Tài liệu đánh giá tỷ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa,cúm gia cầm(a h5,a h7) và một số yếu tố liên quan ở người buôn bán,giết mổ gia cầm tại các chợ ở hà nội năm 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------------- PHẠM THỊ HIỀN ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HUYẾT THANH CÓ KHÁNG THỂ KHÁNG ĐẶC HIỆU VI RÚT CÚM MÙA, CÚM GIA CẦM (A/H5, A/H7) VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN Ở NGƢỜI BUÔN BÁN, GIẾT MỔ GIA CẦM TẠI CÁC CHỢ Ở HÀ NỘI NĂM 2017 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------------- PHẠM THỊ HIỀN ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HUYẾT THANH CÓ KHÁNG THỂ KHÁNG ĐẶC HIỆU VI RÚT CÚM MÙA, CÚM GIA CẦM (A/H5, A/H7) VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN Ở NGƢỜI BUÔN BÁN, GIẾT MỔ GIA CẦM TẠI CÁC CHỢ Ở HÀ NỘI NĂM 2017 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. HOÀNG VŨ MAI PHƢƠNG PGS.TS. BÙI THỊ VIỆT HÀ Hà Nội – 2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này tôi xin trân trọng cảm ơn: Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Vi rut, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương. Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai, Viện phó Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, người đã giúp tôi có định hướng đúng đắn và phương pháp luận khoa học trong nghiên cứu. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Hoàng Vũ Mai Phương, Khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình chỉ bảo và dìu dắt tôi tới khi hoàn thiện luận văn, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có được kết quả như ngày hôm nay. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã hướng dẫn tôi kiến thức chuyên ngành hữu ích trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh Vật học, Khoa Sinh học đã nhiệt tình giảng dạy, cho tôi những kiến thức bổ ích. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, ThS. Lê Thị Thanh và các anh chị đồng nghiệp PTN Cúm, PTN Các Vi rút đặc biệt đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, ủng hộ để tôi hoàn thành khóa học này. Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2020 PHẠM THỊ HIỀN LỜI CAM ĐOAN Là thành viên trong nhóm thực hiện nghiên cứu, được sự đồng ý của trưởng nhóm nghiên cứu, tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. HỌC VIÊN PHẠM THỊ HIỀN MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN................................................................................ 3 1.1. Vi rút cúm .................................................................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm vi rút cúm .............................................................................. 3 1.1.2. Kháng nguyên và kháng thể .................................................................. 5 1.1.3. Tính đa dạng của vi rút cúm .................................................................. 7 1.1.4. Độc lực của vi rút cúm .......................................................................... 7 1.2. Nguồn lây nhiễm.......................................................................................... 9 1.3. Đường lây và cơ chế lây truyền ................................................................. 10 1.4.Phương pháp phân tíchchuẩn đoán vi rut cúm………………………………11 1.4.1. Phương pháp sinh học phân tử……………...…………………………….11 1.4.2. Phương pháp xác định trình tự gen…………………………………..11 1.4.3. Phươngpháp phân lập vi rút…………………………………………..13 1.4.4. Phươngpháp phát hiện kháng thể……………………………………13 1.5. Phòng bệnh và điều trị ............................................................................... 14 1.6. Các yếu tố liên quan tới nhiễm cúm gia cầm ............................................. 15 1.7. Tình hình nhiễm cúm tại Việt Nam và trên thế giới .................................. 17 CHƢƠNG 2 - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................ 20 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 20 2.1.1. Đối tượng ............................................................................................. 20 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 20 2.1.3. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu .................................................... 20 2.2. Phương pháp .............................................................................................. 21 2.2.1. Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HAI) ....................................... 22 2.2.2. Kỹ thuật trung hòa vi lượng ............................................................... 29 2.3. Phân tích số liệu ......................................................................................... 36 CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................... 37 3.1. Đặc điểm chung quần thể nghiên cứu và tỷ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa, vi rút cúm gia cầm A/H5 hoặc A/H7 ............ 37 3.1.1. Đặc điểm chung quần thể nghiên cứu ................................................. 38 3.1.2. Các hoạt động và kinh nghiệm làm việc của người tham gia nghiên cứu ................................................................................................................. 39 3.1.3. Các hoạt động tiếp xúc và bảo vệ cá nhân với gia cầm ốm, chết ....... 42 3.1.2. Tỉ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa .......... 45 3.1.3. Tỉ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm gia cầm A/H5 và A/H7 ................................................................................................ 48 3.2. Các yếu tố liên quan đến khả năng phơi nhiễm với vi rút cúm gia cầm ... 52 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 56 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 58 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 65 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Phân bố người tham gia nghiên cứu theo tuổi và giới (n=202) ................38 Bảng 3.2. Công việc của đối tượng nghiên cứu (n=202) ..........................................39 Bảng 3.3. Kinh nghiệm làm việc của đối tượng tham gia nghiên cứu ......................40 Bảng 3.4. Thâm niên và thời gian tiếp xúc với gia cầm (n=202) .............................40 Bảng 3.5. Người tham gia nghiên cứu tiếp xúc với gia cầm ốm chết .......................42 Bảng 3.6. Các biện pháp bảo vệ cá nhân và tần suất sử dụng khi tiếp xúc với gia cầm sống (N=202), gia cầm ốm/chết (N=46) ..............................................44 Bảng 3.7. Tỉ lệ người có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa ........................45 Bảng 3.8. Tỉ lệ người có kháng thể kháng vi rút cúm mùa theo từng phân typ ........47 Bảng 3.9. Phân bố các trường hợp dương tính với kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 và A/H7 theo huyện (N=202) ......................................................................48 Bảng 3.10. Hiệu giá kháng thể đặt hiệu kháng vi rút cúm A/H5 clade 2.3.2.1 và A/H5 clade 2.3.4.4 bằng phương pháp HI và MN ......................................48 Bảng 3.11. Số mẫu dương tính với kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 ....................51 Bảng 3.12. Sự phân bố tỉ lệ huyết thanh có kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 theo yếu tố địa điểm,tuổi, giới (N=202) ..............................................................52 Bảng 3.13. Mối liên quan giữa đặc điểm tiếp xúc với gia cầm và tình trạng huyết thanh có kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 (N=202) ..................................54 Bảng 3.14. Mối liên quan giữa loại công việc và tình trạng huyết thanh có kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 ................................................................................54 Bảng 3.15. Mối liên quan giữa việc tiếp xúc với gia cầm ốm, chết và tình trạng huyết thanh có kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 .......................................55 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Mô hình cấu trúc virion vi rút cúm ..............................................................4 Hình 1.2. Sự lưu hành của phân típ cúm A trên mỗi vật chủ ......................................9 Hình 1.3. Phân típ cúm A ( HA& NA) .....................................................................10 Hình 1.4. Vi rút cúm lưu hành theo phân typ tại miền Bắc Việt Nam, 2006-2018 ..17 Hình 2.1. Qui trình đánh giá tỉ lệ kháng huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa, cúm gia cầm (A/H5, A/H7). ..................................................21 Hình 2.2. Hình ảnh minh hoạ sự ngưng kết và không ngưng kết của hồng cầu ngựa .....................................................................................................................24 Hình 2.3. Sơ đồ các bước chuẩn độ ngược ...............................................................27 Hình 2.4 Sơ đồ thực hiện phản ứng trung hòa vi lượng ............................................32 Hình 3.1. Phân bố người tham gia nghiên cứu theo tuổi và giới ..............................39 Hình 3.2. Số ngày tiếp xúc trung bình trên một tháng ..............................................41 Hình 3.3. Tỉ lệ người có kháng thể kháng vi rút cúm mùa theo địa điểm. ...............46 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ARN Axit ribonucleic RNP Phức hợp Ribônucleo-protein CDC Centers for Disease Control and Prevention( Trung tâm phòng ngừa và kiểm soát bệnh,Mỹ) KHT Kháng huyết thanh HA Hemaglutination Assay( Phản ứng ngưng kết hồng cầu ) HI Hemaglutination Inhibition test ( Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu) TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới ( World Health Oganization ) TPCK L-1- tosyllamido-2- phenylethyl chloromethyl ketone MDCK Madin-Darby Canine Kidney Cells ( tế bào thận chó thường trực ) MỞ ĐẦU Vi rút cúm là tác nhân chính gây ra các vụ dịch cúm hàng năm tại các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới với tỷ lệ mắc và tử vong cao. Lịch sử đã ghi nhận các vụ đại dịch cúm xảy ra trong thế kỷ XX như đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 (A/H1N1), đại dịch cúm châu Á năm 1957 (A/H2N2), đại dịch cúm Hồng Kong năm 1968 (A/H3N2) và đặc biệt là đại dịch cúm A/H1N1pdm xuất hiện năm 2009 tại rất nhiều quốc gia và các vùng lãnh thổ. Chim hoang dã và thuỷ cầm (vịt, ngan, ngỗng) được chứng minh là các vật chủ lây nhiễm tự nhiên của vi rút cúm A. Do đó, vi rút cúm không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh ở mức nhẹ cho các loài này. Tuy nhiên, một số biến thể của vi rút cúm gia cầm mang độc lực cao thuộc các phân typ A/H5 hoặc A/H7 (bộ gen có sự trao đổi và tích hợp) có khả năng thành dịch bệnh. Trong quần thể gia cầm (gà, vịt, gà tây, chim cút…), vi rút có khả năng nhiễm và gây chết hoàng loạt trên đàn gia cầm, gây thiệt hại lớn cho nông dân. Qua quá trình tiếp xúc trực tiếp, vận chuyển, giết mổ gia cầm bệnh, con người có khả năng bị lây bệnh chéo thông qua hạt khí, chất thải của gia cầm, bề mặt của các dụng cụ (đồ dùng cho ăn, giết mổ) có chứa vi rút. Do vậy, nguy cơ lây nhiễm vi rút cúm từ động vật sang người luôn thường trực, đặc biệt qua quá trình tiếp xúc trực tiếp với gia cầm và thuỷ cầm bị bệnh. Tại Việt Nam, vi rút cúm A/H5N6 đã được xác định lưu hành trên gia cầm từ 2013-2014, vi rút A/H7N9 hiện tại chưa xuất hiện và cho đến nay, chưa có trường hợp nhiễm cúm A/H5N6 và A/H7N9 trên người tại Việt Nam. Tuy nhiên, việc giao thương, buôn bán gia cầm tại biên giới phía Bắc chưa được kiểm soát chặt chẽ làm nguy cơ vi rút cúm gia cầm xâm nhập vào Việt Nam từ Trung Quốc là rất cao. Việc xác định sự xuất hiện của vi rút thông qua đáp ứng kháng thể đã được thực hiện trong các năm 2011 và 2014 với sự hỗ trợ của Tổ chức Y tế thế giới. Đây là những nghiên cứu quan trọng và có ý nghĩa trong việc phát triển vacxin cúm mùa và vacxin cúm gia cầm trên người trong tương lai. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: 1 “Đánh giá tỉ lệ huyết thanh có kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm mùa, cúm gia cầm (A/H5, A/H7) và một số yếu tố liên quan ở ngƣời buôn bán, giết mổ gia cầm tại các chợ ở Hà Nội năm 2017” nhằm phát hiện và đưa ra những thông số nghiên cứu quan trọng trong công tác điều tra dịch bệnh cúm tại Việt Nam. Mục tiêu nghiên cứu: 1. Xác định một số đặc điểm của quần thể nghiên cứu, đánh giá tỉ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa, vi rút cúm gia cầm A/H5 hoặc A/H7. 2. Mô tả một số yếu tố liên quan đến khả năng phơi nhiễm với vi rút cúm gia cầm ở người buôn bán, giết mổ gia cầm tại các chợ ở Hà Nội năm 2017. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vi rút cúm 1.1.1. Đặc điểm vi rút cúm Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae. Đây là nhóm vi rút có giải phổ vật chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân nhóm khác nhau dựa trên hai loại protein bề mặt của vi rút là kháng nguyên hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Hai loại protein này có trên bề mặt capsid của hạt vi rút [41]. Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện và chia thành 4 nhóm vi rút chính gồm [53]:  Nhóm vi rút cúm A (Influenza A)  Nhóm vi rút cúm B (Influenza B)  Nhóm vi rút cúm C (Influenza C)  Nhóm Thogoto Nhóm vi rút cúm A có 18 phân típ (subtype) HA từ H1 đến H18 và 11 phân típ NA từ N1 đến N11[54] Về mặt lý thuyết, sự tái tổ hợp giữa các phân típ HA và NA sẽ tạo ra nhiều phân típ khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, vi rút cúm A có đặc tính quan trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA), hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ. Vi rút cúm A là nguyên nhân chính gây ra các đại dịch cúm trên toàn cầu. Vi rút cúm B được phân loại thành hai dòng kháng nguyên phân biệt vào những năm 1980, đó là dòng B/Victoria (B/Victoria/2/87-lineage viruses) và dòng B/Yamagata (B/Yamagata/16/88- lineage viruses) dựa trên đặc tính kháng nguyên của glycoprotein hemagglutinin bề mặt. Tương tự vi rút cúm A, cúm B có thể được phân loại thành nhóm và phân nhóm phụ. Vi rút cúm B thường thay đổi chậm hơn về dặc tính di truyền và kháng nguyên so với cúm A. Các nhóm vi rút khác nhau bởi các kháng nguyên bề mặt capsid, ở vi rút cúm A và B là Hemagglutinin (HA), ở vi rút cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở Thogotovirus là Glycoprotein (GP). Vi rút cúm B gây bệnh chủ yếu trên người và hải cẩu, vi rút cúm C gây bệnh chủ yếu trên con người và một số loài lợn. Danh pháp quốc tế qui định cho vi rút cúm A gồm những thông tin sau:A /viết tắt vật chủ( nếu là động vật)/ nơi phân lập /mã số phòng thí nghiệm phân lập/năm phân lập( có thể bao gồm thêm thông tin về phân típ HA và NA của chủng vi rút) ví dụ: A/swine/Taiwan/1/70 (H3N2)[52]. 3 Danh pháp quốc tế qui định cho vi rút cúm B gồm những thông tin sau: B/nơi phân lập/mã số phòng thí nghiệm phân lập/năm phân lập (ví dụ: B/HongKong/330/2001). Do sự thay đổi về kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm B hầu như không quan sát được nên danh pháp quốc tế của vi rút cúm B không có sự tham gia cảu kháng nguyên bề mặt HA và NA như đối với danh pháp quốc tế được qui định cho vi rút cúm A. Vi rút cúm là căn nguyên gây ra bệnh cúm, hội chứng cúm là bệnh cấp tính đường hô hấp với triệu chứng chủ yếu là sốt cao đột ngột, sổ mũi, nhức đầu, uể oải, mệt mỏi, đau toàn thân. Bệnh lây lan nhanh và có thể gây thành dịch. Nếu không được kiểm soát tốt, bệnh cúm có thể lan rộng ra nhiều nước gây đại dịch. Hình thái, cấu trúc và đặc điểm sinh học phân tử vi rút cúm: Vi rút cúm có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính trung bình từ 80 120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi kéo dài tới 2000nm. Khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Dalton. Một vi rút chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% \ carbonhydrate. a b Phức hệ Ribonucleoprotein Hình 1.1 Mô hình cấu trúc virion vi rút cúm Nguồn: http://www.nature.com/nrg/journal/v8/n3/full/nrg2053.html [28][20] Vi rút có cấu tạo gồm: vỏ (capsid), vỏ ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn, âm. Mỗi sợi ARN liên kết với các protein NP, PA, PB1, PB2 để tạo thành phức hệ ribonucleoprotein (vRNP) (mô hình a hoặc b hình 1.1) có chức năng sao chép và 4 phiên mã. Phức hệ này được bao bọc bởi màng protein nền và lớp vỏ ngoài có nguồn gốc từ màng sinh chất tế bào chủ. Vỏ vi rút có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của vi rút, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của vi rút. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vi rút, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: Haemaglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) [9]. 1.1.2. Kháng nguyên và kháng thể Các kháng nguyên quan trọng của vi rút cúm nằm ở phần lõi và phần vỏ ngoài. Phần lõi của vi rút cúm chứa một phân tử ARN và protein tương ứng với kháng nguyên S (Soluble), kháng nguyên S không có ý nghĩa với cơ chế miễn dịch bảo vệ của cơ thể. Phần vỏ ngoài chứa hai kháng nguyên quan trọng là kháng nguyên hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), đây là hai kháng nguyên quan trọng để phân loại vi rút cúm. Hai kháng nguyên HA và NA mang tính đặc hiệu típ (HA), thứ típ (NA). Hiện nay đã phát hiện được 18 cấu trúc kháng nguyên H, ký hiệu từ H1 đến H18 và 11 cấu trúc kháng nguyên N ký hiệu từ N1 đến N11[54]. Kháng nguyên hemagglutinin HA còn gọi là yếu tố ngưng kết hồng cầu (NKHC). Kháng nguyên này giúp vi rút bám vào tế bào niêm mạc đường hô hấp, gây hiện tượng hòa màng, từ đó xâm nhập vào trong tế bào. Nó có thể bám vào màng hồng cầu một số loài động vật (gà, chuột lang, ngựa...) làm những hồng cầu này bị dính lại với nhau gây nên hiện tượng ngưng kết hồng cầu mà mắt thường có thể nhìn thấy rõ ràng, nhờ đó có thể phát hiện sự có mặt của vi rút. Kháng thể tương ứng với HA có tác dụng bảo vệ cơ thể, đặc hiệu cho từng phân typ cúm. Sự có mặt của kháng thể đặc hiệu HA làm cho vi rút mất khả năng bám vào tế bào niêm mạc đường hô hấp, do đó mất hoặc giảm khả năng gây bệnh. Kháng thể tương ứng với kháng nguyên HA còn gọi là kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu (NNKHC) vì nó làm cho vi rút mất khả năng bám vào hồng cầu (ức chế hiện tượng NKHC). Dựa vào đó có thể thực hiện phản ứng NNKHC nhằm xác định sự có mặt của kháng thể đặc hiệu kháng từng phân typ vi rút cúm hoặc xác định các phân typ vi rút cúm từ 5 chủng phân lập được trên tế bào. Kháng nguyên neuraminidase NA (kháng nguyên trung hòa) có hoạt tính enzyme làm loãng chất nhầy ở đường hô hấp, làm vi rút tiếp xúc dễ dàng hơn với tế bào của niêm mạc, giúp cho vi rút xâm nhập tế bào dễ dàng. Trong quá trình nhân lên của vi rút, enzyme này giúp cho sự lắp ráp các thành phần RNA và protein của vi rút thành virion và giúp cho virion thoát ra khỏi tế bào dễ dàng thông qua hoạt tính enzyme phân tách HA khỏi các thụ thể trên bề mặt tế bào niêm mạc. Kháng thể tương ứng với kháng nguyên NA cũng có tác dụng bảo vệ cơ thể, nhưng tác dụng này không mạnh bằng tác dụng bảo vệ của kháng thể ngăn NKHC. Nếu cơ thể chỉ có kháng thể kháng N thì vẫn có khả năng mắc bệnh khi nhiễm vi rút, tuy rằng bệnh có nhẹ đi. Các phản ứng của kháng thể đối với vi rút cúm đã được nghiên cứu từ lâu dựa vào việc phân tích kháng thể được tạo ra từ tế bào B đơn của con người [33]. Khi dịch cúm xảy ra lần đầu tiên, hệ thống miễn dịch của con người chưa đáp ứng được và thành các đợt dịch lớn. Năm 2009, vi rút H1N1 theo mùa đã xuất hiện ở người nhưng vi rút này có các glycoprotein bề mặt H1 và N1 khác biệt về mặt kháng nguyên. Do thiếu khả năng miễn dịch quần thể, vi rút mới nổi này lây lan nhanh chóng trong cộng đồng. Tuy nhiên, trong vài năm, chúng đã trở thành vi rút cúm theo mùa, sau đó gây dịch bệnh với tỷ lệ tử vong thấp hơn so với đại dịch [17]. Phản ứng kháng thể do lây nhiễm tự nhiên thường rộng hơn và tồn tại lâu hơn phản ứng kháng thể do tiêm chủng gây nên, tuy nhiên cơ chế này chưa rõ ràng. Do đó, các nhà nghiên cứu tập trung nghiên cứu cơ chế này, khám phá được cơ chế này sẽ giúp cải thiện các loại vaccine hiện tại. Theo Florian K, ông đã theo dõi phản ứng của kháng thể đối với vaccine cúm hiện nay, phản ứng của kháng thể với kháng nguyên vi rút cúm gia cầm. Từ đó đưa ra sự khác biệt giữa lây nhiễm tự nhiên và tiêm chủng, khác nhau về phản ứng kháng thể mà chúng tạo ra và cách những phản ứng này bảo vệ chống lại sự lây nhiễm trong tương lai, phát triển vaccine vi rút cúm thế hệ tiếp theo [22]. Hiểu rõ hơn về cơ chế phản ứng kháng nguyên- kháng thể của vi rút cúm sẽ thúc đẩy phát triển các loại vaccine mới kháng vi rút hiệu quả hơn, nhất là trong tình trạng kháng thuốc nhiều như hiện nay. 6 1.1.3. Tính đa dạng của vi rút cúm Một đặc điểm rất quan trọng là các vi rút cúm thuộc típ A có tính đa dạng cao, khi hiện tượng trôi (drift) và trượt (shift) của kháng nguyên xảy ra, điều này giúp vi rút cúm A có khả năng thoát khỏi cơ chế bảo vệ của vật chủ [10]. Những thay đổi dần dần của kháng nguyên gọi là đặc tính trôi dạt của kháng nguyên. Nguyên nhân do các đột biến tích tụ trong quá trình sao chép làm thay đổi khả năng bám dính của phức hợp polymerae trên kháng nguyên, từ đó dẫn đến vô số biến thể mới được tạo ra, cho phép vi rút thích nghi với những thay đổi của môi trường [16]. Ngoài ra, sự trao đổi và tích hợp của vi rút cúm A (reassortant) xảy ra khi có 2 vi rút gây nhiễm trên cùng một tế bào, kết quả tạo ra vi rút mới- tiềm tàng vi rút đại dịch:  Năm 1933: lần đầu tiên phân lập được vi rút cúm, sau này được gọi là vi rút cúm A0, có công thức kháng nguyên vỏ (H0N1).  Năm 1947: xuất hiện A(H1N1).  Năm 1957: xuất hiện A(H2N2).  Năm 1968: xuất hiện A/ Hồng Kông (H3N2).  Năm 2002: xuất hiện A/Asia (H5N1) và mỗi năm đều tiếp tục có sự thay đổi ít nhiều.  Năm 2009: xuất hiện A/pandemic H1N1/09  Năm 2014: các ca nhiễm A/H5N6 tại Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Hồng Công, Myanmar và Việt Nam. Đại dịch cúm thường do vi rút cúm típ A khi có những thay đổi lớn kháng nguyên (antigenic shift) xuất hiện ở kháng nguyên của vi rút cúm A. Vi rút cúm típ B không có những thay đổi lớn kháng nguyên nhưng có thể tiến hóa bởi những thay đổi nhỏ kháng nguyên (antigenic drift) và không gây nên các vụ đại dịch nghiêm trọng. Vi rút cúm típ C gây bệnh không điển hình và chỉ giới hạn trong quần thể nhỏ, không gây dịch lan rộng. 1.1.4. Độc lực của vi rút cúm Đối với các vi rút cúm A gây bệnh trên gia cầm, độc lực của vi rút cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza), cả hai 7 loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên [21]. HPAI là loại vi rút cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 h sau nhiễm. Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Vi rút loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [7, 40]. Nhóm nghiên cứu của Abente E. J. và cộng sự đã chứng minh vi rút cúm A H5N1 mang độc lực cao vẫn là mối quan tâm trong cộng đồng do tỉ lệ tử vong cao. Nghiên cứu của nhóm đã xác định đặc tính lây nhiễm và khả năng lây truyền của H5N1 có nguồn gốc từ nhóm độc lực cao và H1N1 pdm09, từ đó nhấn mạnh tầm quan trọng việc giám sát bệnh cúm trong cộng đồng [6]. LPAI là loại vi rút khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại vi rút lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của vi rút cúm A [Error! Reference source not found., Error! Reference source not found.]. Vi rút cúm gia cầm độc lực thấp LPAI ở các loài chim hoang dã rất quan trọng vì chúng có thể tạo cơ sở cho sự phát triển của vi rút gia cầm độc lực cao HPAI hoặc hình thành các chủng vi rút có khả năng thích nghi với người với khả năng phát tác thành đại dịch [11]. Vi rút cúm A có thể biến đổi từ cúm gia cầm độc lực thấp thành vi rút ở gia cầm có độc lực cao gây tử vong. Các vi rút kháng thuốc gần đây bao gồm hầu hết cúm A H1N1 theo mùa. Từ năm 20082009, cúm A/H1N1 mang đột biên H254Y - đột biến trên gen mã hóa neuraminidase (NA) gây kháng thuốc oseltamivir (TamifluH) [27]. Nghiên cứu này đã chứng minh rằng vi rút mới có thể hình thành từ việc pha trộn một số chủng và thích nghi với các vật chủ mới, do đó ẩn chứa hiểm họa về đại dịch cúm mới. Để phân loại vi rút cúm, các thí nghiệm thực hiện gây bệnh cho gà 3-6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch. Sau dó đánh giá mức độ bệnh của gà để cho điểm (chỉ số IVPI). Điểm tối đa là 3 điểm và đó là vi rút có độc lực cao nhất. Theo quy định của Tổ chức thú y thế giới (OIE), vi rút cúm nào có chỉ số (điểm) IVPI từ 1,2 trở lên là thuộc loại có độc lực cao - HPAI và thấp hơn 1,2 là thuộc loại độc lực thấp – LPAI [35]. Các vụ dịch lớn đều do vi rút HPAI gây ra. Các loạt vi rút cúm gia cầm gây ra các vụ dịch lớn ở gia cầm thường là vi rút có kháng nguyên H5, H7 8 và H9. Riêng với H5 và H7 thường bắt nguồn từ vi rút độc lực thấp, sau quá trình lây truyền trên gà và chim cút độc lực tăng lên rất nhanh và gây ra các vụ dịch lớn. Đối với các vi rút cúm thông thường gây bệnh trên người theo mùa, các vi rút có khả năng gây đột biến trên HA, làm thay đổi khả năng bám dính với thụ thể trên tế bào chủ, gây tình trạng tăng nặng trên lâm sàng của bệnh nhân. 1.2. Nguồn lây nhiễm Qua các trường hợp bệnh được ghi nhận, nguồn truyền nhiễm của bệnh cúm bao gồm: người bị bệnh, người mang mầm bệnh không triệu chứng đối với các vi rút cúm mùa; các loại gia cầm, thủy cầm, các loại chim di cư đối với các vi rút cúm gia cầm. Chim hoang dã nhiễm cúm gia cầm nhưng không chết hàng loạt, chúng mang vi rút cúm gia cầm đi theo đường di cư. Do đó, các nhà khoa học cho rằng các loài chim hoang dã là loài phân tán vi rút cúm gia cầm (Hình 1.2). Hình 1.2. Sự lƣu hành của phân típ cúm A trên mỗi vật chủ Nguồn: Host-range-of-influenza-A-virus-Notes-The-IAV-HA-subtypes-isolatedfrom-each-host_fig1_316283274[55]. Bệnh cúm gia cầm đã được xác định nguồn lây nhiễm ban đầu là từ các loài thủy cầm di trú, đây là ổ chứa tự nhiên của vi rút, thường không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ cho chim và thuỷ cầm. Tuy nhiên chúng thường đề kháng với vi rút, chúng mang vi rút nhưng không bị bệnh, các gia cầm nuôi không đề kháng với vi 9 rút, do đó tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với chim di trú là nguyên nhân chính của dịch cúm. Vi rút cúm gia cầm có thể lây nhiễm trực tiếp cho con người khi tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh qua chăn nuôi, vận chuyển, giết mổ, chế biến, ăn gia cầm và các sản phẩm của gia cầm bệnh chưa được nấu chín hoặc chế biến không hợp vệ sinh [25]. Một số biến thể cường độc (H5, H7) xuất hiện gần đây do khả năng trao đổi và tích hợp của vi rút cúm A, có thể gây dịch cúm nguy hiểm làm chết hàng loạt cả ở chim và gia cầm [24]. Các phân typ cúm A đã được xác định các nguồn lây nhiễm cụ thể như: cúm AH1N1 xuất hiện ở người, gia cầm và lợn; cúm A H3N2 xuất hiện ở người, vịt, lợn, ngựa, cúm A H5 xuất hiện ở người, gia cầm, lợn (Hình 1.3). Hình 1.3. Phân típ cúm A (HA& NA) Nguồn: Known-hosts-for-different-HA-and-NA-influenza-A-virussubtypes_tbl1_43521028[56]. 1.3. Đƣờng lây và cơ chế lây truyền Vi rút cúm lây truyền nhanh chóng từ cơ thể bệnh sang cơ thể khỏe mạnh bằng đường hô hấp thông qua các hạt aerosol có chứa vi rút trong không khí và/hoặc qua đường tiêu hóa do tiếp xúc trực tiếp với các bề mặt (không khí, đất, 10 nước, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi bị ô nhiễm (dịch bài xuất, xác vật bệnh, chất thải) của cơ thể bệnh [7, 32]. Người chăm sóc, giết mổ, mua bán hoặc vận chuyển gia cầm là những đối tượng có nguy cơ nhiễm bệnh cao do thường xuyên tiếp xúc với các chất dịch bài tiết, chất thải của gia cầm, nhất là trong trường hợp đối tượng không có thiết bị phòng hộ, chưa có cảnh báo về dịch của các cơ quan có thẩm quyền. Vi rút cúm có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng vi rút. Các vi rút cúm gia cầm độc lực thấp không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng độc lực cao (H5, H7) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm trên gia cầm, có thể lây sang người [47]. Với hàng rào vật chủ, vi rút cúm gia cầm chưa thể lây lan mạnh từ gia cầm sang người. Tuy nhiên, khi vi rút cúm gia cầm lây bệnh và thích nghi trên vật chủ là lợn, nơi tế bào hô hấp có cả 2 loại thụ thể α2,3 và α2,6, thì khi ấy khả năng vi rút cúm gia cầm lây lan rộng là có thể xảy ra. 1.4. Phƣơng pháp phân tích chuẩn đoán vi rút cúm 1.4.1. Phương pháp sinh học phân tử Phản ứng PCR/RT-PCR: Vi rút có vật liệu di truyền là ARN cần enzyme phiên mã ngược để tổng hợp cADN và ADN polymerase tổng hợp ADN từ cADN. Vi rút có vật liệu di truyền là ADN cần enzyme ADN polymerase để tổng hợp ADN. Ưu điểm của phương pháp này là có khả năng xác định nhanh sự nhiễm vi rút thông qua khả năng phát hiện đoạn ADN/ARN đặc hiệu trong mẫu bệnh phẩm. Phản ứng Realtime PCR/RT-PCR: sử dụng cặp mồi và chất hóa học phát huỳnh quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang cho phép phát hiện chính xác số bản sao ADN/ARN của vi rút trong mẫu bệnh phẩm theo thời gian thực. Ưu điểm của phương pháp là theo dõi tiến trình phản ứng và biết được lượng ADN tạo thành ở từng thời điểm, độ nhạy, độ chính xác, độ đặc hiệu cao, giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm. 11