Tài liệu đánh giá vai trò bảo vệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa của vi nang đông tụ alginat chitosan bao đa lớp

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẰNG ĐÁNH GIÁ VAI TRÒ BẢO VỆ VI SINH VẬT TRONG ĐƯỜNG TIÊU HÓA CỦA VI NANG ĐÔNG TỤ ALGINAT – CHITOSAN BAO ĐA LỚP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẰNG MÃ SINH VIÊN: 1501143 ĐÁNH GIÁ VAI TRÒ BẢO VỆ VI SINH VẬT TRONG ĐƯỜNG TIÊU HÓA CỦA VI NANG ĐÔNG TỤ ALGINAT – CHITOSAN BAO ĐA LỚP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS. TS. Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Khóa luận đã được thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh - Bộ môn Công nghiệp Dược. Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình. Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Đàm Thanh Xuân, người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ những ngày đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Công nghiệp Dược và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập và cuộc sống. Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Hằng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1 PHẦN 1. TỔNG QUAN ................................................................................................2 1.1. Đại cương về Probiotic........................................................................................ 2 1.1.1. Khái niệm về Probiotic ...................................................................................2 1.1.2. Các chủng probiotic phổ biến .........................................................................2 1.1.3. Vai trò của Probiotic với sức khỏe con người và ứng dụng ...........................3 1.1.4. Loài Lactobacillus acidophilus .......................................................................5 1.1.5. Xu hướng dạng chế phẩm chứa probiotic .......................................................6 1.2. Tổng quan về vi nang .......................................................................................... 8 1.2.1. Khái niệm ........................................................................................................8 1.2.2. Đặc điểm của vi nang .....................................................................................8 1.2.3. Ưu điểm và nhược điểm của vi nang ..............................................................9 1.2.4. Các phương pháp tạo vi nang .......................................................................10 1.2.5. Các nguyên liệu sử dụng để tạo vi nang .......................................................14 1.2.6. Kĩ thuật bao vi nang ......................................................................................16 1.2.7. Một số nghiên cứu tạo vi nang cải thiện khả năng sống sót của VSV trong dịch tiêu hóa mô phỏng...........................................................................................18 PHẦN 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................................................................20 2.1. Nguyên liệu và thiết bị ...................................................................................... 20 2.1.1. Chủng VSV ...................................................................................................20 2.1.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ ........................................................................20 2.1.3. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu ...................................................21 2.1.4. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu .....................................................21 2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 22 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan và calci clorid đến quá trình tạo vi nang.....................................................................................................................22 2.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp ..........................23 2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 23 2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn [2] ..........................................................................23 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào...................................................23 2.3.3. Phương pháp tạo vi nang nhân alginat [6] ....................................................24 2.3.4. Phương pháp bao vi nang [6] ........................................................................24 2.3.5. Phương pháp đông khô .................................................................................25 2.3.6. Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV [2] .......................25 2.3.7. Phương pháp phá hạt vi nang xác định số lượng VSV .................................26 2.3.8. Phương pháp xác định hình ảnh vi nang.......................................................26 2.3.9. Phương pháp định tính tinh bột bằng thuốc thử Lugol .................................26 2.3.10. Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng ...............................................................................27 PHẦN 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN..............................................29 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan và calci clorid đến quá trình tạo vi nang ....................................................................................................................... 29 3.1.1. Khảo sát nồng độ chitosan ảnh hưởng đến khả năng giữ cấu trúc của vi nang alginat – tinh bột – chitosan trong dịch tiêu hóa mô phỏng ...................................29 3.1.2. Khảo sát nồng độ calci clorid ảnh hưởng đến quá trình tạo vi nang nhân và bao vi nang ..............................................................................................................32 3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp ....................... 38 3.2.1. Tiến hành tạo vi nang alginat – chitosan bao đa lớp chứa VSV...................38 3.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp ..........................40 PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................46 4.1. Kết luận .............................................................................................................. 46 4.2. Đề xuất................................................................................................................ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... PHỤ LỤC ......................................................................................................................... DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ATCC : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture Collection) B. bifidum : Bifidobacterium bifidum B. longum : Bifidobacterium longum CFU : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony - Forming Units) CTS : Chitosan FAO : Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) kl/tt : Khối lượng/thể tích L. casei : Lactobacillus casei L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus LAB : Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacterium) LbL : Kĩ thuật bao từng lớp (Layer by Layer) MRS : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe) MT : Môi trường SGF : Dịch dạ dày mô phỏng (Simulated Gastric Fluid) SIF : Dịch ruột mô phỏng (Simulated Intestinal Fluid) TB : Tinh bột VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật WHO : Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: So sánh các phương pháp tạo vi nang chính [47] .........................................14 Bảng 2.1: Các nguyên liệu và hóa chất sử dụng............................................................20 Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng ......................................................................................20 Bảng 3.1: Các nồng độ chitosan cần khảo sát ...............................................................29 Bảng 3.2: Thời gian bắt đầu xuất hiện vết nứt và thời gian rã hoàn toàn của vi nang ủ trong môi trường dịch ruột mô phỏng ...........................................................................32 Bảng 3.3: Kết quả quá trình tạo vi nang và đánh giá khả năng rã với hai mẫu vi nang sử dụng calci clorid nồng độ 2% và 10% ......................................................................34 Bảng 3.4: Số lượng VSV trong các mẫu vi nang bao trước và sau khi ủ SGF 1 giờ ....41 Bảng 3.5: Số lượng VSV giải phóng và sống sót sau khi ủ trong dịch tiêu hóa mô phỏng tại các thời điểm khác nhau ................................................................................43 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus quan sát được dưới kính hiển vi điện tử và kính hiển vi thường [42] .............................................................................5 Hình 1.2: 3 loại vi nang chứa VSV thường gặp [46] ......................................................9 Hình 1.3: Quá trình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp tách pha đông tụ [46]. ..11 Hình 1.4: Quá trình tạo vi nang bằng phương pháp phun sấy [46] ...............................12 Hình 1.5: Mô tả quá trình tạo vi nang chứa VSV bằng phương pháp tạo nhũ tương [46].................................................................................................................................13 Hình 1.6: Cấu trúc của Alginat [40] ..............................................................................14 Hình 1.7: Cấu trúc hóa học của Chitosan và Chitin [49] ..............................................16 Hình 1.8: Sơ đồ sử dụng kĩ thuật LbL tạo màng bao đa lớp [33]..................................17 Hình 3.1: Ảnh chụp dưới camera thường các mẫu vi nang AC-0, AC-0,5, AC-3 và AC5 sau đông khô ...............................................................................................................31 Hình 3.2: Kết quả thử định tính tinh bột dịch ủ SGF sau 60 phút của các mẫu vi nang AC-0, AC-0,5, AC-3 và AC-5 (theo thứ tự lần lượt từ trái qua phải) ...........................31 Hình 3.3: Hình ảnh vi nang Agl-TB-CTS được tạo với dung dịch gel hóa là calci clorid 2% ..................................................................................................................................35 Hình 3.4: Hình ảnh vi nang Agl-TB-CTS được tạo với dung dịch gel hóa là calci clorid 10% ................................................................................................................................35 Hình 3.5: Sơ đồ quy trình tạo vi nang bao với nồng độ CaCl2 thay đổi ........................36 Hình 3.6: Hình ảnh các mẫu vi nang bao sau đông khô ................................................37 Hình 3.7: Sơ đồ các bước tạo vi nang alginat – chitosan bao đa lớp chứa L. acidophilus .......................................................................................................................................40 Hình 3.8: Biểu đồ biểu diễn số lượng VSV trong các vi nang bao trước và sau khi ủ SGF 1 giờ .......................................................................................................................41 Hình 3.9: Biểu đồ biểu diễn số lượng VSV sống sót trong dịch tiêu hóa mô phỏng ở các thời điểm khác nhau ................................................................................................44 ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho con người. Các vi sinh vật (VSV) này có thể được sản xuất dưới dạng chế phẩm probiotic hoặc được bổ sung vào thức ăn. Sự có mặt của probiotic trong đường tiêu hóa có tác dụng cạnh tranh, ức chế và loại trừ các VSV có hại trong đường ruột, duy trì hệ vi sinh đường ruột ở trạng thái cân bằng [4]. Tiềm năng điều trị của probiotic chỉ có ý nghĩa khi chúng được cung cấp vào cơ thể với một lượng đủ lớn và đảm bảo ổn định hoạt tính [11]. Tuy nhiên, khi đưa vào cơ thể theo đường uống có 2 vấn đề thường gặp phải: (i) tỉ lệ sống sót thấp khi đi qua dạ dày; (ii) số lượng VSV tiếp cận được đích tác dụng thấp [25]. Thực tế, có nhiều chủng probiotic chỉ phát huy tác dụng tối ưu nhất khi được đưa đến vị trí cuối ruột non – đầu đại tràng. Vi nang hóa sử dụng alginat – chitosan là phương pháp đang được sử dụng rộng rãi hiện nay nhằm bao gói vi sinh vật tăng cường khả năng sống sót khi đi qua vùng pH thấp ở dạ dày đồng thời có thể đưa vi sinh vật đến vị trí thích hợp trong đường ruột [13]. Xu hướng bào chế vi nang có khả năng bảo vệ vi sinh vật probiotic đồng thời kiểm soát sự giải phóng đang rất được quan tâm. Những nghiên cứu trước đây đã cho kết quả khả quan về khả năng bao gói và bảo vệ vi sinh vật sử dụng alginat – tinh bột – chitosan [6], [9]. Tiếp nối cho hướng đi tiềm năng của các nghiên cứu này, đề tài “Đánh giá vai trò bảo vệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa của vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp” được tiến hành với các mục tiêu sau: 1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan và calci clorid đến quá trình tạo vi nang. 2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp. 1 PHẦN 1. TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về Probiotic. 1.1.1. Khái niệm về Probiotic Thuật ngữ “probiotic” bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “dành cho sự sống” và cũng đã có một số ý nghĩa khác cho đến ngày nay. “Probiotic” xuất phát từ “biotic” trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là đời sống và “pro” là thân thiện, vậy ngay từ tên gọi probiotic đã có thể hiểu là thân thiện với đời sống. Ngay từ những năm đầu thế kỉ XX, khái niệm về các probiotic đã được đề cập tới trong cuốn sách “Essais optimistes” (1907) của Elie Metchnikoff (1845-1916) như là các VSV có lợi có khả năng chống lại các VSV xấu trong đường ruột và giúp con người kéo dài tuổi thọ. Nhưng phải đến năm 1965, thuật ngữ này mới được Lilley và Stillwell sử dụng lần đầu tiên để mô tả các chất tiết ra bởi một vi sinh vật có tác dụng kích thích sự phát triển của VSV khác [23]. Năm 1989, Fuller, để chỉ ra bản chất vi sinh của probiotic, đã định nghĩa lại từ này là bổ sung thức ăn vi sinh sống, cái mà tác động có lợi đến sức khỏe vật chủ bằng cách cân bằng hệ vi sinh trong đường ruột [19]. Tiếp nối những định nghĩa được đưa ra bởi cá nhân các nhà khoa học, năm 2002 Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã phát triển và đưa ra khái niệm ngắn gọn, hoàn chỉnh nhất về probiotic như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [20]. Khái niệm này được duy trì bởi Hiệp hội khoa học quốc tế về chế phẩm sinh học và Prebiotic (ISAPP) và được sử dụng trong hầu hết các ấn phẩm khoa học. 1.1.2. Các chủng probiotic phổ biến Nghiên cứu trong hai thập kỉ qua đã cung cấp bằng chứng cho thấy việc bổ sung probiotic có thể giúp tối ưu hóa hệ VSV đường ruột, ngăn ngừa và điều trị một loạt các bệnh [27]. Tuy nhiên, không phải tất các VSV có lợi đều là probiotic. Theo FAO và WHO, VSV được sử dụng làm probiotic phải có các đặc tính: (i) Có nguồn gốc từ con người, có khả năng bám chặt vào niêm mạc ruột và ngăn không cho vi khuẩn gây bệnh bám; (ii) Chống chịu được tác động của dịch dạ dày và muối mật để đến ruột. Tại ruột, probiotic phải phóng thích tốt và sản sinh nhanh chóng để phát huy tối đa tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật; (iii) Có khả năng thật sự kháng được vi khuẩn gây bệnh; (iiii) Được 2 công nhận có tác động tích cực trong chữa trị và an toàn khi sử dụng – thuộc nhóm GRAS (Generally Recognized As Safe) [20]. Hiện nay, các VSV probiotic được biết đến thường thuộc các chi: Lactobacillus, Bifidobacteria, Bacillus, Enterococcus, Saccharomyces [24]. Tuy nhiên, chiếm đa số trong tổng số chế phẩm sinh học chứa VSV probiotic hiện nay vẫn là 2 chi Lactobacillus và Bifidobacteria với các loài tiêu biểu như: L. acidophilus, L. casei, Bifidobacterium longum, B. bifidum [31]. Nhóm nấm men Saccharomyces phổ biến là loài Saccharomyces boulardii [22]. Đa số các VSV này cư trú trong đường ruột [22], được phân lập từ người và không mang yếu tố gây bệnh. Số lượng chủng VSV được sử dụng làm probiotic có xu hướng tăng lên do sự gia tăng mạnh mẽ trong nghiên cứu liên quan đến đối tượng VSV này cũng như việc phát hiện thêm nhiều chủng/loài VSV mới [10]. Do đó, việc liên tục cập nhật và theo dõi những nghiên cứu, công bố trong lĩnh vực này là cần thiết. 1.1.3. Vai trò của Probiotic với sức khỏe con người và ứng dụng Vai trò của hệ VSV đường ruột đối với sức khỏe con người ngày càng được nhận thức một cách sâu sắc. Những nỗ lực đáng kể đã được thực hiện nhằm khám phá một cách triệt để mối liên hệ giữa hệ VSV đường ruột với sức khỏe con người. Chức năng sinh lý cơ bản của hệ VSV đường ruột là: (i) chức năng bảo vệ niêm mạc ruột bao gồm ngăn ngừa các bệnh nhiễm trùng niêm mạc bằng cách ức chế các tác nhân gây bệnh xâm nhập và duy trì một hàng rào ruột nguyên vẹn; (ii) chức năng trao đổi chất bao gồm nội cân bằng năng lượng, tiêu hóa và tích lũy sinh học các chất dinh dưỡng, hỗ trợ chuyển hóa chất béo, lên men các carbohydrate không tiêu hóa được, đồng thời sản xuất các acid béo chuỗi ngắn (SCFA); (iii) chức năng điều hòa miễn dịch bao gồm điều hòa thần kinh ruột, duy trì nội cân bằng biểu mô đường ruột và điều hòa miễn dịch ở niêm mạc, trong đó hệ vi sinh vật hoạt động như một nguồn kích thích miễn dịch quan trọng [29]. Các nhà khoa học trước đây đã nhận định rằng có thể sử dụng probiotic để sửa đổi hệ thống VSV đường ruột, thay thế các VSV có hại bằng các VSV có lợi [37]. Tiềm năng của các VSV probiotic đang được khai thác mạnh mẽ bởi các nghiên cứu chứng minh vai trò và tìm cách sử dụng probiotic một cách hiệu quả nhất. Các vai trò và ứng dụng chính của probiotic thường được đề cập tới như: Chống lại tác nhân gây bệnh: Probiotic ức chế mầm bệnh bằng cách sản sinh ra các postbiotic – được định nghĩa là các chất được sản xuất ra trong giai đoạn cuối hoặc 3 trung gian của quá trình trao đổi chất ở vi khuẩn lactic [32]. Một trong những tính năng của postbiotic là làm giảm pH do đó ức chế mầm bệnh cơ hội có trong thức ăn và ruột động vật. Điển hình là bacteriocin (độc tố protein được sản xuất bởi vi khuẩn) được coi là hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, có khả năng ức chế sự phát triển của VSV gây bệnh ở cấp độ tế bào. Ngoài ra, postbiotic còn cho thấy hoạt động ức chế rộng chống lại các mầm bệnh khác nhau như Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Salmonella enterica và Escherichia coli [32]. Giảm nồng độ cholesterol trong máu: Đã có nhiều nghiên cứu khám phá về lợi ích sức khỏe to lớn này của probiotic trước đây. Năm 2002, Pereira D.I.A và Gibson G.R đã đánh giá các nghiên cứu liên quan để đưa ra kết luận chế phẩm chứa các chủng probiotic thích hợp có khả năng làm hạ cholesterol máu do đó hỗ trợ ngăn ngừa nguy cơ tim mạch [43]. Tác dụng điều hòa miễn dịch và tiềm năng điều trị bệnh viêm ruột: Karen M.L và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu đầu tiên về mối liên quan giữa probiotic với miễn dịch con người. Thông qua việc đánh giá động học và mức độ sinh IL-1β và IL10 của tế bào bạch cầu đơn nhân ở người tình nguyện khỏe mạnh trước và sau khi sử dụng men vi sinh, nghiên cứu đã cho thấy khả năng điều hòa miễn dịch của DNA VSV sau khi sử dụng men vi sinh. Từ đó khẳng định được tiềm năng điều trị viêm ruột bằng cơ chế kích thích tiết IL-10 [35]. Trước đó, cũng đã có nhiều nghiên cứu tiến hành trên động vật cho thấy, vi khuẩn lactic (LAB) có hiệu quả làm tăng số lượng tế bào lympho T, tế bào sinh kháng thể, IL-1 [41]. Phòng ngừa và điều trị bệnh tiêu chảy: Tiêu chảy là tác dụng phụ thường gặp nhất của việc sử dụng kháng sinh bao gồm cả ngắn hạn và dài hạn. Dùng đồng thời men vi sinh cho bệnh nhân đang điều trị bằng kháng sinh đã được chứng minh là làm giảm tỉ lệ mắc bệnh tiêu chảy do kháng sinh ở cả trẻ em và người lớn [27]. Thử nghiệm hiệu quả phòng và điều trị tiêu chảy do kháng sinh đã được tiến hành trên các chủng probiotic khác nhau bao gồm Lactobacillus rhamnosus GG, L. acidophilus, L. bulgaricus và nấm men [16], [17]. Tăng hấp thu lactose ở người kém dung nạp lactose: Tỷ lệ kém dung nạp lactose ở dân số người trưởng thành thay đổi từ 5-15% ở Bắc Âu và Mĩ, từ 50-100% ở các nước châu Phi, châu Á và Nam Mĩ [27]. Người ta nhận thấy rằng vi khuẩn được nuôi cấy trong sữa chua có khả năng cải thiện tình trạng kém hấp thu lactose. Điều này được giải 4 thích là do sự có mặt của enzym β-galactosidase (lactase) tiết ra từ VSV probiotic chứa trong sữa chua. Bên cạnh các tác dụng kể trên, probiotic cũng thường được biết đến với một số lợi ích khác như: ổn định chức năng hàng rào tiêu hóa, tăng cường hấp thu dinh dưỡng [24], chống béo phì, chống dị ứng… 1.1.4. Loài Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus là loài được sử dụng phổ biến nhất trong các chế phẩm probiotic hiện nay. Lactobacillus acidophilus thuộc Họ Lactobacillaceae, Chi Lactobacillus, nhóm vi khuẩn lactic (LAB), tồn tại trong đường tiêu hóa, âm đạo của người và động vật [3]. Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus quan sát được dưới kính hiển vi điện tử và kính hiển vi thường [42] L. acidophilus là trực khuẩn hình que, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, kích thước khoảng 0,6-0,9 x 1,5-6,0 µm, thường tồn tại dưới dạng đơn lẻ, xếp đôi hoặc chuỗi ngắn, không sinh bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm tính. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 37 – 42oC, và có thể phát triển ở nhiệt độ cao tới 45oC. Loài này đạt tốc độ tăng trưởng cao nhất trong môi trường hơi acid pH 5,5 – 6,0 và sự tăng trưởng dừng lại ở pH dưới 4,0 [15]. Khả năng sống sót của L. acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm: nhiệt độ, pH, nồng độ acid lactic và acid acetic, nồng độ oxy hòa tan (khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản). Do đó, số lượng L. acidophilus sống sót bị giảm đáng kể sau một thời gian bảo quản [18]. 5 L. acidophilus là probiotic đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe vật chủ. L. acidophilus có khả năng sinh acid lactic, tạo môi trường acid ức chế sự phát triển của VSV gây bệnh trong đường ruột [42]. L. acidophilus được bổ sung qua đường miệng, xuống đến ruột và định cư ở đây. Tại ruột, chúng cạnh tranh dinh dưỡng và vị trí bám trên thành ruột với các VSV có hại, ức chế sự phát triển của VSV gây bệnh Gram âm. Bên cạnh đó, L. acidophilus còn có khả năng sinh các sản phẩm như bacteriocin, lactocidin giúp kìm hãm tác nhân gây bệnh, phòng bệnh nhiễm khuẩn đường ruột, đặc biệt là tiêu chảy do sử dụng kháng sinh [42]. Ngoài ra, một số nghiên cứu đã cho thấy tác dụng tiềm năng của L. acidophilus trong việc giảm cholesterol máu giúp làm giảm nguy cơ mắc bệnh mạch vành, tăng hấp thu lactose ở những người kém dung nạp lactose. 1.1.5. Xu hướng dạng chế phẩm chứa probiotic Việc bổ sung các probiotic hàng ngày để phòng ngừa và chống lại bệnh tật đã được ứng dụng từ hàng nghìn năm trước đây. Tiêu biểu là các sản phẩm từ sữa, đây được coi một nhóm lớn các sản phẩm có khả năng mang và vận chuyển các vi khuẩn probiotic, trong số đó, sữa lên men và phô mai đuợc tiêu thụ nhiều nhất trên thế giới [4]. Thêm vào đó, một xu hướng đang được quan tâm hiện này là các dòng sản phẩm nước trái cây bổ sung probiotic do đặc tính phù hợp với đối tượng dị ứng và không dung nạp sữa, đồng thời cũng phù hợp cho nhóm đối tượng nhu cầu năng lượng thấp. Đó là các dạng sản phẩm chính bổ sung probiotic trong khẩu phần ăn hàng ngày. Đối với lĩnh vực dược phẩm, các dạng bào chế của chế phẩm có chứa probiotic được yêu cầu khắt khe hơn. Trước hết là đảm bảo VSV probiotic sống sót trong quá trình sản xuất và bảo quản. Sau đó, khi được sử dụng qua đường uống, VSV phải sống sót khi đi qua dạ dày, chịu được muối mật và đến được vị trí tác dụng [5]. Đây cũng là thách thức đối với các nhà sản xuất để cho ra đời các dạng chế phẩm probiotic ngày càng cải thiện. Tại thị trường Việt Nam hiện nay có các dạng: Thế hệ 1: Sử dụng VSV probiotic không bao, dạng bột hoặc cốm, đơn loài. Một số chế phẩm dạng này đang lưu hành tại Việt Nam như Antibio Pro hay Biobaby New. Sản phẩm Antibio Pro do công ty dược phẩm Han Wha, Hàn Quốc sản xuất với dạng bào chế gói bột pha hỗn dịch uống. Mỗi gói chứa 75 mg Lactobacillus acidophilus tương đương với 108 CFU/gói. Nhược điểm của dạng này là VSV hầu như không thể sống sót khi đi qua dạ dày và muối mật. Để hạn chế nhược điểm này, một số nhà sản xuất sử dụng vi sinh vật ở dạng bào tử, nhiều nhất là chi Bacillus. 6 Thế hệ 2: Sử dụng VSV probiotic không bao, dạng bào chế nang cứng, đơn hoặc đa loài. VSV được đưa vào dưới dạng bột đóng trong nang cứng, vẫn chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường bên ngoài và trong đường tiêu hóa khiến số lượng VSV bị suy giảm. Một số chế phẩm đang lưu hành ở Việt Nam như Probiotic Acidophilus của hãng Puritan’s Pride, Mỹ hay Biolac do công ty Vacxin và Sinh phẩm Nha Trang sản xuất. Thế hệ 3: Bao tan trong ruột. VSV chứa trong nang có lớp bảo vệ chỉ tan trong ruột, hầu hết probiotic được xử lý với một polyme acrylic acid. Tác nhân bảo vệ này chỉ được cho phép sử dụng trong dược phẩm, không thích hợp cho thực phẩm bổ sung probiotic vì có thể gây tác dụng phụ. Thế hệ 4: Vi nang hóa, tan trong ruột. Phương pháp này sử dụng chất tạo màng là các polyme có nguồn gốc tự nhiên để giúp bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi môi trường xung quanh như acid cao, pH thấp, muối mật hoặc sốc nhiệt. Chế phẩm men vi sinh dạng này có thể kể đến là Simbiosistem với sự kết hợp của 2 chủng lợi khuẩn thế hệ mới L. reuteri LRE02 và L. rhamnosus LR06. Thế hệ 5: Tạo lớp bao kép, giải phóng VSV ở ruột. Lớp bao thứ nhất – lớp trong cùng là hệ thống peptid/protein, phóng thích vi khuẩn căn cứ vào độ pH của môi trường. Nó bảo vệ vi khuẩn trong suốt quá trình tiêu hóa, giúp vi khuẩn vẫn còn sống khi đến ruột và trong điều kiện tốt vi khuẩn sẽ định cư và tăng sinh. Lớp bao thứ hai, với hệ thống polysaccharid và hydrocolloid, giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại tác động của độ ẩm, nhiệt độ, áp suất… Hai lớp bao này giúp tăng khả năng sống sót của VSV trong quá trình sản xuất và bảo quản, đồng thời kháng được acid dạ dày và muối mật, giải phóng VSV tại ruột [5]. Công nghệ bao kép này đã được công nhận và sử dụng ở một số nước trên thế giới, hiện nay trên thị trường Việt Nam có một số sản phẩm như Bifina R của hãng Morishita Jinta – Nhật Bản; Duolac của hãng Cell Biotech – Hàn Quốc. Với sự phát triển trong công nghệ sản xuất men vi sinh, phương pháp vi nang hóa, bao thêm các lớp bảo vệ đã và đang được nghiên cứu sâu rộng hơn, mang đến hiệu quả bảo vệ và tăng cường khả năng tồn tại của VSV trong chế phẩm. Đây cũng là xu hướng phát triển các chế phẩm probiotic trên toàn thế giới. 7 1.2. Tổng quan về vi nang 1.2.1. Khái niệm Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, kích thước từ 0,1 µm tới 5 mm (thông thường từ 100 đến 500 µm). Dược chất (hoặc dược chất và tá dược) được bao bởi các hợp chất cao phân tử có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp [1]. Từ quan điểm vi sinh học, vi nang hóa có thể được định nghĩa là qúa trình bẫy/bao gói các tế bào VSV bằng cách bao phủ chúng trong lõi nhân (gọi là hydrocolloid) thích hợp nhằm ngăn cách chúng với môi trường xung quanh và giải phóng các tế bào VSV tại vị trí thích hợp trong ruột [39]. Vi nang hóa probiotic là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay. Trong đó, phần nhân hay chất được bẫy là các tế bào VSV sống; phần vỏ là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose,… hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester,…tạo nên màng mỏng, bề dày từ 0,1 đến 200µm [1]. 1.2.2. Đặc điểm của vi nang Vi nang hóa là phương pháp phổ biến nhất trong nghiên cứu tạo nguyên liệu probiotic hiện nay. Vi nang chứa VSV có thể chia làm 3 loại [46] (Hình 1.2). - Hệ chứa (Reservoir): bao gồm 2 phần, phần lõi ở trong chứa VSV và phần vỏ bao bên ngoài. Hệ chứa điển hình cho vi nang tạo bởi phương pháp bao gói vi sinh vật. Ưu điểm của loại này là thường bao gói được lượng VSV đồng nhất trong các vi nang. - Matrix: chứa VSV phân tán khắp vi nang, được tạo thành từ phương pháp bẫy. Ưu điểm của vi nang dạng này là bao gói được VSV cùng cơ chất một cách chắc chắn. - Bao matrix: là vi nang dạng matrix có lớp bao phía bên ngoài. Lớp bao này có thể có nhiều vai trò khác nhau như bảo vệ nhân chứa VSV khỏi tác động từ môi trường xung quanh như ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ, khi vào cơ thể có thể bảo vệ VSV khỏi tác động của pH dạ dày, muối mật… 8 Hình 1.2: 3 loại vi nang chứa VSV thường gặp [46] Tạo vi nang bằng phương pháp bẫy có khả năng cố định được lượng tế bào lớn và chắc chắn các phương pháp khác. Mỗi loại vật liệu tạo thành vi nang và với mỗi loài VSV được bao gói đều yêu cầu phải khảo sát những yếu tố trong quá trình tạo thành vi nang như: phương pháp, nhiệt độ, thời gian, pH… để đảm bảo không ảnh hưởng đến tính chất và khả năng bảo vệ VSV của vi nang. Vi sinh vật trong vi nang được giải phóng theo các cơ chế như: gãy vỡ màng, hòa tan màng, khuếch tán qua màng, hoặc giải phóng theo cơ chế mài mòn do sự va chạm, ma sát vào nhau giữa các vi nang...[7]. 1.2.3. Ưu điểm và nhược điểm của vi nang ➢ Ưu điểm: Vi nang hóa là kĩ thuật đang được áp dụng và phát triển trong lĩnh vực tạo hệ phân phối thuốc nói chung và phân phối VSV probiotic nói riêng. Vi nang mang lại những lợi ích khác nhau, bao gồm: (i) bảo vệ hiệu quả các hoạt chất (VSV) được bao gói khỏi tác động của môi trường xung quanh; (ii) có khả năng kiểm soát giải phóng hoạt chất hiệu quả; (iii) dự đoán được quá trình giải phóng hoạt chất (VSV) [47]. Cụ thể, trong bao gói VSV probiotic vi nang có cấu tạo như một màng bán thấm hình cầu giúp tế bào được cách ly với môi trường xung quanh, bảo vệ và làm giảm sự tổn thất số lượng tế bào VSV, bằng cách này chúng sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các điều kiện bất lợi như acid cao, pH thấp, muối mật,... và chỉ giải phóng VSV tại vị trí mong muốn [30]. Vi nang hóa cho phép cố định một lượng lớn tế bào VSV. Độ bền cơ học của lớp màng bao vi nang đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và giải phóng VSV khi cần thiết. Lớp màng phải có độ bền cơ học tương đối để có thể bảo vệ được các VSV sống bên trong, tuy nhiên lại không nên quá vững chắc gây ảnh hưởng đến sự giải phóng VSV khi cần thiết [30]. ➢ Nhược điểm: 9 Các nguyên liệu polymer dùng để tạo vi nang như thạch, gelatin, tinh bột… thường là các chất VSV có thể tiêu hóa được. Do đó, trong điều kiện bảo quản không tốt, VSV được bao gói hay VSV tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm cho vi nang bị thủng, rách dẫn đến giảm hoặc mất vai trò bảo vệ của vi nang. Vì vậy, cũng cần lưu tâm đến việc lựa chọn chủng VSV và nguyên liệu thích hợp để bao gói. Bên cạnh đó, bao gói vi nang probiotic thường đòi hỏi kĩ thuật phức tạp, chi phí sản xuất cao, nguyên vật liệu an toàn. 1.2.4. Các phương pháp tạo vi nang Có nhiều phương pháp khác nhau để tạo thành vi nang probiotic. Các quá trình vi nang hóa khác nhau có thể được chia thành quá trình hóa học, hóa lý, tĩnh điện và cơ học. Về nguyên tắc, phương pháp chung chế tạo vi nang không yêu cầu những thiết bị chuyên dụng. Việc lựa chọn phương pháp chế tạo vi nang phụ thuộc vào điều kiện thực tế như độ tan, tính tương đồng, kích thước vi nang... [1]. Đối với quá trình tạo vi nang, có các phương pháp phổ biến như sau: 1.2.4.1. Phương pháp tách pha đông tụ Nguyên tắc: Các pha được tách nhờ sự thay đổi nhiệt độ, sự hóa muối hoặc khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ vi nang, làm thay đổi độ tan của polyme, dẫn đến hình thành một pha mới. Lúc này hệ trở thành hai pha, một pha có nồng độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ. Tách pha đông tụ là phương pháp lâu đời nhất và phổ biến nhất để sản xuất vi nang với hydrocolloids (ví dụ: alginat và carrageenan) bao gồm bước chuẩn bị dung dịch hydrocolloid, thêm sinh khối tế bào, nhỏ giọt vào dung dịch làm cứng (calci clorid) tạo thành các vi nang [46]. Dụng cụ tiến hành đơn giản, có thể sử dụng pipet pasteur, kim tiêm… Kích thước của vi nang phụ thuộc vào đường kính đầu pipet, kim tiêm sử dụng và khoảng cách giữa dụng cụ nhỏ với bề mặt dung dịch làm cứng (calci clorid). 10 Hình 1.3: Quá trình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp tách pha đông tụ [46]. Ưu điểm của phương pháp này dụng cụ, thiết bị rẻ tiền, đơn giản, ít gây tổn thương tế bào đảm bảo tỉ lệ sống sót cao của VSV trong quá trình tiến hành. Nhược điểm của phương pháp này là khó triển khai quy mô công nghiệp do việc hình thành vi nang diễn ra chậm. Vi nang tạo thành kích thước thường lớn (2 – 5 mm) nên không thuận tiện cho việc phát triển các dạng bào chế rắn. 1.2.4.2. Phương pháp phun sấy Phun sấy là một phương pháp thích hợp để sản xuất vi nang probiotic ở quy mô lớn. Trong đó, hệ chứa VSV (hỗn dịch) được phát tán thành dạng tia vào luồng khí áp suất cao, đi qua buồng sấy được bốc hơi dung môi rất nhanh tạo thành các vi nang khô dạng rắn chứa VSV. Các vi nang bào chế theo kỹ thuật phun sấy có dạng hình cầu và có đường kính khoảng 5 - 600 µm. Kích thước vi nang phụ thuộc vào các đặc tính của bản thân dược chất, chất mang polyme và các thông số quy trình như nhiệt độ khí vào, tốc độ cấp khí, tốc độ cấp dịch, áp lực phun, kích thước đầu phun... Các bước mô tả quá trình tạo vi nang bằng phương pháp phun sấy được thể hiện trong hình 1.4. 11 Hình 1.4: Quá trình tạo vi nang bằng phương pháp phun sấy [46] Phương pháp phun sấy được áp dụng khá rộng rãi trên quy mô sản xuất công nghiệp do giá thành không cao so với phun đông khô (spray freeze – drying), quy trình khép kín, có thể xử lý được lượng dịch lớn. Tuy nhiên, đối với vi nang chứa VSV phương pháp này cần được cân nhắc do tác động của nhiệt độ và sự mất nước nhanh chóng có thể làm giảm khả năng sống sót của VSV [39]. 1.2.4.3. Phương pháp nhũ tương hóa Trong phương pháp này, pha không liên tục là hệ phân tán của sinh khối tế bào trong dung dịch hydrocolloid và pha liên tục là dầu thực vật. Sử dụng chất nhũ để tạo thành nhũ tương nước trong dầu, khi đó các vi nang chứa VSV sẽ xuất hiện trong pha dầu do không được hòa tan [46] (Hình 1.5). Tạo vi nang bằng nhũ tương hóa là một phương pháp khá mới, tuy nhiên lại dễ nâng cấp quy mô. Nó thường được dùng để tạo vật liệu lõi vi nang bao gói/bẫy dược chất hoặc tế bào. Phương pháp này cho kích thước vi nang (25 µm – 2 mm) nhỏ hơn phương pháp tách pha đông tụ [46], tuy nhiên kích thước và hình dạng vi nang tạo thành không đồng đều. 12