Tài liệu Khảo sát hàm lượng estrogen và progesrerone trong phân của cầy vòi hương (paradoxurus hermaphroditus pallas, 1777) trong điều kiện nuôi nhốt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG ESTROGEN VÀ PROGESTERONE TRONG PHÂN CỦA CẦY VÒI HƯƠNG (Paradoxurus hermaphroditus Pallas, 1777) TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI NHỐT Mã số: Chủ nhiệm đề tài: Ths. Nguyễn Thị Thu Hiền Bình Dương, 12/2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG ESTROGEN VÀ PROGESTERONE TRONG PHÂN CỦA CẦY VÒI HƯƠNG (Paradoxurus hermaphroditus Pallas, 1777) TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI NHỐT Xác nhận của đơn vị chủ trì đề tài (chữ ký, họ và tên) Bình Dương, 12/2018 Chủ nhiệm đề tài (chữ ký, họ và tên) i MỤC LỤC MỤC LỤC .............................................................................................................................. i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................iii MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................................. 4 1.1. Nghiên cứu ngoài nƣớc ........................................................................................................... 4 1.1.1. Nghiên cứu về cầy vòi hƣơng ......................................................................................................... 4 1.1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu xác định chu kì động dục ............................................................ 6 1.1.3. Xác định con đƣờng bài tiết hormone steroid................................................................................. 7 1.1.4. Ly trích steroid ............................................................................................................................... 8 1.2. Nghiên cứu trong nƣớc ......................................................................................................... 10 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 15 2.1. Vật liệu.................................................................................................................................. 15 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................................... 16 2.2.1. Thu mẫu và chiết xuất phân.......................................................................................................... 16 2.2.2. Xét nghiệm hormone .................................................................................................................... 17 2.2.3. Phân tích dữ liệu ........................................................................................................................... 18 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 19 3.1. Kết quả .................................................................................................................................. 19 3.1.1. Sự thay đổi hàm lƣợng Estradiol và Progesterone trong phân cầy vòi hƣơng không mang thai ... 19 3.1.2. Sự thay đổi hàm lƣợng Estradiol và Progesterone trong phân cầy vòi hƣơng mang thai .............. 25 3.1.3. Sự thay đổi hàm lƣợng Estradiol và Progesterone trong phân cầy vòi hƣơng mang thai giả ........ 27 3.2. Thảo luận .............................................................................................................................. 28 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ...................................................................................... 34 ii Kết luận ................................................................................................................................ 34 Khuyến nghị ......................................................................................................................... 34 LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 36 iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CP: Corpus leteum CTAB: Cetyltrimethyl ammonium bromide ECG: Equine chorionic Gonadotropin ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay E2: Estradiol FSH: Follicle-Stimulating Hormone GnRH: Gonadotropin-Releasing Hormone HCG: Human chorionic Gonadotropin LH: Luteinizing Hormone PMSG: Pregnant Mare's Serum Gonadotropin P4: Progesterone iv DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH Bảng 1. 1. Dữ liệu của 12 cá thể cầy đƣợc thu mẫu trong nghiên cứu ............................... 15 Bảng 2. 1. Phạm vi, đỉnh và chu kỳ của P4 và E2 trong thời kỳ không mang thai ở cầy vòi hƣơng ................................................................................................................................... 19 Bảng 2. 2. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng sau thụ tinh ......................... 26 Hình 2. 1. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng không mang thai (F1) ......... 21 Hình 2. 2. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng không mang thai (F3) ......... 21 Hình 2. 3. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng không mang thai (F5) ......... 22 Hình 2. 4. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng không mang thai (F6) ......... 22 Hình 2. 5. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng không mang thai (F8) ......... 23 Hình 2. 6. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng không mang thai (F11) ....... 23 Hình 2. 7. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng mang thai (F2, mang thai vào 6/2017) ................................................................................................................................. 24 Hình 2. 8. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng mang thai (F4, mang thai vào 4/2017) ................................................................................................................................. 24 Hình 2. 9. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng mang thai (F7, mang thai 2 lần vào 4/2017 và 1/2018) ......................................................................................................... 25 Hình 2. 10. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng mang thai (F9, mang thai vào 2/2017) ................................................................................................................................. 25 Hình 2. 11. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng mang thai giả (presumed pseudopregnancy – F10) ...................................................................................................... 27 Hình 2 12. Sự thay đổi hàm lƣợng P4 và E2 ở cầy vòi hƣơng mang thai giả (presumed pseudopregnancy – F12) ...................................................................................................... 28 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Sự nỗ lực trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (thụ tinh nhân tạo, thụ tinh trong ống nghiệm hoặc chuyển phôi) phụ thuộc vào kiến thức về sinh lý sinh sản của một loài nhất định (Schwarzenberger et al., 1996). Đặc biệt, trong thụ tinh nhân tạo, thời gian chính xác của việc thụ tinh là yếu tố giới hạn chính, sẽ dễ dàng hơn nếu chu kì động dục có thể đƣợc xác định. Phân tích hormone steroid của tuyến sinh dục là một yếu tố quan trọng đánh giá tình trạng sinh lí sinh sản của vật nuôi. Kích dục tố trong huyết thanh là sự phản ánh chính xác nhất của hoạt động sinh dục, tuy nhiên các kỹ thuật để thu thập thông tin này qua huyết thanh có thể ảnh hƣởng đến phúc lợi động vật (animal welfare) và khá tốn kém. Lấy mẫu máu lặp lại nhiều lần gây stress, ảnh hƣởng đến vấn đề sức khỏe của động vật và khó khăn để thực hiện trong thực tế, nhất là động vật hoang dã. Thậm chí việc lấy mẫu máu lặp lại để đo các steroid có thể không thực hiện đƣợc ở các loài động vật có kích thƣớc nhỏ, lấy mẫu gây can thiệp thậm chí dẫn đến các con vật bị giết chết (Kumar et al., 2013). Phƣơng pháp không xâm lấn (non-invasive) dễ thực hiện và cho kết quả chính xác là lựa chọn thay thế tốt hơn. Mặc dù có thể thu thập mẫu nƣớc tiểu và mẫu phân để đánh giá tình trạng sinh sản ở động vật, nhƣng khó khăn trong việc thu thập nƣớc tiểu đối với các động vật thả rông đã hạn chế việc sử dụng chúng trong việc điều tra. Vì vậy, mẫu phân là sự lựa chọn thực tế nhất cho mục đích này. Phƣơng pháp đo hàm lƣợng các chất chuyển hóa steroid trong phân để đánh giá trạng thái nội tiết của động vật đã đƣợc đi tiên phong vào cuối những năm 1970 ở chim, đầu những năm 1980 ở động vật có vú và đã đƣợc nghiên cứu trong các thập kỷ qua với số lƣợng ngày càng tăng ở nhiều loài (Palme, 2005). Vấn đề thông tin không rõ ràng về tình trạng sinh sản của động vật cái đã đƣợc giải quyết nhờ phƣơng pháp phân tích hormone steroid phân để đánh giá các hoạt động nội tiết (Kumar et al., 2013). Đánh giá estrogen trong phân đã đƣợc sử dụng nhƣ chỉ số đáng tin cậy ở con vật mang thai ở một số động vật móng guốc (Amer et al., 2007 ; Macchi et al., 2010; Ncube et al., 2 2011; Monica và et al., 2014) và một số loài linh trƣởng (Shideler et al., 1993a, Shideler et al., 1993b, Heistermann et al., 1993; Ziegler et al., 1996; Maheshwari, 2010). Chúng cũng đƣợc sử dụng để xác định khoảng thời gian trƣớc khi rụng trứng ở động vật ăn thịt (Putranto et al., 2006; 2011). Phân tích chất chuyển hóa progesterone trong phân đã đƣợc sử dụng thành công để theo dõi chức năng thể vàng và mang thai, hƣ thai, tính chu kì động dục và các liệu pháp điều trị trong một danh sách mở rộng của nhiều loài. Ở các loài động vật hoang dã với cấu trúc dân số hạn chế của chúng, xác định hormone sinh dục không xâm lấn sẽ là một phƣơng pháp hữu dụng đối với các nhà khoa học trong đánh giá sự thay đổi nội tiết sinh dục, xác định chu kì buồng trứng đồng thời tìm hiểu và giám sát động thái sinh dục của chúng để cải thiện khả năng sinh sản trong điều kiện nuôi. Ở Việt Nam, nhiều trang trại nuôi cầy vòi hƣơng đã đƣợc phát triển thành công. Nuôi cầy hƣơng không chỉ mang lại lợi ích kinh tế cho nông dân mà còn giúp giảm bớt săn bắt cầy vòi hƣơng (Đặng Huy Huỳnh et al., 2010). Kết quả của việc sử dụng gonadotropin trong sinh sản cầy vòi hƣơng trong điều kiện nuôi đã mang lại kết quả khả quan (Nguyễn Thanh Bình, 2015) và góp phần bảo tồn đa dạng sinh học. Tuy nhiên, việc thiếu thông tin về sự thay đổi hormone sinh dục của cầy vòi hƣơng cái dẫn đến những khó khăn trong kiểm tra tình trạng sinh sản của chúng trong điều kiện nuôi, cũng nhƣ tra khảo tài liệu trong nghiên cứu. Do đó, dữ liệu về hormone sinh dục sẽ là cơ sở để đánh giá tình trạng sinh sản và góp phần vào công nghệ hỗ trợ sinh sản trên cầy vòi hƣơng. Vì vậy, đề tài “Khảo sát hàm lƣợng Estrogen và Progesrerone trong phân của cầy vòi hƣơng (Paradoxurus hermaphroditus Pallas, 1777) trong điều kiện nuôi nhốt” đƣợc thực hiện. 2. Mụ ti u đề tài - Xác định sự thay đổi của hàm lƣợng strogen và Progesterone trong phân cầy vòi hƣơng trong điều kiện nuôi nhốt. 3. Đối tƣợng ph m vi á h tiếp ận nghi n ứu n n n Nội tiết sinh dục: stradiol ( 2), Progesterone (P4) trong phân của Cầy vòi hƣơng cái trong điều kiện nuôi nhốt. 3.2. m n n 3 - Cầy vòi hƣơng nuôi tại trang trại ở xã Xuân Đƣờng, huyện C m Mỹ, tỉnh Đồng Nai và cơ sở nuôi tại phƣờng Phú Tân, thành phố Thủ ầu Một, tỉnh ình ƣơng. - Thời gian t 01 2017-12/2018. p nn n -Tiếp cận l thuyết: Nghiên cứu các tài liệu có liên quan đến cầy vòi hƣơng (Paradoxurus hermaphroditus) và xác định hormone sinh dục. -Tiếp cận thực tế: Nghiên cứu trực tiếp trên khách thể cầy vòi hƣơng tại cơ sở chăn nuôi. ố ụ đề tài Mở đầu: 3 trang Chƣơng 1 – Tổng quan tài liệu: 12 trang Chƣơng 2 – Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu: 4 trang Chƣơng 3 – Kết quả và thảo luận: 15 trang Kết luận và khuyến nghị: 1 trang Tài liệu tham khảo 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Nghiên cứu ngoài nƣớc 1.1.1. Nghiên c u về cầy ò ơn Các đề tài nghiên cứu về Cầy vòi hƣơng trên thế giới chủ yếu công bố các đặc điểm sinh học của loài này trong điều kiện tự nhiên. Cầy vòi hƣơng (Paradoxurus hermaphroditus) đã đƣợc nghiên cứu ở Vƣờn Quốc gia Chitwan Royal- Nepal, để xác định hoạt động hàng ngày và biến đổi dinh dƣỡng theo mùa liên quan đến thực ph m đến sẵn có. Năm cá thể trƣởng thành (hai cái và ba đực) đƣợc bắt và gắn với chip để theo dõi. Mỗi con thú đã đƣợc theo dõi trong 12 tháng liên tiếp cả đêm lẫn ngày. Kết quả nghiên cứu cho thấy loài thú này hoạt động tích cực hơn vào những đêm tối nhiều hơn ban ngày, vào đêm trăng sáng và thƣờng nghỉ ngơi trong ngày trên những ngọn cây an toàn. Hạt của các loại trái cây đã đƣợc tìm thấy trong 84,5% của 193 dạ dày của cầy vòi hƣơng đã đƣợc thu thập. Vào tháng tƣ, khi quả chín là không có sẵn, một sự thay đổi trong chế độ ăn uống t trái cây sang động vật có xƣơng sống và không xƣơng sống xảy ra. Cầy vòi hƣơng cũng đƣợc cho là ăn mật hoa của Gạo và nhựa t thân của Vallaris solanacea. Ăn thịt và hoạt động chủ yếu về đêm cho thấy cầy vòi hƣơng hƣơng rất dễ bị ăn thịt bởi động vật ăn thịt lớn (Joshi et al., 1995). Cầy vòi hƣơng có khả năng ăn hạt cà phê tuy nhiên không thể tiêu hóa đƣợc hoàn toàn quả cà phê ăn vào, nó chỉ tiêu hóa đƣợc phần thịt quả cà phê, rồi thải ra ngoài phần hạt cứng không tiêu hóa đƣợc. Những hạt này có hƣơng rất khác biệt và hiếm có (Joshi et al., 1995) nên đƣợc chế biến thành một loại cà phê cao cấp và đƣợc gọi là cà phê chồn. Ngoài tác giả Joshi (1995), một báo cáo của viện nghiên cứu ở Triều Tiên vào năm 1997 về thói quen ăn uống của cầy vòi hƣơng đã liệt kê ra hàng loạt các loại thức ăn mà loài này hay ăn bao gồm: nhóm động vật hữu nhũ nhỏ, các loài thuộc họ chim, bò sát, lƣỡng cƣ, cá, giáp sát, côn trùng, trùn đất lớp chân bụng, nhện, và hoa quả. Trong đó, 4 nhóm thức ăn chính của cầy vòi hƣơng là côn trùng, trùn đất, hoa quả, và loài hữu nhũ (Joshi et al., 1995; Chuang-An and Lee, 1997). 5 Cầy vòi hƣơng châu Á đƣợc cho là có một lối sống đơn độc, tr một thời gian ngắn vào mùa giao phối. Chúng sống trên cạn và sống trên cây, cho thấy các hoạt động về đêm ở đỉnh giữa buổi tối muộn đến sau nửa đêm (Grassman, 1998). Cầy vòi hƣơng đánh dấu mùi hành vi và phản ứng khứu giác khác nhau nhƣ chất tiết của tuyến đáy chậu, nƣớc tiểu và phân khác nhau ở cầy đực và cầy cái. Hành vi đánh dấu bằng cách kéo các tuyến đáy chậu và để lại sự tiết trên bề mặt là phổ biến nhất đƣợc quan sát ở cả hai giới. Các phản ứng khứu giác thay đổi theo thời gian và phụ thuộc cả vào loại quan hệ tình dục và bài tiết. Các cầy vòi hƣơng có thể phân biệt giữa các cá thể, giới tính, và quen thuộc hay không quen thuộc bằng mùi của tuyến giáp tiết đáy chậu (Rozhnov, 2003). Về thực trạng của loài trong tự nhiên, nhiều công bố cho thấy cầy vòi hƣơng bị săn bắt và giảm số lƣợng đáng kể. Theo Esselstyn et al. (2004); Comm. (2006); Su Su (2005) có đủ bằng chứng để chỉ ra rằng trên phạm vi rộng lớn loài này thƣờng là một trong những loài phổ biến nhất đã bị săn bắt ở Phillipines, Myanmar, Việt Nam, Lào… Các khuynh hƣớng phổ biến cho các cuộc điều tra dùng camera bẫy và chú ý đến các khối môi trƣờng sống xâm lấn tối thiểu, với trọng tâm là r ng thƣờng xanh, chắc chắn đã giảm nhiều số lƣợng gần đây của loài này ở khu vực Đông Nam Á. Iseborn (2012) đã xác định độ phong phú của cầy vòi hƣơng ở khu bảo tồn động vật hoang dã Phnom Samkos và Khu bảo tồn Veun Sai-Siem Pang, Campuchia và công bố chắc chắn gặp phải P. hermaphroditus ở cả hai nơi, nhƣng mật độ thấp. Phân tích tính đa dạng di truyền của họ cầy (Viverridae), phát sinh loài bộ ăn thịt (Carnivora) lần đầu tiên đƣợc khám phá bởi Yu & Zhang (2005) bằng cách giải trình tự DNA. Nhóm tác giả đã sử dụng hai gen ti thể (ND2 và ND4) và gen nhân beta-fibrinogen intron 7. Việc kết hợp (ND5, cytb, 12S, và 16SrRNA) và hai gen nhân (IRBP và TTR) chuỗi locus cũng đƣợc kết hợp để tái tạo lại phát sinh loài của 14 loài thuộc họ mèo có quan hệ họ hàng. Patoua et al., (2008) đã tiến hành giải mã trình tự của hai gen ti thể (Cytochrome b và ND2) và hai gen nhân (một đoạn không mã hóa: intron 7 của βfrinogen và một đoạn mã hóa: exon 1 của IRBP). Nhóm tác giả kết luận việc bổ sung các dữ liệu DNA nhân, đặc biệt là các β -fibrinogen intron 7, đóng vai trò trọng yếu 6 cải thiện độ phân giải phát sinh loài của các loài bên trong của Hemigalinae và Paradoxurinae. Gần đây nhất, Veron et al., (2015) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của chi Paradoxurus bằng cách sử dụng hai gen ti thể (cytochrome b, khu vực kiểm soát CR) và một gen nhân (intron 7 của β-fibrinogen) đánh dấu. Nhóm tác giả đã sử dụng mẫu t 85 cá thể thuộc loài P. hermaphroditus (bao gồm 20 mẫu vật bảo tàng) và một đại diện của mỗi loài khác trong chi Paradoxurus: Paradoxurus jerdoni và Paradoxurus zeylonensis. Mặt khác, nhóm tác giả kiểm tra đặc điểm hàm và răng t một loạt lớn các mẫu vật và so sánh sự biến đổi về hình thái với các dữ liệu phân tử. Phân tích cây sinh dòng của chúng cho thấy rằng P. hermaphroditus là cận ngành. Nhóm tác giả nhận thấy có ba dòng chính phân phối: (1) trong tiểu lục địa Ấn Độ, phía nam Trung Quốc, Hải Nam và trong khu vực trên 200 m ở Đông ƣơng; (2) ở bán đảo Malaysia, Java, Sumatra và trong khu vực dƣới 200 m ở Đông ƣơng; và (3) ở Borneo, Philippines và quần đảo Mentawai. Quan sát hình thái học cũng tƣơng đồng với ba dòng phân tử. Theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả thì cầy vòi hƣơng ở Việt Nam nằm trong 2 nhánh (1) và (2), theo đề nghị thuộc hai loài: P. hermaproditus (Indian palm civet) và P. musagus (Sumatran palm civet). 1.1.2. Tổng quan tình hình nghiên c u xác địn kì động dục Kiến thức về sinh học sinh sản của các loài động vật là rất quan trọng để quản lý bền vững. Đánh giá chính xác tình trạng nội tiết là một trong những yếu tố quan trọng nhất để tăng hiệu quả các chƣơng trình hỗ trợ sinh sản. Sự nỗ lực trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (thụ tinh nhân tạo, thụ tinh trong ống nghiệm hoặc chuyển phôi) phụ thuộc vào kiến thức về sinh lý sinh sản của một loài nhất định (Schwarzenberger et al., 1996). Đặc biệt, trong thụ tinh nhân tạo, thời gian chính xác của việc thụ tinh là yếu tố giới hạn chính, sẽ dễ dàng hơn nếu chu kì động dục có thể đƣợc xác định. Phân tích hormone steroid của tuyến sinh dục là một điểm quan trọng đánh giá tình trạng sinh lí sinh sản của vật nuôi. Kích dục tố trong huyết thanh là sự phản ánh chính xác nhất của hoạt động sinh dục, tuy nhiên các kỹ thuật để thu thập thông tin này qua huyết thanh có thể ảnh hƣởng đến phúc lợi động vật (animal welfare) và 7 khá tốn kém. Lấy mẫu máu lặp lại nhiều lần sẽ gây stress, ảnh hƣởng đến vấn đề sức khỏe của động vật và khó khăn để thực hiện trong điều kiện hiện trƣờng, nhất là động vật hoang dã. Thậm chí việc lặp lại lấy mẫu máu để đo các steroid có thể là không thực tế ở các loài động vật có kích thƣớc nhỏ, lấy mẫu gây can thiệp và thậm chí dẫn đến các con vật bị giết chết. Phƣơng pháp không xâm lấn (non-invasive) dễ thực hiện và cho kết quả chính xác là lựa chọn thay thế tốt hơn. Mặc dù có thể thu thập mẫu nƣớc tiểu và phân để đánh giá tình trạng sinh sản ở động vật đƣợc nuôi nhốt, nhƣng khó khăn trong việc thu thập nƣớc tiểu đối với các động vật thả rông đã hạn chế việc sử dụng chúng trong việc điều tra. Vì vậy, mẫu phân là sự lựa chọn thực tế nhất cho mục đích này. Phƣơng pháp đo lƣu lƣợng các chất chuyển hóa steroid trong phân để đánh giá trạng thái nội tiết của động vật đã đƣợc đi tiên phong vào cuối những năm 1970 ở chim, đầu những năm 1980 ở động vật có vú và đã đƣợc nghiên cứu trong các thập kỷ qua với số lƣợng ngày càng tăng của các loài (Palme, 2005). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mô hình tƣơng tự trong huyết thanh là kích thích tố trong phân, và sử dụng các mẫu phân nhƣ một công cụ không xâm lấn đƣợc sử dụng rộng rãi để giám sát hoạt động sinh dục. Vấn đề thông tin không rõ ràng về tình trạng sinh sản của động vật cái đã đƣợc giải quyết nhờ phƣơng pháp phân tích hormone steroid phân để đánh giá các hoạt động nội tiết (Kumar et al., 2013). Đánh giá estrogen trong phân đã đƣợc sử dụng nhƣ chỉ số đáng tin cậy ở con vật mang thai ở một số động vật móng guốc (Amer et al., 2007 ; Macchi et al., 2010; Ncube et al., 2011; Monica và et al., 2014) và một số loài linh trƣởng (Shideler et al., 1993a, Shideler et al., 1993b, Heistermann et al., 1993; Ziegler et al., 1996; Maheshwari, 2010). Chúng cũng đƣợc sử dụng để xác định khoảng thời gian trƣớc khi rụng trứng ở động vật ăn thịt (Putranto et al., 2006; 2011). Phân tích chất chuyển hóa progesterone trong phân đã đƣợc sử dụng thành công để theo dõi chức năng thể vàng và mang thai, hƣ thai, tính chu kì động dục và các liệu pháp điều trị trong một danh sách mở rộng của nhiều loài. 1.1.3. X địn on đ ờng bài ti t hormone steroid Các loại sản ph m cuối cùng chuyển hóa của steroid trong phân đƣợc xác định bằng các nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp sắc ký (HPLC) và xét nghiệm miễn 8 dịch (RIA hoặc ELISA). Steroid phóng xạ 14 C đƣợc đƣa vào cơ thể qua con đƣờng truyền vào tĩnh mạch. Phân đƣợc thu thập ngay sau khi đi vệ sinh, nƣớc tiểu đƣợc lấy mẫu qua ống thông tiểu cố định ở con cái và sau khi tiểu tiện tự nhiên ở con đực (Palme et al., 1996). Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất steroid có chứa phóng xạ trong huyết tƣơng kết hợp nhanh chóng và bài tiết vào mật và nƣớc tiểu. Chúng đƣợc phân tách trong ruột và ở hầu hết các loài steroid phân chứa một tỷ lệ steroid tự do cao hơn các steroid liên hợp. Việc xác định con đƣờng, thời gian và sản ph m bài tiết steroid phân ngày càng đƣợc mở rộng danh sách các loài: c u (Adams et al., 1994); ngựa, lợn (Palme et al., 1994), voi châu Phi (Wasser et al., 1996), khỉ đầu chó (Wasser et al., 1996), mèo nhà (Graham and Brown, 1996). Về bản chất, những nghiên cứu này chỉ ra rằng estrogen trong phân chứa chủ yếu là oestrone, oestradiol17α và -17β. Oestrogen là sản ph m cuối cùng của sự trao đổi chất steroid. Nhƣ vậy các hợp chất trong huyết tƣơng và phân cũng tƣơng tự nhau. Ngƣợc lại, progesterone đƣợc chuyển hóa mạnh mẽ trƣớc khi đào thải qua phân và một số nghiên cứu chỉ ra rằng các chất chuyển hóa phân của nó bao gồm các chất chuyển hóa t 5α và 5β pregnan (pregnaned- iones, mono và dihydroxylated pregnans (Schwarzenberger et al., 1999; Heistermann et al., 1993; Möstl et al., 1993; Shideler et al., 1993b, Wasser et al., 1994; Graham et al., 1995; Brown, 2011). 1.1.4. Ly trích steroid Steroid có thể chiết xuất theo phƣơng pháp ethanol (Hattab et al., 2000; Kornmatitsuk et al., 2007; Capezzuto et al., 2008) hoặc methanol (Schwarzenberger et al., 1995, Isobe et al., 2005). Các mẫu phân đƣợc thu thập t 2-3 lần mỗi tuần (12 tháng). Các mẫu trong thời gian giữa thời kỳ mang thai đƣợc thu thập một lần/tuần hoặc hai tuần một lần. Các mẫu phân tƣơi (5 g) đƣợc thu gom đặt vào một túi nhựa và bảo quản (-200C) cho đến khi phân tích. Sau khi giải đông, 0,5 g đƣợc cân và đƣợc đặt trong một lọ thủy tinh có chứa 4 ml đệm chiết dung dịch (20% methanol hoặc ethanol). Mẫu đƣợc đặt trên máy lắc trong 18 giờ ở nhiệt độ phòng. Các chất lỏng này đƣợc chiết vào một ống nghiệm và ly tâm (400 vòng, 15 phút). Sau khi ly tâm, khoảng 1 ml dung dịch nổi đƣợc chiết vào ống eppendorf đƣợc dán nhãn và lƣu trữ đông lạnh (-200C) cho đến khi sử dụng. Phần còn lại đƣợc đƣa trở lại vào lọ thuỷ tinh 9 và đƣợc sấy khô để xác định trọng lƣợng khô của phân. Dung dịch này sẽ đƣợc sử dụng trực tiếp cho phân tích ELISA (Schwarzenberger et al., 1998; Putranto et al., 2006), HPLC (Putranto et al., 2011) hoặc RIA (Fujita et al., 2001). Gần đây, phƣơng pháp sử dụng petroleum ether cho chiết xuất progesterone và estrogen đƣợc sử dụng (Biancani et al., 2009). Nghiên cứu cho thấy phƣơng pháp này có tƣơng quan cao (r=0,923) với chiết xuất ethanol và tiết kiệm thời gian li trích hơn. Nhiều nghiên cứu về sự thay đổi chế độ ăn uống và dao động hàm lƣợng nƣớc giữa các mẫu phân có ảnh hƣởng đến nồng độ steroid trong phân hay không. Shideler et al., (1993) và Wasser et al., (1993) đã kết luận rằng việc lập chỉ mục các steroid phân không cần thiết. Tuy nhiên, ở một số loài nhƣ động vật ăn thịt và voi (Brown et al., 1994; Brown et al., 1995; Wasser et al., 1996), việc đông khô các mẫu phân trƣớc khi phân tích và biểu hiện nồng độ steroid trên mỗi gram phân khô là thuận lợi. Tuy nhiên, Schwarzenberger và cộng sự trong một loạt nghiên cứu lại kết luận rằng với một số loài ăn cỏ đƣợc nuôi trong các vƣờn thú khác nhau và không có cùng chế độ ăn tiêu chu n thì việc khử khô mẫu phân để xác định steroid là không cần thiết (Schwarzenberger và Walzer, 1995; Schwarzenberger et al., 1991, 1992, 1993, 1994, 1995). Hơn nữa, Wasser et al. (1993); Wasser et al. (1994) kết luận những thay đổi đáng kể theo mùa trong chế độ ăn uống của động vật thả rông không ảnh hƣởng đáng kể đến lƣợng định lƣợng steroid phân. Ngoài ra, Ziegler et al., (1996) cho rằng việc loại bỏ chất dịch ra khỏi phân không làm thay đổi cấu trúc steroid, vì nồng độ steroid giữa mẫu phân đông lạnh và phân lỏng có mối tƣơng quan cao. Nhƣ vậy, ở các loài động vật hoang dã với cấu trúc dân số hạn chế của chúng, xác định hormone sinh dục không xâm lấn sẽ là một phƣơng pháp hữu dụng đối với các nhà khoa học trong đánh giá sự thay đổi nội tiết sinh dục, xác định chu kì buồng trứng đồng thời tìm hiểu và giám sát động thái sinh dục của chúng để cải thiện khả năng sinh sản trong điều kiện nuôi. Cần có thêm nhiều công trình và phối hợp giữa các nhà nghiên cứu trong ngành công nghệ sinh học trƣớc khi có thể phát triển các bộ KIT steroid trong phân nhằm góp phần thành công cho công nghệ hỗ trợ sinh sản. 10 1.2. Nghiên cứu trong nƣớc Cầy vòi hƣơng có tên khoa học là Paradoxurus hermaphroditus (Pallas, 1777) còn có tên gọi khác là cầy vòi đốm. Nhiều tài liệu gọi loài này là chồn hƣơng, cầy hƣơng (Nguyễn Lân Hùng và Nguyễn Khắc Tích, 2010). Hiện có nhiều nơi nuôi cầy vòi hƣơng với nhiều mục đích khác nhau. Trong đó các trang trại nuôi loài này đã sớm phát triển ở các tỉnh Đắk Lắk, Lâm Đồng, ình ƣơng, Thanh Hóa, ắc Giang, thành phố Hồ Chí Minh, Long An, Đồng Nai. Hầu hết các trang trại, các hộ gia đình đang nuôi cầy vòi hƣơng đều thu lợi nhuận chủ yếu t việc cung cấp con giống, bán thịt cho các nhà hàng đặc sản. Những năm gần đây, một số hộ chăn nuôi cầy thu lợi nhuận t việc sản xuất cà phê chồn. Cầy vòi hƣơng là loài động vật hoang dã thuộc nhóm động vật ăn tạp, có tập tính kiếm ăn vào ban đêm. Thức ăn chủ yếu là những loại quả chín của các loài cây mọc trong tự nhiên và các loài gặm nhấm, côn trùng mà chúng săn bắt đƣợc (Phạm Nhật, 2002). Còn rất nhiều tài liệu khác đề cập đến sinh học, sinh thái học và tập tính của cầy vòi hƣơng trong tự nhiên. Đây chính là thông tin cơ sở để xây dựng chuồng trại, chăm sóc và nuôi dƣỡng trong điều kiện nuôi nhốt. Cầy vòi hƣơng là loài thích trái cây mềm và chúng lựa chọn rất kỹ các trái cây để ăn. Chúng cũng ăn quả cà phê song chỉ chọn những quả chín mọng, có vị ngọt, hƣơng thơm (Joshi et al., 1995; Nguyễn Vịnh, 2011). Về phía thức ăn động vật, cầy vòi hƣơng thƣờng ăn những côn trùng nhƣ rắn, bọ hung, giun đất, chuột, trứng chim, về phía thức ăn có nguồn gốc thực vật, chúng ăn những loại trái cây chín có vị ngọt nhƣ nhãn, mít, chuối, đu đủ,… (Nguyễn Lân Hùng và Nguyễn Khắc Tích, 2010). Kiểu hình bộ máy tiêu hóa của loài ăn tạp: dạ dày phát triển, gồm có 4 vùng: vùng thƣợng vị, vùng đƣờng cong lớn, vùng trung vị và vùng hạ vị. Đây là kiểu hình v a tiêu hóa thức ăn tinh v a tiêu hóa thức ăn xanh tùy theo kh u phần. Trong điều kiện hoang dã, nguồn thức ăn không ổn định về chất lƣợng và số lƣợng, nên bộ máy tiêu hóa đa dạng là một lợi thế. Với tập tính kiếm ăn vào ban đêm, thƣờng là đầu hôm đến giữa đêm nên thời gian tiêu hóa thức ăn chủ yếu vào ban đêm, giảm hoạt động vào ban ngày (Joshi et al., 1995; Grassman et al., 1998; Duckworth et al., 11 2008). Chính vì thế, nếu thuần hóa và chăn nuôi dạng sinh thái, ngƣời chăn nuôi nên chú đặc điểm này, nên cho ăn bữa ăn chính vào buổi chiều tối, tốt nhất là sau 6 giờ chiều nhằm không làm thay đổi tập tính vốn có của loài này (Nguyễn Lân Hùng, Nguyễn Khắc Tích, 2010). Cầy vòi hƣơng thích ăn trái cây có vị ngọt, hàm lƣợng đƣờng trong thức ăn cao (Joshi et al., 1995), nên khi mới tập ăn, nên cho chúng ăn thức ăn có vị ngọt. Đặc điểm sinh học của cầy vòi hƣơng hoang dã đã đƣợc cứu tại Việt Nam bởi Roberton (2007). Tuy nhiên, nghiên cứu mới chỉ d ng lại ở mức quan sát một số đặc điểm sinh học, đánh giá thực trạng, phân bố của loài và đƣa ra những cảnh báo về việc bảo tồn loài này trong điều kiện hoang dã. Đến năm 2010, Đặng Huy Huỳnh và cs đã mô tả khá chi tiết về đặc điểm phân bố và đặc điểm sinh học của loài này ở Việt Nam. Cầy vòi hƣơng còn có các tên gọi khác là Vòi đen, Cầy vòi đốm, Chồn ngận hƣơng, Chồn mƣớp; Hên moóng meo (Tày); nhển moòng, nhển củn (Thái); cui vằng (Mƣờng); đèn bảo minh, đền tây diền (Dao). Về đặc điểm hình thái của cầy vòi hƣơng: Cầy vòi hƣơng nặng trung bình t 3 đến 5 kg. Chiều dài thân khoảng t 480 đến 700 mm, đuôi dài t 400 đến 660 mm. Khuôn mặt dài nhọn đặc trƣng của họ Cầy. Các gờ mấu ở xƣơng sọ khá phát triển. Mấu sau mắt dài. Xƣơng trán tƣơng đối bằng. Eo sau mắt thắt nhỏ (nhỏ hơn gian mắt). Mấu bên xƣơng ch m dính với mặt sau bầu nhĩ tạo thành đế khá lớn. Răng nhỏ thấp, gờ nhai tù. Răng trƣớc hàm số 1 rất nhỏ, có thể mất. Đế bàn chân lớn, đế bàn chân sau có thùy kéo dài để bám lúc leo trèo (Đặng Huy Huỳnh và cs., 2010). Cầy vòi hƣơng có tuyến xạ thơm cạnh hậu môn phát triển và thƣờng tỏa mùi thơm khi hoạt động, nằm sâu phía trong mông, phân bố hai bên hậu môn mà không lộ ra ngoài khác với cầy hƣơng tuyến xạ của con đực nằm ngay trƣớc tinh hoàn, lộ ra ngoài. Bộ lông có tính biến dị lớn: Bộ lông màu xám mốc hoặc hung mốc, mút lông phớt đen. ọc sống lƣng, sƣờn có đốm màu nâu đen hoặc thƣờng tạo tạo thành sọc chạy dọc sống lƣng t vai đến gốc vai đến gốc tai. Đầu, đuôi và chân chuyển mầu nâu đen; đuôi có vệt không rõ hoặc màu đen ở phần gốc đuôi, phần mút đuôi 12 thƣờng có màu đen, tuy nhiên ở một số cá thể có thể màu trắng. Mặt có 2 – 3 đốm trắng cạnh mắt hoặc vệt sáng trắng ở trán qua 2 tai (Đặng Huy Huỳnh và cs., 2010). Tập tính của cầy vòi hƣơng cơ bản gần giống Cầy vòi mốc (Paguma larvata). Chủ yếu sống ở r ng. Sinh hoạt kiếm ăn đêm, ngày ngủ (Phạm Nhật, 2002). Loài này thƣờng hoạt động chủ yếu trên cây ít khi xuống đất. Cầy sống đơn, chỉ ghép đôi trong mùa sinh sản (Đặng Huy Huỳnh và cs., 2010). Vào mùa khan hiếm thức ăn, cầy vòi hƣơng cũng có thể kiếm ăn vào ban ngày. Cầy vòi hƣơng là loài ăn tạp, thức ăn tự nhiên bao gồm cả thực vật (hành phần thức ăn chủ yếu gồm các loại quả chín kỹ, nhằn vỏ, nuốt hạt, ...) lẫn động vật (gồm côn trùng, cua, ốc, …chiếm tỷ lệ ít); tuy Cầy vòi hƣơng thuộc bộ thú ăn thịt nhƣng loài này thƣờng ăn thực vật nhiều hơn động vật. Trong điều kiện nuôi nhốt Cầy rất tạp ăn kể cả thịt, cá cơm canh (Đặng Huy Huỳnh và cs., 2010). Cầy vòi hƣơng động dục vào các tháng 2 – 4, đẻ con vào tháng 5 – 6, mỗi lứa 2 – 4 con. Thời gian chửa 60 – 63 ngày; con sơ sinh nặng 250 – 300g. Cầy béo vào mùa đông. Tuổi thọ khoảng 14 năm, trong điều kiện nuôi, có cá thể sống tới 22 năm 5 tháng (Đặng Huy Huỳnh và cs., 2010; Nguyễn Lân Hùng và Nguyễn Khắc Tích, 2010). Theo Đặng Huy Huỳnh và các cộng sự (2010), cầy vòi hƣơng sống ở r ng cây gỗ núi đất, núi đá và cả r ng ngập nƣớc ven biển hay r ng tràm ở đồng bằng sông Cửu Long. Cầy có thể sống cả ở r ng nguyên sinh và thứ sinh đã bị tác động mạnh. Loài Cầy này không đào hang ở và không có chỗ ở cố định. Cầy thƣờng trú n trong các bọng cây, trên các tán cây rậm rạp. Ở Việt Nam, Cầy vòi hƣơng phân bố rộng trên toàn quốc: Lào Cai, Sơn La, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Bắc Giang, Quảng Ninh, Hòa Bình, Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Th a Thiên – Huế, Đà Nẵng, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng, Đồng Nai,… (Đặng Huy Huỳnh và cs., 2010). Về giá trị sử dụng, cầy vòi hƣơng là một loài có giá trị kinh tế cao cho thịt ngon, da lông có giá trị cao. Tuyến xạ (xạ hƣơng) của cầy vòi hƣơng đƣợc sử dụng trong sản xuất mỹ ph m cao cấp. Xạ của cầy vòi hƣơng cũng là một vị thuốc quý trong Y học cổ truyền và đƣợc sử dụng nhƣ xạ hƣơng của hƣơu xạ. Do vậy, cầy vòi 13 hƣơng bị săn bắt ráo riết và sinh cảnh bị hủy hoại nên hiện nay bị suy giảm nhiều về mặt số lƣợng. Gần đây, một số nghiên cứu về đặc điểm sinh học của loài trong điều kiện nuôi đã đƣợc tiến hành. Nguyễn Thanh ình (2015a,b) đã công bố về một số bệnh thƣờng gặp và ảnh hƣởng của PMSG và HCG lên thành tích sinh sản của cầy còi hƣơng trong điều kiện nuôi nhốt. Nguyễn Thị Thu Hiền và cs., (2017a) đã nâng cao hiệu quả của việc sản xuất cà phê chồn nguyên liệu thông qua chế độ dinh dƣỡng hợp lí (80% thức ăn cơ bản với 50% thức ăn thực vật, 50% thức ăn động vật trong kh u phần). Về đặc điểm sinh trƣởng của cầy vòi hƣơng trong điều kiện nuôi, nghiên cứu cho thấy cầy vòi hƣơng t 3-24 tháng tuổi có tốc độ tăng khối lƣợng trung bình là 5.76 g/con/ngày (ở con đực) và 5.22 g/con/ngày (ở con cái). Tốc độ tăng trƣởng khối lƣợng cao nhất là t 9-12 tháng tuổi. Tốc độ tăng trƣởng chiều dài thân có xu hƣớng giảm dần qua các tháng tuổi. Giai đoạn tăng trƣởng chiều dài thân nhanh nhất ở giai đoạn 3-6 tháng với mức tăng trƣởng tuyệt đối là 2.87 cm/con/tháng (ở con đực) và 2.57 cm/con/tháng (ở con cái). Tăng trƣởng tuyệt đối của chiều dài đuôi trung bình 0.99 cm/con/tháng (ở con đực) và 0.96 cm/con/tháng (ở con cái). Tăng trƣởng tuyệt đối của vòng ngực trung bình là 0.52 cm/con/tháng (ở con đực); 0.45 cm/con/tháng (ở con cái) và đạt tốc độ cao nhất ở giai đoạn 9 tháng tuổi (Nguyễn Thị Thu Hiền và cs., 2017b). Nghiên cứu đặc điểm sinh sản của cầy vòi hƣơng trong điều kiện nuôi cho thấy cầy có tuổi thành thục sinh dục trung bình là 11.96 tháng (ở cầy cái) và 10.97 tháng (ở cầy đực) với khối lƣợng trung bình 2.50 – 2.52 kg. Thời gian mang thai trung bình 60.9 ngày. Số con cầy vòi hƣơng sinh ra trong mỗi lứa t 1-4 con, trung bình 2.38 con/lứa. Cầy sơ sinh nặng trung bình 95.16 gram, con non khi cai sữa (45 ngày) nặng 590.83 gram. Tỉ lệ mang thai (66.67 %) và tỉ lệ con non sống khi cai sữa (80.83%) chƣa cao, phụ thuộc vào kỹ thuật chọn thời điểm ghép đôi và điều kiện nuôi dƣỡng (Nguyễn Thị Thu Hiền và cs., 2017c). Tóm lại, các nghiên cứu trong nƣớc về cầy vòi hƣơng còn khá khiêm tốn, chủ yếu nghiên cứu loài này trong tự nhiên, chƣa có những nghiên cứu mang tính hệ 14 thống về các đặc điểm sinh học của Cầy vòi hƣơng trong điều kiện nuôi, cũng nhƣ xác định chu kì sinh dục của cầy vòi hƣơng cái. Các nghiên cứu về chu kì động dục bằng biện pháp không xâm lấn (qua steroid phân) cũng chƣa đƣợc công bố.