiện pH khác nhau .........................34 Bảng 3.11. Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống ...........................................38 Bảng 3.12. Kết quả khoảng tuyến tính .....................................................................41 Bảng 3.13. Kết quả độ chính xác và chính xác trung gian .......................................42 Bảng 3.14. Kết quả độ đúng ....................................................................................43 Bảng 3.15. Kết quả định lượng GAA trong một số mẫu BTNLC ............................43 Bảng 3.16. Kết quả chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô ..........................................45 Bảng 3.17. Kết quả chỉ tiêu tro toàn phần ................................................................45 Bảng 3.18. Kết quả chỉ tiêu chất chiết được trong dược liệu ...................................46 Bảng 3.19. Kết quả định lượng GAA của 3 lô khác nhau ........................................47 Bảng 3.20. Hiệu suất chiết cao toàn phần, cao phân đoạn từ bào tử Linh chi .........51 Bảng 3.21. Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch DPPH ................................51 Bảng 3.22. Kết quả xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 của vitamin C .........52 Bảng 3.23. Kết quả xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 của cao TP cồn 96 % .. 53 Bảng 3.24. Kết quả xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 của cao TP methanol. . 54 . x. Luận văn Thạc sĩ Dược học Danh mục các bảng Bảng 3.25. Kết quả xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 của cao PĐ n-hexan .... 55 Bảng 3.26. Kết quả đường tuyến tính xác định IC50 của cao PĐ cloroform ............55 Bảng 3.27. Kết quả đường tuyến tính xác định IC50 của cao PĐ aceton ..................56 Bảng 3.28. Kết quả xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 của cao PĐ methanol .. 57 Bảng 3.29. So sánh IC50 vitamin C và các loại cao ..................................................58 . x. Luận văn Thạc sĩ Dược học Danh mục các hình vẽ, sơ đồ DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1. Nấm Linh chi 40 ngày tuổi .........................................................................4 Hình 1.2. Nấm Linh chi trưởng thành (có lớp bào tử) ...............................................4 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của lanosterol .................................................................4 Hình 1.4. Bào tử sản sinh vào cuối giai đoạn tăng trưởng của nấm Linh chi ...........6 Hình 1.5. Bào tử nấm Linh chi ...................................................................................6 Hình 1.6. Các triterpenoid có tính oxy hóa cao trong bào tử .....................................8 Hình 1.7. Triterpenoid được phân lập từ dịch chiết ether ..........................................8 Hình 1.8. Cấu trúc của acid ganoderic A .................................................................13 Hình 2.9. Bào tử nấm Linh chi thu thập từ thể quả ..................................................18 Hình 3.10. BTNLC sau khi được thu thập và kiểm tra tính đúng nguyên liệu ........29 Hình 3.11. Kết quả kháo sát điều kiện phá vỡ bằng SEM .......................................30 Hình 3.12. So sánh SKĐ SKLM các mẫu BTNLC ..................................................31 Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu chuẩn GAA với pha động là ACN - H3PO4 pH 3,5 .......34 Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu chuẩn GAA với pha động là ACN - H3PO4 pH 4,0 .......34 Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu chuẩn GAA với pha động là ACN - H3PO4 pH 5,0 .......34 Hình 3.16. Sắc ký đồ mẫu thử với pha động là ACN - H3PO4 pH 3,5 (35 : 65) ......35 Hình 3.17. Sắc ký đồ mẫu thử với pha động là ACN - H3PO4 pH 3,5 (40 : 60) .....35 Hình 3.18. Sắc ký đồ mẫu thử với cột Inerstil C8 (250 x 4,6 mm; 5 µm) ...............36 Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu thử với cột Ultra BiPh (250 x 4,6 mm; 5 µm) ...............36 Hình 3.20. Sắc ký đồ mẫu thử với cột ZORBAX Eclipse XDD C18........................36 Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu trắng (methanol).............................................................39 Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu chuẩn ..............................................................................39 Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu thử ..................................................................................39 Hình 3.24. Sắc ký mẫu thử thêm chuẩn ...................................................................40 Hình 3.25. Phổ UV của pic GAA trong mẫu chuẩn và mẫu thử ..............................40 . i. Luận văn Thạc sĩ Dược học Danh mục các hình vẽ, sơ đồ Hình 3.26. Đường biểu diễn diện tích pic theo nồng độ GAA .................................41 Hình 3.27. Sắc ký đồ mẫu BTNLC A ......................................................................44 Hình 3.28. Sắc ký đồ mẫu BTNLC B.......................................................................44 Hình 3.29. Sắc ký đồ mẫu BTNLC mẫu thẩm định .................................................44 Hình 3.30. (a): nguyên liệu bào tử; (b): bào tử chụp dưới kính hiển vi ...................45 Hình 3.31. (c): dung dịch đối chiếu GAA; (1): thử 1; (2): thử 2; (3): thử 3 ............46 Hình 3.32 Phổ UV-Vis của dung dịch DPPH ..........................................................51 Hình 3.33. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và phần trăm khả năng chống oxy hóa của vitamin C. ...........................................................52 Hình 3.34. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và phần trăm khả năng chống oxy hóa của cao TP cồn 96 % BTNLC ..................................53 Hình 3.35. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và phần trăm khả năng chống oxy hóa của cao toàn phần methanol BTNLC .......................54 Hình 3.36. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và phần trăm khả năng chống oxy hóa của cao phân đoạn aceton. ........................................56 Hình 3.37. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và phần trăm khả năng chống oxy hóa của cao phân đoạn methanol. ....................................57 Hình 3.38. So sánh IC50 giữa các cao BTNLC .........................................................58 . . i Luận văn Thạc sĩ Dược học Lời cảm ơn LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin được nói lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình em thực hiện luận văn. Em xin cảm ơn rất nhiều đến Thầy ThS.Trương Văn Đạt, Cô PGS.TS. Trần Phi Hoàng Yến và các quý Thầy, Cô, Anh Chị kỹ thuật viên trong bộ môn Phân tích – Kiểm nghiệm đã giúp đỡ, hỗ trợ em rất nhiều. Cảm ơn sự giúp đỡ chân thành, nhiệt tình quý giá của các em Võ Linh Tử, Trần Hoàng Khánh Linh, Trần Thị Bích Phương, Lê Phương Thảo, Nguyễn Thanh Thảo, bạn Đoàn Xuân Tuyền, chị Lưu Lệ Khanh, Nguyễn Hoàng Duy trong suốt thời gian vừa qua. Em cũng xin được cảm ơn chân thành đến Ban giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm Bình Dương, các anh chị em đồng nghiệp luôn hổ trợ, tạo mọi điều kiện thuận giúp đỡ em trong suốt thời gian em thực hiện luận văn. Em xin chân thành cảm ơn. Phan Thành Trí . . Luận văn Thạc sĩ Dược học Đặt vấn đề ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum Ganodermataceae) là vị thuốc quý được sử dụng phổ biến từ lâu trên khắp thế giới. Các sản phẩm từ nấm Linh chi được sử dụng để hỗ trợ điều trị hạ đường huyết, tăng cường miễn dịch, bảo vệ gan, hen suyễn, tiểu đường, cao huyết áp và đặc biệt trong hỗ trợ điều trị ung thư, … [30]. Trước đây, bộ phận sử dụng chủ yếu của nấm Linh chi là thể quả, nhưng trong vài năm trở lại đây, bào tử nấm Linh chi (Ganoderam lucidum spore) đã bắt đầu được quan tâm. Trên thế giới, đã có một số công trình nghiên cứu cho thấy hàm lượng các chất đặc trưng cho tác dụng dược lý trong bào tử cao hơn so với thể quả [18], [29]. Trong thành phần hóa học của bào tử nấm Linh chi, nhóm triterpen có vai trò quan trọng tạo nên các tác dụng dược lý kể trên cũng như tác dụng bảo vệ tế bào gan, hạ đường huyết, chống tăng huyết áp, kháng histamin và chống nhiễm trùng [5], trong đó acid ganoderic A (GAA) là chất điển hình trong nhóm. Chuyên luận thể quả nấm Linh chi trong USP 41 sử dụng GAA làm dung dịch chuẩn để định tính và chỉ tiêu định lượng hàm lượng triterpenoid cũng được đánh giá dựa trên GAA [38]. Do đó, GAA có thể được xem như một chất đánh dấu để đánh giá chất lượng loại nấm này. Những phương pháp định lượng GAA đã được công bố thì đa phần là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với kỹ thuật rửa giải gradient, thời gian phân tích thường kéo dài. Hiện nay, chưa có tài liệu nào quy định tiêu chuẩn chất lượng cũng như là phương pháp kiểm tra đánh giá chất lượng đối với bào tử nấm Linh chi. Vì vậy, việc xây dựng quy trình định lượng hoạt chất, cụ thể là GAA và tiêu chuẩn hóa bào tử nấm Linh chi là cần thiết. Bên cạnh đó, kết quả từ những nghiên cứu về thử nghiệm hoạt sinh học là cơ sở giúp cho việc định hướng sử dụng và sản xuất bào chế các sản phẩm từ bào tử nấm Linh chi được hiệu quả hơn. . . Luận văn Thạc sĩ Dược học Đặt vấn đề Do đó, với mong muốn góp phần vào công tác kiểm tra đánh giá chất lượng và cung cấp thêm những bằng chứng khoa học về hoạt tính sinh học của bào tử, chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa DPPH và xây dựng quy trình định lượng acid ganoderic A trong bào tử nấm Linh chi” với các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Xây dựng quy trình định lượng acid ganoderic A từ bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp HPLC. 2. Tiêu chuẩn hóa bào tử nấm Linh chi. 3. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa với thuốc thử DPPH của cao chiết từ bào tử nấm Linh chi. . . Luận văn Thạc sĩ Dược học Tổng quan tài liệu CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI Hiện nay, nấm Linh chi là dược liệu được ưa chuộng, phổ biến ở châu Á và đang có xu hướng phát triển ra khắp thế giới Tên khoa học, phân loại Tên khoa học: Ganoderma lucidum (Leyss ex.Fr) Karst, Ganodermataceae. Tên gọi khác: linh chi thảo, thuốc trường thọ, nấm lim, vạn niên nhung. Tên tiếng Anh: Lingzhi hoặc Reishi. Vị trí phân loại trong giới thực vật: Giới Fungi Ngành Basidiomycota Phân ngành Agaricomycotina Lớp Agaricomycetes Bộ Polyporales Họ Ganodermataceae Chi Loài Ganoderma Ganoderma lucidum Chu trình phát triển Linh chi là một loại nấm hóa gỗ sống một năm hay nhiều năm. Nấm Linh chi (thể quả) gồm phần cuống và mũ nấm. Chu trình phát triển của nấm Linh chi qua từng giai đoạn được tóm tắt ở Sơ đồ 1.1 . Đảm Thể quả Thể quả Phối nhân trong đảm Sợi nấm đa nhân Đảm và bào tử Sợi nấm đơn nhân Sơ đồ 1.1. Quá trình phát triển của nấm Linh chi . . Luận văn Thạc sĩ Dược học Hình 1.1. Nấm Linh chi 40 ngày tuổi Tổng quan tài liệu Hình 1.2. Nấm Linh chi trưởng thành (có lớp bào tử) Thành phần hóa học Nước chiếm tới 90% trọng lượng nấm Linh chi tươi. Trong nấm Linh chi khô, protein và chất xơ là hai thành phần chính với tỉ lệ lần lượt là 10 – 40% và 3 – 32%, ngoài ra còn có carbohydrat, chất béo,.. Polysaccharid, peptidoglycan và triterpen là ba thành phần có tác dụng chính trong trong nấm Linh chi. Tuy nhiên, hàm lượng ba nhóm chất này thay đổi đáng kể theo mùa, vùng trồng và cách trồng [16]. 1.1.3.1. Triterpen Đây là thành phần tạo nên vị đắng đặc biệt cho Linh chi và giúp đánh giá sơ bộ chất lượng nấm [37]. Ở Ganoderma lucidum, cấu trúc hóa học của triterpen dựa trên lanostan, một chất chuyển hóa của lanosterol. Năm 1982, Kubota và cộng sự đã phân lập các triterpen đầu tiên là acid ganoderic A và B. Kể từ đó, hơn 130 triterpen đã được phân lập, chia thành 4 nhóm: acid ganoderic, ganoderiol, acid ganolucidic và acid lucidenic. Trong đó hơn 50 triterpen là chất mới và duy nhất ở nấm Linh chi [16]. Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của lanosterol . . Luận văn Thạc sĩ Dược học Tổng quan tài liệu 1.1.3.2. Polysaccharid và peptidoglican Polysaccarid chiếm 10 – 50% trọng lượng thể quả khô. Có hơn 200 polysaccharid đã được phân lập từ thể quả, bào tử, sợi nấm và từ môi trường nuôi cấy [28]. Các peptidoglycan với hoạt tính sinh học khác nhau cũng đã được phân lập từ G. lucidum, bao gồm proteoglycan với hoạt tính chống virus, chất điều hòa miễn dịch GLIS, glycopeptide PGY phân tách và tinh chế từ dịch chiết thể quả [28]. 1.1.3.3. Các hợp chất khác G.lucidum chứa nhiều nguyên tố vi lượng như silic, kali, calci, magnesi, mangan và strontium. Các enzym như metallicoprotease; các nucleosid, nucleotid (adenosin, guanosin) cũng được phân lập [16]. Hàm lượng protein trong nấm Linh chi khô khoảng 7 – 8 (%), thấp hơn so với nhiều loại nấm khác. Các phân tử protein có tác dụng dược lý đã được chứng minh gồm LZ-8, một loại protein ức chế miễn dịch được tinh chế từ sợi nấm; peptide (GLP) thể hiện các hoạt động chống oxy hóa bảo vệ gan và ganodermin có tác dụng chống nấm được phân lập từ thể quả [16]. Tác dụng dược lý Tác dụng sinh học của nấm Linh chi theo thành phần hoạt chất được thể hiện trong Bảng 1.1. Bảng 1.1 Tác dụng, điều trị của một số hoạt chất trong nấm Linh chi [27]. Hoạt chất Tác dụng dược lý Chống kết tập tiểu cầu, độc tế bào, bảo vệ tế bào gan, giảm Triterpen cholesterol và triglycerid, kháng virus và cải thiện trí nhớ. Cải thiện miễn dịch, kháng ung thư, chống oxy hóa và giảm Polysaccharid đường huyết Protein LZ-8 và Điều hòa miễn dịch, kháng ung thư sterol Chống kết tập tiểu cầu Adenosin . . Luận văn Thạc sĩ Dược học Tổng quan tài liệu 1.2. TỔNG QUAN VỀ BÀO TỬ NẤM LINH CHI Lớp bào tử được sản sinh vào cuối giai đoạn tăng trưởng của nấm Linh chi. Bào tử đóng vai trò là cơ quan sinh sản, gặp điều kiện thích hợp thì nảy mầm, phát triển thành sợi nấm, các sợi nấm phân chia và phát triển thành thể quả. Hình 1.4. Bào tử sản sinh vào cuối giai đoạn tăng trưởng của nấm Linh chi [31] Đặc điểm hình thái cấu trúc BTNLC có dạng bột mịn, màu nâu, mùi đặc trưng. Quan sát dưới kính hiển vi, bào tử có hình trứng, thuôn ở đỉnh, chiều rộng từ 6,5 – 8,0 (µm), chiều dài từ 9,6 – 12,6 (µm), lỗ nẩy mầm có hình gai nhọn. Vỏ bào tử kiểu kép, vỏ ngoài màu vàng nhạt dày 0,8 – 1,1 (µm), vỏ trong dày màu vàng nâu dày 1,1 – 1,4 (µm) . Quan sát dưới kính hiển vi ta thấy được lỗ thủng trên bề mặt lớp vỏ ngoài và mấu lồi nhỏ ở đầu đối diện với lỗ nảy mầm – tức là ở đáy bào tử [34]. (a) (b) (c) (d) Hình 1.5. Bào tử nấm Linh chi [34] (a) Quan sát kính hiển vi (b) Bề mặt (b) Mặt cắt dọc (c) Lớp thành kép Thành phần chính của vỏ bào tử là hỗn hợp β-1,3, β-1,6-glucan và α-glucan dưới dạng các amylopectin, amylose, amylodextrin và glycogen. Theo Oliviera và Zangan, các . . Luận văn Thạc sĩ Dược học Tổng quan tài liệu glucan liên kết với nhau, liên kết với chitin tạo nên lớp vỏ bền và không thấm giúp bảo vệ thành phần bên trong bào tử [31]. Thành phần hóa học Mặc dù thể quả của nấm Linh chi được sử dụng rộng rãi, BTNLC chỉ được nhận ra và sử dụng từ thế kỷ XX nhờ những kết quả trong các nghiên cứu về phương pháp phá vỡ bào tử. Bào tử nấm có thành phần các chất tương tự như ở thể nấm trưởng thành, tuy nhiên hàm lượng các thành phần này trong bào tử cao hơn rất nhiều. Do đó, tác dụng sinh học của bào tử có thể cao hơn cả thể quả khi vỏ bào tử được phá vỡ [24]. Hàm lượng nhóm hoạt chất chính có trong thể quả, bào tử nguyên vẹn và bào tử đã được phá vỡ được trình bày trong Bảng 1.2 Bảng 1.2. Hàm lượng % hoạt chất chính trong thể quả và bào tử Linh chi [18]. Nhóm chính Thể quả Bào tử Bào tử được phá vỡ % Triterpenoid 0,44 – 1,42 0,09 – 0,12 1,89 – 3,15 % Polysaccharid 0,25 – 1,42 0,41 – 0,91 1,03 – 2,25 1,82 – 3,67 0,78 – 0,90 0,96 – 1,04 % Protein 1.2.2.1. Triterpen Đã có 29 triterpenoid được phân lập và xác định cấu trúc từ bào tử, trong đó acid ganoderic A, acid ganoderic B, acid ganoderic C1, acid ganoderic E và ganodermanontriol được phân lập từ dịch chiết ether [25]. Các triterpen có tính chống oxy hóa cao là acid ganoderic γ, acid ganoderic δ, acid ganoderic ε, acid ganoderic ξ, acid ganoderic θ, acid ganoderic η cùng với acid ganolucidic D và acid ganoderic C2 cũng được phân lập từ bào tử Linh chi [25]. Triterpenoid thường lẫn với các acid béo trong bào tử, cả hai đều là thành phần kém phân cực do đó việc phân lập triterpenoid gặp nhiều khó khăn hơn các thành phần hóa học khác [25]. Các dung môi dùng để chiết xuất triterpen gồm: methanol, ethanol, aceton, cloroform, ether hoặc các hỗn hợp dung môi [16]. .