Tài liệu Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm viên nang từ dược liệu hướng điều trị huyết khối, đau thắt ngực

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------- TRẦN KHÁNH DUY GÓP PHẦN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG TỪ DƯỢC LIỆU HƯỚNG ĐIỀU TRỊ HUYẾT KHỐI, ĐAU THẮT NGỰC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ---------------- TRẦN KHÁNH DUY GÓP PHẦN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG TỪ DƯỢC LIỆU HƯỚNG ĐIỀU TRỊ HUYẾT KHỐI, ĐAU THẮT NGỰC Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN THỊ MINH THUẬN PGS.TS. VÕ THỊ BẠCH HUỆ Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 . i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. . Luận văn Thạc sĩ - Khóa: 2016 - 2018 Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất - Mã số: 8720210 GÓP PHẦN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG TỪ DƯỢC LIỆU HƯỚNG ĐIỀU TRỊ HUYẾT KHỐI, ĐAU THẮT NGỰC Trần Khánh Duy Thầy hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Minh Thuận, PGS.TS. Võ Thị Bạch Huệ Mở đầu: Huyết phủ trục ứ (HPTƯ) là bài thuốc nổi tiếng của y học cổ truyền Trung Hoa, được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý về tim mạch như huyết khối, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, đột qụy… Nhiều dạng thuốc hiện đại của bài thuốc này đã ra đời như viên nén, viên nang. Để đáp ứng nhu cầu điều trị hiện nay, một số công ty dược phẩm tại Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm viên nang có thành phần gồm 11 dược liệu như trong bài thuốc HPTƯ. Bên cạnh việc nghiên cứu sản xuất thì công tác kiểm tra đánh giá chất lượng là yếu tố không thể thiếu. Trước những yêu cầu xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm viên nang từ dược liệu hướng điều trị huyết khối, đau thắt ngực”. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Các TCCS kiểm nghiệm bột Xích thược, cao HPTƯ và viên HPTƯ. Phương pháp nghiên cứu: (1) Xây dựng quy trình định tính các dược liệu trong cao và viên HPTƯ bằng SKLM. (2) Xây dựng và thẩm định QTĐL amygdalin trong cao và viên HPTƯ bằng phương pháp HPLC. (3) Xây dựng và thẩm định QTĐL paeoniflorin trong bột Xích thược và viên HPTƯ bằng phương pháp HPLC. (4) Dự thảo TCCS kiểm nghiệm các bán thành phẩm (bột Xích thược, cao HPTƯ) và TCCS kiểm nghiệm thành phẩm (viên HPTƯ). Kết quả nghiên cứu: Đương quy, Xuyên khung được chiết với n-hexan, dung môi khai triển n-hexan - ethyl acetat (9 : 1), phát hiện bằng UV 365 nm. Chỉ xác, Hồng hoa được chiết với ethyl acetat, dung môi khai triển cloroform - methanol - nước - acid acetic (13 : 4 : 1 : 1,5), phát hiện: Nhúng dung dịch AlCl3 1% rồi quan sát dưới UV 365 nm. Xích thược được chiết với aceton, Đào nhân chiết với methanol, Cam thảo, Cát cánh, Sài hồ, Ngưu tất, Sinh địa chiết với n-butanol, khai triển với hệ dung môi tương ứng và phát hiện bằng thuốc thử VS. Định lượng amygdalin với pha động methanol - nước (21,5 : 78,5), bước sóng phát hiện 210 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 l. Định lượng paeoniflorin với pha động acetonitril - KH2PO4 0,05M (18 : 82), bước sóng phát hiện 230 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 l. TCCS quy định hàm lượng paeoniflorin trong bột Xích thược không dưới 2,0%. Hàm lượng amygdalin trong cao không dưới 1,0%. Hàm lượng amygdalin trong viên không dưới 3,0 mg và hàm lượng paeoniflorin trong viên không dưới 2,0 mg. Bàn luận: Quy trình định tính các dược liệu Đương quy, Xuyên khung, Chỉ xác, Sài hồ, Cam thảo và định lượng paeoniflorin là điểm cải tiến của đề tài so với như CP 2010. Quy trình định lượng amygdalin, định tính Xích thược, Đào nhân, Hồng hoa, Cát cánh, Ngưu tất, Sinh địa là điểm mới của đề tài so với CP 2010. Kết luận: Đề tài đã xây dựng được quy trình định tính tất cả 11 dược liệu gồm Xích thược, Đào nhân, Đương quy, Xuyên khung, Hồng hoa, Sài hồ, Sinh địa, Chỉ xác, Cát cánh, Ngưu tất, Cam thảo có trong cao và viên HPTƯ bằng phương pháp SKLM. Xây dựng được quy trình định lượng amygdalin trong cao và viên HPTƯ. Xây dựng được quy trình định lượng paeoniflorin trong bột Xích thược và viên HPTƯ đạt các yêu cầu về tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng. Từ khóa: Đào nhân, Xích thược, amygdalin, paeoniflorin, sắc ký lỏng hiệu năng cao. . Master’s Thesis - Academic course: 2016 - 2018 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology - Code: 8720210 THE STANDARDIZATION OF THE CAPSULE PREPARATED FROM MEDICINAL PLANTS FOR TREATMENT THROMBOSIS, ANGINA PECTORIS Tran Khanh Duy Supervisor: PhD. Nguyen Thi Minh Thuan, Assoc. Prof. PhD. Vo Thi Bach Hue Introduction: Huyet phu truc u (HPTU) is a famous remedy of traditional Chinese medicine, widely used in the treatment of cardiovascular diseases such as thrombosis, angina pectoris, myocardial infarction, stroke. Many forms of this remedy had been developed such as tablets, capsules. To meet today’s treatment needs, some pharmaceutical companies in Viet Nam have conducted research and production of capsules containing 11 medicinal plants as in HPTU remedy. Besides the production research, quality inspection is an indispensable factor. From that fact, we conducted research “The standardization of the capsule preparated from medicinal plants for treatment thrombosis, angina pectoris”. Materials and methods: (1) Development the process to identify the presence of medicinal plants in HPTU extract and capsule by thin layer chromatography (TLC). (2) Development and validation the quantitative process of amygdalin in HPTU extract and capsule by HPLC. (3) Development and validation the quantitative process of paeoniflorin in Radix Paeoniae powder and HPTU capsule by HPLC. (4) Development the standardization for analyzing the Radix Paeoniae powder, HPTU extract and capsule. Results: Radix Angelica sinensis, Rhizoma Ligustici wallichii was extracted with n-hexan, the solvent developed is n-hexan - ethyl acetate (9 : 1), detected by UV 365 nm. Fructus Aurantii, Flos Carthami tinctorii was extracted with ethyl acetate, the solvent developed is chloroform - methanol - water - acetic acid (13 : 4 : 1 : 1,5), spray AlCl3 1% solution then observed under UV 365 nm. Radix Paeoniae was extracted with acetone, Semen Pruni was extracted with methanol, Radix et Rhizoma Glycyrrhizae, Radix Bupleuri chinensis, Radix Platycodi grandiflori, Radix Achyranthis bidentatae, Radix Rhemanniae glutinosae was extracted with n-butanol, detected by VS reagent. Quantitative amygdalin with mobile phase is methanol - water (21,5 : 78,5), the detective wavelength is 210 nm, flow rate is 1 ml/min, injective volume is 20 l. Quantitative paeoniflorin with mobile phase acetonitril - KH2PO4 (18 : 82), the detective wavelength is 230 nm, flow rate is 1 ml/min, injective volume is 20 l. The content of paeoniflorin in the Radix Paeoniae powder is not less than 2,0%. The content of amygdalin in the HPTU extract is not less than 1,0%. The content of amygdalin is not less than 3,0 mg, the content of paeoniflorin is not less than 2,0 mg calculated on the average weight of the capsule. Discussion: The process to identify the presence of Radix Angelica sinensis, Rhizoma Ligustici wallichii, Fructus Aurantii, Radix et Rhizoma Glycyrrhizae, Radix Bupleuri chinensis, quantitative of paeoniflorin is the improvement of the research compared to CP 2010. The process to identify the presence of Radix Paeoniae, Semen Pruni, Flos Carthami tinctorii, Radix Platycodi grandiflori, Radix Achyranthis bidentatae, Radix Rhemanniae glutinosae and quantitative of amygdalin is freshness of the research compared to CP 2010. Conclusions: The research had developed the process to identify the presence of 11 medicinal plants in HPTU extract and capsule by TLC. Hading developed the quantitative process of amygdalin in HPTU extract and capsule. Hading developed the quantitative process of paeoniflorin in the Radix Paeoniae powder and HPTU capsule by HPLC to meet the requirements of system suitability, specificity, linearity, precision and accuracy. Key words: Semen Pruni, Radix Paeoniae, amygdalin, paeoniflorin, HPLC. . i MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa ............................................................................................................. ii Lời cam đoan ............................................................................................................. iii Bản tóm tắt toàn văn luận văn bằng Tiếng Việt ........................................................ iv Bản tóm tắt toàn văn luận văn bằng Tiếng Anh ..........................................................v Mục lục...................................................................................................................... vi Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt ............................................................................... viii Danh mục bảng ......................................................................................................... ix Danh mục hình .......................................................................................................... xi MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ BÀI THUỐC HUYẾT PHỦ TRỤC Ứ ..............................3 1.1.1. Thành phần .................................................................................................3 1.1.2. Tác dụng dược lý, công dụng .....................................................................3 1.1.3. Chuyên luận viên nang Huyết phủ trục ứ - CP 2010 .................................4 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC DƯỢC LIỆU ............................................................7 1.3. ĐỊNH TÍNH CÁC DƯỢC LIỆU TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ...............17 1.4. ĐỊNH LƯỢNG AMYGDALIN VÀ PAEONIFLORIN TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU..............................................................................21 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................22 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................22 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................24 2.2.1. Xây dựng quy trình định tính các dược liệu trong cao và viên HPTƯ bằng phương pháp SKLM ...........................................................................................24 2.2.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng amygdalin trong cao và viên HPTƯ bằng phương pháp HPLC .......................................................................26 2.2.3. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng paeoniflorin trong bột Xích thược và viên HPTƯ bằng phương pháp HPLC ................................................29 2.2.4. Dự thảo TCCS kiểm nghiệm bột Xích thược, cao và viên HPTƯ ...........31 . i CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................33 3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH CÁC DƯỢC LIỆU TRONG CAO VÀ VIÊN HPTƯ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SKLM ..............................................33 3.1.1. Định tính Xích thược trong bột Xích thược và viên HPTƯ .....................33 3.1.2. Định tính Đào nhân trong cao và viên HPTƯ ..........................................34 3.1.3. Định tính Đương quy, Xuyên khung trong cao và viên HPTƯ ...............35 3.1.4. Định tính Chỉ xác trong cao và viên HPTƯ .............................................36 3.1.5. Định tính Hồng hoa trong cao và viên HPTƯ..........................................37 3.1.6. Định tính Cam thảo trong cao và viên HPTƯ ..........................................38 3.1.7. Định tính Cát cánh trong cao và viên HPTƯ ...........................................39 3.1.8. Định tính Sài hồ trong cao và viên HPTƯ ...............................................40 3.1.9. Định tính Ngưu tất trong cao và viên HPTƯ ...........................................41 3.1.10. Định tính Sinh địa trong cao và viên HPTƯ ..........................................42 3.2. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QTĐL AMYGDALIN TRONG CAO VÀ VIÊN HPTƯ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC .....................................................43 3.2.1. Khảo sát các điều kiện HPLC để tách được pic amygdalin .....................43 3.2.2. Thẩm định quy trình định lượng amygdalin ............................................45 3.3. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QTĐL PAEONIFLORIN TRONG BỘT XÍCH THƯỢC VÀ VIÊN HPTƯ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC .....................55 3.3.1. Khảo sát các điều kiện HPLC để tách được pic paeoniflorin ..................55 3.3.2. Thẩm định quy trình định lượng paeoniflorin ..........................................57 3.4. DỰ THẢO TCCS BỘT XÍCH THƯỢC, CAO VÀ VIÊN HPTƯ .................67 3.4.1. Khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm bột Xích thược ............................67 3.4.2. Khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao HPTƯ ...................................68 3.4.3. Khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm viên HPTƯ .................................69 3.4.4. TCCS kiểm nghiệm bột Xích thược, cao và viên HPTƯ .........................71 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................86 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................88 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC . ii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ nguyên Ý nghĩa Asymmetry Hệ số đối xứng Colony Forming Unit Số đơn vị khuẩn lạc CP Chinese Pharmacopoeia Dược điển Trung Quốc 4 DĐVN V Dược điển Việt Nam V 5 ELSD 6 GC-MS 7 H 8 HPGPC 9 HPLC 10 HPTƯ 11 PDA 12 QTĐL 13 RS Resolution Độ phân giải 14 Rf Retardation factor Hệ số lưu giữ 15 S Surface Diện tích pic 16 SKLM 17 RSD 18 TCCS 19 tR 20 VS 1 AS 2 CFU 3 . Evaporative Light Scattering Đầu dò tán xạ ánh sáng Detector Gas Chromatography - Mass Spectrometry bay hơi Sắc ký khí ghép khối phổ Height Chiều cao pic High Performance Gel Sắc ký thẩm thấu gel hiệu Permeation Chromatography năng cao High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao Huyết phủ trục ứ Photo Diode Array Đầu dò dãy diod quang Quy trình định lượng Sắc ký lớp mỏng Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối Tiêu chuẩn cơ sở Retention time Thời gian lưu Vanilin/acid sulfuric Vanilin trong acid sulfuric DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Định tính Xích thược trong một số chế phẩm bằng SKLM .....................17 Bảng 1.2. Định tính Đương quy, Xuyên khung trong các chế phẩm bằng SKLM ..17 Bảng 1.3. Định tính Hồng hoa trong một số chế phẩm bằng SKLM .......................19 Bảng 1.4. Định tính Cam thảo trong một số chế phẩm bằng SKLM .......................19 Bảng 2.5. Chất đối chiếu sử dụng để nghiên cứu .....................................................22 Bảng 2.6. Hóa chất - dung môi sử dụng để nghiên cứu............................................23 Bảng 2.7. Trang thiết bị sử dụng để nghiên cứu.......................................................23 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống đối với amygdalin ....................45 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu đối với amygdalin ...................................49 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính tuyến tính đối với amygdalin ..............................50 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với amygdalin trong cao .......................51 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian đối với amygdalin trong cao 51 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với amygdalin trong viên .....................52 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của amygdalin trong viên ....52 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng đối với amygdalin trong cao .........................53 Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng đối với amygdalin trong viên .......................54 Bảng 3.17. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống đối với paeoniflorin ................57 Bảng 3.18. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu đối với paeoniflorin ..............................61 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát tính tuyến đối với paeoniflorin ...................................62 Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với paeoniflorin trong bột Xích thược..63 Bảng 3.21. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian đối với bột Xích thược .........63 Bảng 3.22. Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với paeoniflorin trong viên ...................64 Bảng 3.23. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian paeoniflorin trong viên ........64 Bảng 3.24. Kết quả khảo sát độ đúng đối với paeoniflorin trong bột Xích thược ...65 Bảng 3.25. Kết quả khảo sát độ đúng đối với paeoniflorin trong viên .....................66 Bảng 3.26. Kết quả khảo sát tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của bột Xích thược .67 Bảng 3.27. Kết quả khảo sát độ mịn của bột Xích thược .........................................67 Bảng 3.28. Kết quả khảo sát hàm lượng paeoniflorin trong bột Xích thược............67 . Bảng 3.29. Kết quả khảo sát tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của cao ...................68 Bảng 3.30. Kết quả khảo sát chỉ tiêu kim loại nặng trong cao .................................68 Bảng 3.31. Kết quả khảo sát hàm lượng amygdalin trong cao .................................68 Bảng 3.32. Kết quả khảo sát độ đồng đều khối lượng của viên ...............................69 Bảng 3.33. Kết quả khảo sát độ rã của viên .............................................................70 Bảng 3.34. Kết quả khảo sát hàm lượng amygdalin và paeoniflorin trong viên ......70 Bảng 4.35. So sánh tiêu chuẩn của CP 2010 và TCCS…………………………… 87 . i DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Công thức khai triển của paeoniflorin .......................................................7 Hình 2.2. Công thức khai triển của amygdalin...........................................................9 Hình 3.3. Các sắc ký đồ định tính Xích thược trong bột Xích thược và viên ..........33 Hình 3.4. Các sắc ký đồ định tính Đào nhân trong cao và viên ...............................34 Hình 3.5. Các sắc ký đồ định tính đồng thời Đương quy và Xuyên khung .............35 Hình 3.6. Các sắc ký đồ định tính Chỉ xác trong cao và viên ..................................36 Hình 3.7. Các sắc ký đồ định tính Hồng hoa trong cao và viên ...............................37 Hình 3.8. Các sắc ký đồ định tính Cát cánh trong cao và viên ................................39 Hình 3.9. Các sắc ký đồ định tính Sài hồ trong cao và viên ....................................40 Hình 3. 10. Các sắc ký đồ định tính Ngưu tất trong cao và viên..............................41 Hình 3.11. Các sắc ký đồ thẩm định quy trình định tính Sinh địa ...........................42 Hình 3.12. Sắc ký đồ dung dịch thử cao HPTƯ khi rửa giải với pha động I và II ..43 Hình 3.13. Sắc ký đồ dung dịch thử viên HPTƯ khi rửa giải với pha động I và II .44 Hình 3.14. Phổ UV của amygdalin (a), của pic trong cao (b) và viên (c). ...............45 Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu đối chiếu amygdalin (a), mẫu thử (b), mẫu placebo (c) và mẫu thử thêm đối chiếu (d) của cao HPTƯ. .............................................................46 Hình 3.16. Sắc ký đồ mẫu amygdalin đối chiếu (a), mẫu thử (b), mẫu placebo (c) và mẫu thử thêm đối chiếu (d) của viên HPTƯ. ............................................................47 Hình 3.17. Độ tinh khiết của pic amygdalin trong cao (a) và viên HPTƯ (b) .........48 Hình 3.18. Đường tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic amygdalin ..................50 Hình 3.19. Sắc ký đồ dung dịch thử bột Xích thược khi rửa giải với các pha động 55 Hình 3.20. Sắc ký đồ dung dịch thử viên HPTƯ khi rửa giải với các pha động......56 Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu paeoniflorin đối chiếu (a), mẫu thử (b), mẫu trắng (c) và mẫu thử thêm đối chiếu (d) của bột Xích thược .......................................................58 Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu paeoniflorin đối chiếu (a), mẫu thử (b), mẫu placebo (c) và mẫu thử thêm đối chiếu (d) của viên HPTƯ ........................................................59 Hình 3.23. Độ tinh khiết của pic paeoniflorin trong bột Xích thược (a) và viên Huyết phủ trục ứ (b). .................................................................................................60 . i Hình 3.24. Phổ UV của paeoniflorin (a), của pic trong bột Xích thược (b) và viên Huyết phủ trục ứ (c). .................................................................................................61 Hình 3.25. Đường tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic paeoniflorin ...............62 . MỞ ĐẦU Từ lâu, huyết khối, đau thắt ngực là những bệnh lý mà người trung niên, cao tuổi rất ngại mắc phải vì những biến chứng nguy hiểm của nó. Ước tính mỗi năm trong 100 người bị đau thắt ngực ổn định sẽ có một người bị biến chứng nhồi máu cơ tim hoặc đột quỵ. Đã có nhiều thuốc điều trị huyết khối, đau thắt ngực được sản xuất từ hóa dược như aspirin, warfarin, heparin…, bên cạnh đó nhiều thuốc từ dược liệu cũng đã cho thấy hiệu quả điều trị trong các bệnh lý này. Huyết phủ trục ứ gồm các dược liệu Đào nhân, Hồng hoa, Đương quy, Xuyên khung, Xích thược, Sài hồ, Chỉ xác, Cam thảo, Ngưu tất, Cát cánh, Sinh địa là một bài thuốc nổi tiếng của nền y học cổ truyền Trung Hoa, đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý về tim mạch như huyết khối, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, đột qụy…Từ lâu, hiệu quả trị liệu của bài thuốc này đã được chứng minh qua các bằng chứng lâm sàng. Cùng với đó, sự giải thích cơ chế bảo vệ hệ tim mạch bởi các nghiên cứu dược lý gần đây, đã góp phần làm cho bài thuốc này được ứng dụng rộng rãi hơn. Từ dạng dùng ban đầu là thuốc sắc, một dạng thuốc xuất phát từ nền y học cổ truyền, cho đến nay, một số dạng thuốc hiện đại như viên nén, viên nang của Huyết phủ trục ứ đã được phát triển. Những chế phẩm này giúp cho việc dùng thuốc của bệnh nhân được thuận tiện hơn và đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Trung Quốc cho phép lưu hành. Trong đó dạng bào chế viên nang đã được đưa vào thành một chuyên luận của CP 2010 [18], [19]. Để đáp ứng nhu cầu điều trị hiện nay, một số công ty dược phẩm tại Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm viên nang có thành phần gồm 11 dược liệu như trong bài thuốc Huyết phủ trục ứ. Chế phẩm được sản xuất với quy trình sơ bộ như sau: Xích thược được nghiền thành bột mịn, rây, sấy khô đến độ ẩm quy định. Các dược liệu Đào nhân, Đương quy, Xuyên khung được chiết bằng ethanol 50%; Hồng hoa, Sài hồ, Sinh địa, Chỉ xác, Cát cánh, Ngưu tất, Cam thảo được chiết bằng nước, gộp chung dịch chiết ethanol 50% và dịch chiết nước, cô đến độ ẩm quy định thu được cao Huyết phủ trục ứ. Phối hợp bột Xích thược, cao Huyết phủ trục ứ và các tá dược, đóng vào nang. . Bên cạnh việc nghiên cứu sản xuất thì công tác kiểm tra đánh giá chất lượng là yếu tố không thể thiếu. Trước những yêu cầu xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm viên nang từ dược liệu hướng điều trị huyết khối, đau thắt ngực” với các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Xây dựng quy trình định tính các dược liệu trong cao và viên HPTƯ bằng phương pháp SKLM. 2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng amygdalin trong cao và viên HPTƯ bằng phương pháp HPLC - PDA. 3. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng paeoniflorin trong bột Xích thược và viên HPTƯ bằng phương pháp HPLC - PDA. 4. Dự thảo TCCS kiểm nghiệm các bán thành phẩm (bột Xích thược, cao HPTƯ) và TCCS kiểm nghiệm thành phẩm (viên HPTƯ). . . CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ BÀI THUỐC HUYẾT PHỦ TRỤC Ứ 1.1.1. Thành phần Huyết phủ trục ứ là bài thuốc nổi tiếng của nền y học cổ truyền Trung Hoa được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý về tim mạch như: Huyết khối, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, đột qụy...Bài thuốc này được sáng chế bởi Wang Qingren và đã được ghi lại lần đầu tiên trong cuốn sách “Yilin Gaicuo” vào năm 1850, bao gồm 11 dược liệu với thành phần các vị thuốc như sau: Quân Đào nhân (Semen Pruni) 12 g Hồng hoa (Flos Carthami tinctorii) 9 g Thần Đương quy (Radix Angelicae sinensis) 9 g Xuyên khung (Rhizoma Ligustici wallichii) 5 g Xích thược (Radix Paeoniae) 6 g Sài hồ (Radix Bupleuri) 3 g Tá Sinh địa (Radix Rehmanniae glutinosae) 9 g Chỉ xác (Fructus Aurantii) 5 g Cát cánh (Radix Platycodi grandiflori) 6 g Ngưu tất (Radix Achyranthis bidentatae) 9 g Sứ Cam thảo (Radix et Rhizoma Glycyrrhizae) 3 g [18], [30]. 1.1.2. Tác dụng dược lý, công dụng Huyết phủ trục ứ được sử dụng để tăng tuần hoàn máu, làm tan huyết khối, thúc đẩy hình thành máu mới, giảm đau,…chỉ định cho các trường hợp huyết ứ ở ngực với các biểu hiện như: Đau thắt ngực, đau đầu mãn tính cục bộ, đánh trống ngực, bồn chồn, mất ngủ, dễ cáu gắt, giận giữ, môi tím sẫm, chất lưỡi hồng xạm, mép lưỡi có ban ứ huyết. Trong đó vị quân gồm Đào nhân và Hồng hoa là hai dược liệu cơ bản tác dụng . hiệp đồng thúc đẩy tuần hoàn máu, loại trừ huyết ứ và giảm đau. Hỗ trợ làm tăng tác dụng của vị quân là các vị: Xích thược giúp tăng cường lưu thông máu, loại trừ huyết ứ, Xuyên khung thúc đẩy khí huyết lưu thông, Ngưu tất có đặc tính đắng và chua giúp thúc đẩy dòng máu lưu thông êm ái bên trong thành mạch từ đó làm giảm nguy cơ gây ra huyết ứ, Chỉ xác và Cát cánh điều hòa dòng khí ở phổi, Sài hồ điều hòa chức năng gan, Sinh địa và Đương quy giúp nuôi dưỡng máu, Cam thảo có vai trò dẫn thuốc và điều hòa các vị thuốc khác [24], [30]. 1.1.3. Chuyên luận viên nang Huyết phủ trục ứ - CP 2010 1.1.3.1. Quy trình bào chế Xuất phát từ bài thuốc Huyết phủ trục ứ, nhiều chế phẩm được bào chế theo phương pháp của nền y học hiện đại đã ra đời như viên nén, viên nang…Trong đó dạng bào chế viên nang đã được đưa vào thành một chuyên luận của CP 2010 với quy trình bào chế như sau: Cân các dược liệu Đào nhân 108 g, Hồng hoa 81 g, Đương quy 81 g, Xuyên khung 40 g, Xích thược 54 g, Sài hồ 27 g, Sinh địa 81 g, Chỉ xác 54 g, Cát cánh 40 g, Ngưu tất 81 g, Cam thảo 27 g. Sau đó, Đương quy, Xích thược, Chỉ xác, Xuyên khung, Sài hồ và một phần hai Đào nhân được nghiền thành bột mịn, rây và trộn đều. Một phần hai Đào nhân và 5 thành phần còn lại được chiết với nước 3 lần, lọc, gộp chung dịch lọc, cô đặc thành cao. Cao được trộn với phần bột ở trên sau đó sấy khô, nghiền mịn, rây và đóng vào 1000 nang [9]. 1.1.3.2. Phương pháp định tính Theo CP 2010 các dược liệu Đương quy, Xuyên khung, Chỉ xác, Sài hồ, Cam thảo trong viên Huyết phủ trụ ứ được định tính bằng phương pháp SKLM. - Định tính đồng thời Đương quy và Xuyên Khung: Cân 3 g chế phẩm, thêm 10 ml ether dầu hỏa (60 - 90 oC), siêu âm trong 10 phút, lọc, sử dụng dịch lọc làm mẫu thử. Dùng 1 g bột Đương quy đối chiếu và 1 g bột Xuyên khung đối chiếu chuẩn bị theo quy trình giống mẫu thử để được hai dung dịch đối chiếu tương ứng. Pha động là nhexan - ethyl acetat (9 : 1), mỗi dung dịch chấm 2 - 5 l. Sau khi khai triển, để khô tự nhiên và quan sát dưới ánh sáng UV 365 nm. . - Định tính Chỉ xác: Cân 5 g chế phẩm, thêm 20 ml methanol, siêu âm trong 1 giờ, để yên 2 giờ, lọc. Cô dịch lọc đến khoảng 10 ml, sử dụng làm dung dịch thử. Dùng 1 g bột Chỉ xác, thêm 10 ml methanol, siêu âm 30 phút, lọc, sử dụng dịch lọc làm dung dịch đối chiếu. Pha động ethyl acetat - ethanol - nước (8 : 2 : 1), mỗi dung dịch chấm 5 - 10 l. Sau khi khai triển, để khô tự nhiên, phun thuốc thử nhôm (III) clorid, quan sát dưới ánh sáng UV 365 nm. - Định tính Sài hồ: Cân 4 g chế phẩm, thêm 30 ml methanol, siêu âm trong 30 phút. Để nguội, lọc, bốc hơi dịch lọc đến cắn, hòa tan cắn trong 30 ml nước. Lắc phân bố với n-butanol bão hòa nước 3 lần, mỗi lần 20 ml, gộp chung dịch chiết n-butanol, rửa với 50 ml amoni hydroxyd 10% và 50 ml nước bão hòa n-butanol, loại bỏ lớp nước. Cô dịch chiết n-butanol đến cắn, hòa tan cắn trong 2 ml methanol làm dung dịch thử. Dung dịch đối chiếu được chuẩn bị từ 0,5 g Sài hồ đối chiếu và tiến hành với quy trình giống mẫu thử. Pha động cloroform - methanol - nước (13 : 7 : 2, lớp dưới). Mỗi dung dịch chấm 5 - 10 l, sau khi khai triển, để khô tự nhiên. Quan sát dưới ánh sáng UV 365 nm, phun thuốc thử là dung dịch 2% của 4-dimethylaminobenzaldehyd trong acid sulfuric 40%, hơ nóng đến khi xuất hiện các vết trên sắc ký đồ. - Định tính Cam thảo: Cân 4 g chế phẩm thêm 40 ml methanol, siêu âm 30 phút. Để nguội, lọc, cô dịch lọc đến cắn, hòa tan cắn trong 20 ml nước, lắc phân bố với ether 2 lần mỗi lần 20 ml, loại bỏ lớp ether. Tiếp tục lắc phân bố với n-butanol bão hòa nước, 2 lần mỗi lần 20 ml, gộp chung dịch chiết n-butanol, rửa với nước bão hòa nbutanol 2 lần, mỗi lần 20 ml, loại bỏ lớp nước. Cô dịch chiết n-butanol đến cắn, hòa tan cắn trong 2 ml methanol làm dung dịch thử. Dung dịch đối chiếu được chuẩn bị từ 0,5 g Cam thảo đối chiếu với quy trình giống dung dịch thử. Pha động cloroform methanol - nước (13 : 6 : 2, lớp dưới). Mỗi dung dịch chấm 5 - 10 l, sau khi khai triển, để khô tự nhiên, phun thuốc thử là dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol, hơ nóng đến khi hiện rõ vết. Định tính amygdalin: Thực hiện bằng phương pháp HPLC, hòa tan amygdalin đối chiếu trong methanol 50% để được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 60 g/ml dùng làm dung dịch đối chiếu. Dung dịch thử được chuẩn bị như phần định lượng. . Sử dụng cột sắc ký pha đảo C18, bước sóng phát hiện ở 210 nm, thể tích tiêm mẫu 20 l. Pha động gồm methanol và nước, rửa giải theo chương trình pha động như sau: Thời gian (phút) Methanol (% tt/tt) Nước (% tt/tt) Ghi chú 0 - 20 20 80 Đẳng dòng 20 - 22 20 → 90 80 → 10 Gradient tuyến tính 22 - 52 90 10 Đẳng dòng 52 - 55 90 → 20 10 → 80 Gradient tuyến tính 55 - 65 20 80 Đẳng dòng Sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic amygdalin trên sắc ký đồ dung dịch đối chiếu [9]. 1.1.3.3. Phương pháp định lượng Pha động: Acetonitril - acid acetic - nước (16 : 1 : 84). Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký pha đảo C18. - Bước sóng phát hiện 230 nm. - Thể tích tiêm mẫu 10 l. Dung dịch đối chiếu: Cân chính xác một lượng paeoniflorin hòa tan trong methanol 50% để thu được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 70 g/ml. Dung dịch thử: Cân chính xác 0,5 g bột chế phẩm cho vào bình nón có nút mài, thêm chính xác 25 ml methanol 50% đậy nút, cân khối lượng, siêu âm trong 30 phút. Để nguội, cân lại khối lượng, bổ sung khối lượng hao hụt bằng methanol 50%, lắc đều, lọc, sử dụng dịch lọc làm dung dịch thử. Tiến hành sắc ký dung dịch đối chiếu và dung dịch thử. Số đĩa lý thuyết của cột sắc ký không được nhỏ hơn 2500 tính trên pic paeoniflorin. Hàm lượng paeoniflorin (C23H28O11) trong viên không được ít hơn 1,0 mg [9]. 1.1.3.4. Liều dùng Liều được khuyến cáo của chế phẩm là ngày uống 2 lần, mỗi lần 6 viên, điều trị kéo dài trong 1 tháng [9]. . 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC DƯỢC LIỆU 1.2.1. Tổng quan về Xích thược Xích thược Radix Paeoniae là rễ đã phơi hay sấy khô của cây Thược dược (Paeonia lactiflora Pall.), hoặc cây Xuyên xích thược (Paeonia veitchii Lynch), họ Hoàng Liên (Paeoniaceae) [2]. 1.2.1.1. Thành phần hóa học Thành phần hóa học chính của Xích thược là paeoniflorin, một monoterpen glycosid, hàm lượng khoảng 0,05 – 6,01%. Thành phần này cũng được chỉ định là chất đánh dấu để đánh giá chất lượng dược liệu Xích thược trong các Dược điển [2] [21], [26]. Hình 2.1. Công thức khai triển của paeoniflorin [26]. 1.2.1.2. Tác dụng dược lý, công dụng Xích thược với tác dụng loại trừ nhiệt từ máu, loại trừ huyết khối, giảm đau thường được chỉ định cho các trường hợp đau thắt ngực, đau do chấn thương. Cao chiết Xích thược có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu do adenosyl diphosphat, arachidonic acid và collagen gây ra, đồng thời ngăn chặn sự đông máu nội mạch gây ra bởi endotoxin. Thành phần chính paeoniflorin có tác dụng hạn chế tình trạng tăng đông máu, tiêu hủy huyết khối bằng cách tăng biểu hiện của plasminogen activator urokinase, một protease serin tạo điều kiện cho sự phân giải huyết khối bình thường. Paeoniflorin còn có tác dụng làm giảm fibrinogen, D-dimer và thromboxan B2. Trong đó thromboxan B2 là chất hoạt hóa tiểu cầu, fibrinogen làm tăng nguy cơ huyết khối tĩnh mạch và việc giảm nồng độ D-dimer phản ánh hoạt động tiêu sợi huyết. Tất cả những thay đổi đối với các phân tử này cho thấy tình trạng huyết khối được cải thiện sau điều trị với paeoniflorin [10], [23], [26]. . 1.2.1.3. Phương pháp định tính, định lượng Định tính Xích thược bằng phương pháp SKLM Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol, lắc kỹ trong 5 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc đến cắn, hòa tan cắn trong 2 ml ethanol, được dung dịch thử. Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 2 mg paeonilorin đối chiếu trong 1 ml ethanol 96%. Hoặc dùng 0,5 g bột Xích thược đối chiếu, chiết như dung dịch thử. Pha động: Cloroform - ethyl acetat - methanol - acid formic (40 : 5 : 10 : 0,2). Phát hiện: Quan sát dưới ánh sáng UV 254 nm hoặc dùng thuốc thử VS [2], [11]. Định lượng paeoniflorin trong Xích thược bằng phương pháp HPLC Dung dịch đối chiếu: Hòa tan paeoniflorin đối chiếu trong methanol để được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 50 μg/ml. Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu vào bình nón nút mài, thêm chính xác 25 ml methanol, đậy nút, cân xác định khối lượng. Ngâm trong 4 giờ, siêu âm trong 20 phút, để nguội, cân lại và bổ sung methanol để được khối lượng ban đầu. Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm, được dung dịch thử. Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký pha đảo C18, bước sóng phát hiện 230 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 μl. Pha động: Methanol - KH2PO4 0,05M (40 : 65). Số đĩa lý thuyết của cột sắc ký tính theo pic paeoniflorin không được dưới 3000. Hàm lượng paeoniflorin trong Xích thược không được thấp hơn 1,8% [2]. 1.2.2. Tổng quan về Đào nhân Đào nhân Semen Pruni là hạt lấy ở quả chín của cây Đào [Prunus persica (L.) Batsch] hoặc cây Sơn đào [Prunus persica Batsch var. Davidiana Maximowicz], họ Hoa hồng (Rosaceae), được bỏ hạch cứng và phơi hoặc sấy khô [2]. 1.2.2.1. Thành phần hóa học Đào nhân chứa đến 50% là dầu béo, tỷ trọng 0,9114 - 0,9325, chỉ số xà phòng 190. Bên cạnh đó còn có amygdalin một cyanogenic glycosid chiếm tỷ lệ khoảng 3,5% đây cũng là thành phần được chọn làm chất đánh dấu để đánh giá chỉ tiêu định tính và định lượng Đào nhân trong các Dược điển [2], [5], [15]. .