Tài liệu Điều chế hệ chất mang thuốc nano cisplatin heparin pluronic (p123) và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư

TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HOC TỰ NHIÊN TÓM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG NANO CISPLATIN/HEPARIN-FLURONIC (P123) Ư Mã số: Chủ nhiệm đề tài TS. Nguyễn Thị Bích Trâm BÌNH DƢƠNG, 6/2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HOC TỰ NHIÊN TÓM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG NANO CISPLATIN/HEPARIN-FLURONIC (P123) Ư Mã số: Xác nhận của đơn vị chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài (chữ ký, họ và tên) TS. Nguyễn Thị Bích Trâm BÌNH DƢƠNG, 6/2018 Đề tài được hoàn thành tại: Phòng thí nghiệm hóa học, Trường Đại học Thủ Dầu Một Đề tài được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá nghiệm thu đề tài KH & CN cấp trường vào hồi … giờ … ngày … tháng … năm 2018 Có thể tìm hiểu đề tài tại thư viện: Thư viện Trường Đại học Thủ Dầu Một MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ngày nay, xã hội phát triển cùng với sự phát triển của các ngành khoa học - kĩ thuật tiên tiến thì công nghệ nano lại chiếm một phần không thể thiếu trong các lĩnh vực: mỹ phẩm, thực phẩm…. và đặc biệt là y dược. Nhìn chung cisplatin và nhiều loại thu c ch ng ung thư khác thường k m tan trong nước, có nhiều hiệu ng ph và thu c tư ng tác đặc hiệu k m với cả tế bào bệnh lẫn tế bào lành. Sử d ng chất mang nano nang hóa và điều chỉnh nhả chậm thu c đã được ch ng minh là một trong những giải pháp hiệu quả nhất vì chất mang nano có thể dễ dàng di chuyển trong hệ tuần hoàn máu và sau đó lưu trữ ở vị trí kh i u thông qua hiệu ng tăng cường thẩm thấu và lưu trữ (EPR) (Enhanced permeability and retention effect) hoặc sử d ng các tác nhân hướng đích. Cisplatin là một trong những thu c nhóm ph c platin (II) được dùng nhiều nhất trong các phác đồ hóa trị kết hợp cho bệnh nhân ung thư. Tuy nhiên, cisplatin gây nhiều tác d ng ph như gây độc thận, thần kinh, … Thu c giảm nhanh dược động học do tư ng tác với protein huyết tư ng trước khi đến tế bào ung thư. Mặc dù vậy, do tác d ng diệt tế bào ung thư khá t t nên nhiều thu c có cấu trúc gần gi ng cisplatin cũng đã được phát triển. Tuy nhiên các ph c trên khá đắt và có nhiều tác d ng ph . Nhiều nghiên c u gần đây thay vì tổng hợp ph c platin mới thì tập trung vào hướng chất mang nhả thu c nano nhằm giảm tác d ng ph của cisplatin mà vẫn giữ được hiệu quả của thu c. Chất mang thu c nano có thể vận chuyển hiệu quả thu c đến vị trí kh i u góp phần giảm phản ng ph , tăng dung nạp thu c bằng tác d ng duy trì và tăng cường thẩm thấu (EPR-effect). Nhiều nanogel từ poly(NPage | 1 isopropylacrylamide), poly(lactide-co-glycolide)-polyethylene glycol đã được phát triển cho vận chuyển cisplatin. Trong đề xuất này, chúng tôi định hướng tổng hợp heparin gh p copolymer polyethylene glycol-b-polypropylene (pluronic P123) sử d ng để tạo ph c với cisplatin hydrate. Hệ nanogel này có thể vận chuyển hiệu quả cisplatin và có thể nang hóa thêm một loại thu c ch ng ung thu k m tan khác. Hiệu quả mang thu c được cải thiên trên c sở kết hợp hoạt tính thu c với đặc tính của chất mang nano. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Điều chế, khảo sát đặc tính cấu trúc, độc tế bào của nanogel trên c sở Heparin-fluronic mang thu c ch ng ung thư cisplatin. Đ I TƢ NG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU  Đối tƣợng nghiên cứu - Những vấn đề lý luận liên quan tới heparin, fluronic P123, cisplatin. - Thực trạng tổng hợp hệ chất nano heparin-fluronic P123 sử d ng để mang nhả thu c cisplatin.  Phạm vi nghiên cứu - Tổng hợp nano heparin-fluronic P123 mang cisplatin và các khảo sát liên quan trong phạm vi phòng thí nghiệm. - Thời gian nghiên c u: 15 tháng. Page | 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Hệ th ng hoá những vấn đề lý luận liên quan tới vấn đề nghiên c u của đề tài; - Mô tả phân tích, đánh giá thực trạng vấn đề nghiên c u:  Hoạt hóa P123 với NPC và đánh giá cấu trúc.  Điều chế NPC-P123-OH và đánh giá cấu trúc.  Điều chế heparin gh p BDA bằng tác chất gh p cặp carbodiimide.  Điều chế heparin đã hoạt hóa gh p với NPC-P123-OH.  Điều chế và đánh giá đặc tính nanogel từ heparin-P123  Điều chế hệt nanogel mang thu c cisplatin dạng hydrate/dạng không hydrate.  Đánh giá lượng thu c cisplatin mang trên nanogel.  Đánh giá hiệu quả nhả thu c cisplatin trên chất mang nanogel.  Đánh giá hiệu quả tiêu diệt tế bào ung thư phổi HCI-L460 của hệ nanogel ch a thu c cisplatin hidrat.  Đề xuất các biện pháp, giải pháp, khuyến nghị (kiến nghị). Page | 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phư ng pháp nghiên c u tài liệu. - Phư ng pháp nghiên c u thực nghiệm.  Thực nghiệm tổng hợp nano heparin-pluronic P123 mang cisplatin.  Thực nghiệm quá trình mang thu c ch ng ung thư cisplatin.  Thực nghiệm quá trình khảo sát hoạt tính c chế của hệ chất lên tế bào ung thư. Các phư ng pháp phân tích hóa lí hiện đại:  Phổ cộng hưởng từ nhân – Nuclear magnetic resonance – NMR.  Phổ hồng ngoại – Infrared – IR.  Kính hiển vi điện tử truyền qua – TEM.  Phư ng pháp đo kích thước hạt bằng tán xạ ánh sáng động - DLS  Phư ng pháp đo ICP xác định hàm lượng cisplatin có trong copolymer/nanogel.  Phân tích nhiệt trọng TGA (Thermal gravimetric analysis).  Phư ng pháp quang phổ phát xạ nguyên tử plasma ICP-AES (Inductively couple plasma – atomic emission spectrocopy). - Phư ng pháp thử độc tính tế bào Phư ng pháp SRB (Sulforhodamine B) - xác định độc tính đ i với tế bào ung thư của các hoạt chất trong mô hình in vitro. Page | 4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đề tài có giá trị trong việc nghiên c u các hợp chất mang thu c ch ng ung thư hướng đích, đó là những hợp chất chuyển thu c ch ng ung thư đến đúng vị trí tế bào ung thư. Đây là vấn đề đang được xã hội quan tâm hiện nay.. Page | 5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 . KẾT QUẢ TỔNG H P HEPARIN-P123 3.1.1. Kết quả tổng hợp NPC-P123-NPC Phân tử pluronic H-(OC2H4)20-(OC3H6)70-(OC2H4)20-OH (P123) có hai nhóm hydroxyl –OH ở vị trí đầu và vị trí cu i của mạch phân tử được hoạt hóa bằng hợp chất para-nitrophenyl chloroformate O2N-C6H4-OCOCl (NPC) theo tỉ lệ mol 1:2. Các nguyên tử H này sẽ bị thay thế bằng g c O2N-C6H4-O-CO- thông qua liên kết ester tạo thành hợp chất p-O2N-C6H4-O-CO-(OC2H4)20-(OC3H6)70(OC2H4)20-O-CO-O-C6H4-p-NO2 kí hiệu là NPC-P123-NPC.  Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-P123-NPC Hình 3. 1: Phổ1H-NMR của NPC-P123-NPC Page | 6  Kết quả phổ FT-IR của NPC-P123-NPC Hình 3. 2: Phổ FT-IR của Pluronic P123 và NPC-P123-NPC 3.1.2. Kết quả tổng hợp NPC-P123-OH Sản phẩm NPC-P123-NPC đem phản ng với 3-aminopropan-1-ol (H2N-CH2CH2CH2-OH), tạo thành sản phẩm p-O2N-C6H4-O-CO-(OC2H4)20(OC3H6)70-(OC2H4)-O-CO-NH-CH2CH2CH2-OH kí hiệu là NPC-P123-OH.  Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-P123-OH Hình 3. 3: Phổ1H-NMR của NPC-P123-OH Page | 7  Kết quả phổ FT-IR của NPC-P123-OH Hình 3. 4: Phổ FT-IR của pluronic P123, NPC-P123-NPC và NPC-P123-OH 3.1.3. Kết quả tổng hợp Hep-DAB Các nhóm carboxylate trên phân tử heparin sẽ được hoạt hóa bởi 1,4- diaminobutane H2NCH2CH2CH2CH2NH2 (DAB) trông qua tác nhân gh p cặp 1Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC), N-Hydroxysuccinimide (NHS) tạo thành sản phẩm kí hiệu Hep-DAB.  Kết quả phổ FT-IR của Hep-DAB Hình 3.5: Phổ FT-IR của Hep-DAB Page | 8 3.1.4. Kết quả tổng hợp Hep-P123 S đồ tổng hợp Hep-P123 S đồ 3. 1: Phản ng tạo thành Hep-P123  Kết quả phổ 1H-NMR của Hep-P123 Hình 3. 6: Phổ1H-NMR của Hep-P123 Page | 9  Kết quả phổ FT-IR của heparin-P123 Hình 3. 7: Phổ FT-IR của Pluronic P123, NPC-P123-NPC, NPC-P123-OH và Heparin-pluronic P123  Kết quả giản đồ TGA của Hep-P123 Hình 3. 8: Giản đồ TGA của P123, heparin và Hep-P123 Page | 10 Từ giản đồ TGA có thể tính được kh i lượng thực tế mà pluronic P123 gh p được trên heparin: Bảng 3. 4: So sánh tỉ lệ mol của hep-P123 theo lý thuyết và thực tế Hep:P123 Tỉ lệ lí Giá trị a Giá trị b Tỉ lệ thực Hiệu suất thuyết (mol) (mg) (mg) tế (mol) ghép (%) 1:3 3.76 3.18 1:2.69 89.68 1:7 32.38 28.8 1:4.57 65.30 1:10 16.48 13.44 1:5.13 51.33 1:14 14.8 13.44 1:5.92 42.29  Kết quả DLS, TEM của heparin-P123 Hình 3. 9: TEM và kích thước hạt của Hep-P123 (a) Hep-P123 (1:3), (b) Hep-P123 (1:7), (c) Hep-P123 (1:10), (d) Hep-P123 (1:14) Bảng 3. 5: Kết quả đường kính hạt (nm) theo DLS và TEM Nanogel DLS (nm) TEM (nm) Hep-P123-1:3 94.4 62.2 ± 19.4 Hep-P123-1:7 107.2 87.3 ± 15.1 Hep-P123-1:10 113.9 104.0 ± 15.5 Hep-P123-1:14 182.4 114.5 ± 21.7 Page | 11 Qua kết quả đo DLS và TEM ở bảng và hình trên cho thấy: - Các hạt nanogel Hep-P123 có dạng hình cầu - Kích thước hạt và sự phân b kích thước nanogel tăng khi tỉ lệ mol giữa Hep-P123 gia tăng. 3.2. KẾT QUẢ NANOGEL HEP-P123 (1:3) NANG HÓA CISPLATIN  Kết quả phổ FT-IR của nanogel Hep-P123 (1:3) nang hóa cisplatin không hydrat và cisplatin hydrat Hình 3. 10: Phổ FT-IR của heparin, Hep-P123 (1:3), Hep-P123-Cis (1:3) và Hep-P123-CisOH (1:3) Qua phổ FT-IR trên ch ng minh hợp chất Hep-P123-Cis/CisOH có sự xuất hiện đồng thời của Hep-P123, Cisplatin và Cisplatin hydrat, ch ng tỏ đã tổng hợp thành công sản phẩm Hep-P123-Cis/CisOH. Page | 12  Kết quả nang hóa cisplatin/cisplatin hydrat của Hep-P123 (1:3) theo phư ng pháp ICP Bảng 3.7: Kết quả nang hóa thu c cisplatin và cisplatin hydrat của Hep-P123 Cisplatin Tên mẫu Hep-P123 (1:3) Cisplatin hydrat %Pt[2] %cisplatin[3] %Pt(3) %cisplatin[39] (w/w) (w/w) (w/w) (w/w) 5.80 8.92 19.70 30.3 S đồ 3. 2: Phản ng tạo thành Hep-P123-CiOH  Kết quả nhả thuốc Cisplatin của hệ nano Hep-P123-CisOH (1:3) Trong điều kiện sinh lý, cisplatin bị thủy phân thành monoaquadiaquacisplatin liên kết với guanine và adenine trong ADN làm cản trở sự sao ch p của ADN. Page | 13 Hình 3.11 cho thấy h n 60% (wt / wt) CisOH trong ph c hep-P123CisOH được giải phóng sau 24 giờ trong cả hai điều kiện pH khác nhau. Đây có thể là do t c độ thủy phân nhanh của ph c chất CisOH và các nhóm anion và cũng như mạng nanogel lỏng lẻo do lượng pluronic P123 liên hợp ít. T c độ giải phóng CisOH ở pH=5.5 (81.32%) thì cao h n ở pH=7.4 (68.72%) sau 24h. Điều này chỉ ra rằng ph c hep-P123-CisOH bị thủy phân nhanh chóng trong điều kiện axit. Kết quả này sẽ có ích trong hệ th ng phân ph i thu c vì ở một s vị trí kh i u pH <6, thấp h n so với mô bình thường (pH, 7.3-7.4). Hình 3. 11: Khả năng giải phóng CisOH từ ph c hợp nano Hep-p123-CisOH ở pH = 5.5 và 7.4  Kết quả DLS, TEM của nanogel Hep-P123 (1:3) nang hóa cisplatin hydrat Hình 3.12: TEM và DLS của Hep-P123-CisOH Page | 14 Từ hình 3.12, kết quả tổng hợp nanogel Hep-P123 (1:3) nang hóa cisplatin hydrat cho thấy: kích thước hạt trung bình là 85.2 nm theo DLS, hạt có dạng hình cầu, sự phân b kích thước nanogel là 45±5nm theo TEM. KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO 3.3. Độc tính tế bào của nanogel Heparin-P123/cisplatin được thử nghiệm trên tế bào ung thư phổi ở người NCI-H460 bằng phư ng pháp SRB (Sulforhodamine B), thực hiện tại PTN Sinh học Phân tử, Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM Hình 3.13 cho thấy nanogel platin thể hiện hoạt tính c chế cao sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư phổi ở người NCI-H460. Nồng độ c chế 50% sự tăng trưởng tế bào (IC50) của Cis tự do là 0,54 ± 0,02 μg / ml. Trong khi giá trị IC50 của nanogel platin đo được ở 0,98 ± 0,02 μg / ml. Điều này có nghĩa là độ độc tế bào của CisOH được giảm đáng kể bởi sự hình thành ph c của nó và khả năng giải phóng chậm từ nanogel. Kết quả này cho thấy tiềm năng của các nanogel hep- P123 để phân ph i Cis dưới dạng hydrat. Hình 3. 13: Nghiên c u độc tính ung thư của nanogel hep-P123-CisOH (1: 3) và Cisplatin tự do Page | 15 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Nanogel Hep-P123 đã được tổng hợp thành công, các hạt nanogel Hep-P123 có dạng hình cầu, sự phân b kích thước nanogel tăng khi tỉ lệ mol giữa Hep-P123 gia tăng. - Nanogel Hep-P123 (1:3) nang hóa cisplatin hydrat cho thấy: kích thước hạt trung bình là 85.2 nm theo DLS, hạt có dạng hình cầu, sự phân b kích thước nanogel là 45±5nm theo TEM. - Đã tổng hợp thành công NPC-P123-NPC (hiệu suất đạt 100%), NPC-P123OH (hiệu suất đạt trên 99%). Tổng hợp được Hep-P123 với 4 tỉ lệ gh p khác nhau: Hep-P123 (1:3) (hiệu suất 89,68%), Hep-P123 (1:7) (hiệu suất 65,30%), Hep-P123 (1:10) (hiệu suất 51,33%), Hep-P123 (1:14) (hiệu suất 42,29%). - Hệ nanogel Hep-P123 (1:3) có hiệu quả nang hóa được một lượng lớn cisplatin hydrat (hiệu suất 30.3%) cao h n so với cisplatin không hydrat (hiệu suất 8.92%). - Khả năng nhả chậm cisplatin và t c độ nhả nhanh h n ở pH thấp h n cho thấy tiềm năng mang thu c chủ động của hệ nanogel. - Kết quả thử độc tế bào cho thấy nanogel platin thể hiện hoạt tính c chế cao sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư phổi ở người NCI-H460. Độ độc tế bào của CisOH được giảm đáng kể bởi sự hình thành ph c của nó và khả năng giải phóng chậm từ nanogel. Kiến nghị - Thực hiện thêm các thử nghiệm mang thêm một s loại thu c ch ng ung thư khác in vitro, các thử nghiệm in vitro trên các tế bào ung thư khác nhau, … - Tiếp cận các thử nghiệm in vivo, ... Page | 16 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG B Công bố quốc tế 1. Ngoc The Nguyen , Thi Hiep Nguyen, Minh Thanh Vu, Van Thu Le, Xuan Anh Nguyen, Tram Chau Nguyen Thi, Thi Bich Tram Nguyen, accept 6/2018, Novel amphiphilic heparin-pluronic P123 copolymers exhibiting a great potential for Cisplatin delivery. Journal of Materials Science. DOI: 10.1007/s10853-018-2569-9. Công bố trong nước 1. Nguyen Ngoc The, Nguyen Xuan Anh, Nguyen Van Toan, Tran Ngoc Quyen, Nguyen Thi Bich Tram, 2017, Preparation of thermosensitive heparin-pluronic P123 copolymers as potential platforms for drugs delivery. Tạp chí Hóa học. 5e3455, pp 589-592. Page | 17