Tài liệu đánh giá hiệu quả ngoại kiểm phết máu ngoại biên tại trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học đại học y dược thành phố hồ chí minh

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ------------ CAO THỊ BÍCH NHƢ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ NGOẠI KIỂM PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN TẠI TRUNG TÂM KIỂM CHUẨN CHẤT LƢỢNG XÉT NGHIỆM Y HỌC - ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ------------ CAO THỊ BÍCH NHƢ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ NGOẠI KIỂM PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN TẠI TRUNG TÂM KIỂM CHUẨN CHẤT LƢỢNG XÉT NGHIỆM Y HỌC - ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. NGUYỄN TRƢỜNG SƠN 2. TS. LÊ HOÀNG OANH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng chúng tôi. Các số liệu nghiên cứu sử dụng, các tài liệu trích dẫn là hoàn toàn trung thực và tuân theo đúng yêu cầu của một đề tài nghiên cứu. Đề tài này chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn CAO THỊ BÍCH NHƢ . . MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 4 1.1. LỊCH SỬ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN............ 4 1.2. CHUẨN BỊ PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN .................................................................. 4 1.2.1. Máu để dàn lame ............................................................................................... 4 1.2.2. Lame kính và Lame kéo .................................................................................... 4 1.2.3. Cách dàn tiêu bản .............................................................................................. 5 1.2.4. Nguyên nhân làm lame phết máu không đạt yêu cầu ...................................... 5 1.2.5. Để lame phết máu khô trƣớc khi nhuộm ........................................................... 6 1.3. QUY TRÌNH NHUỘM PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN .............................................. 6 1.3.1. Nguyên tắc ........................................................................................................ 6 1.3.2. Quy trình nhuộm ............................................................................................... 7 1.3.3. Một số lƣu ý ...................................................................................................... 7 1.3.4. Nguyên nhân sai lầm ........................................................................................ 8 1.4. ĐÁNH GIÁ PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN .................................................................. 9 1.4.1. Khảo sát với vật kính 10x ............................................................................... 8 1.4.2. Khảo sát với vật kính 40x ................................................................................ 9 1.4.3. Khảo sát với vật kính 100x .............................................................................. 9 1.4.4. Đánh giá phết máu ngoại biên........................................................................... 9 1.5. HÌNH THÁI TẾ BÀO DÒNG HỒNG CẦU TRÊN PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN.......................................................................................................................... 10 1.5.1. Hồng cầu bình thƣờng ..................................................................................... 10 1.5.2. Hồng cầu bất thƣờng về kích thƣớc ................................................................ 10 1.5.3. Hồng cầu bất thƣờng về hình dạng ................................................................. 11 1.5.4. Hồng cầu bất thƣờng về màu sắc .................................................................... 13 1.5.5. Các thể bất thƣờng trong hồng cầu ................................................................. 15 1.6. HÌNH THÁI TẾ BÀO DÒNG BẠCH CẦU TRÊN PHẾT MÁU NGOẠI . . i BIÊN.......................................................................................................................... 16 1.6.1. Bạch cầu……………………………………………………………………..16 1.6.2. Bạch cầu hạt trung tính (Neutrophil) .............................................................. 17 1.6.3. Bạch cầu hạt ái toan (Eosinophil) ................................................................... 18 1.6.4. Bạch cầu hạt ái kiềm (Basophil) ..................................................................... 19 1.6.5. Bạch cầu lympho (Lymphocyte) ..................................................................... 19 1.6.6. Bạch cầu mono (Monocyte) ............................................................................ 20 1.7. HÌNH THÁI TẾ BÀO DÒNG TIỂU CẦU TRÊN PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN......................................................................................................................... 21 1.7.1. Tiểu cầu bình thƣờng ...................................................................................... 21 1.7.2. Tiểu cầu bất thƣờng về số lƣợng ..................................................................... 21 1.7.3. Tiểu cầu bất thƣờng về kích thƣớc .................................................................. 22 1.8. BẤT THƢỜNG KHÁC ..................................................................................... 22 1.9. NGOẠI KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG XÉT NGHIỆM (EQA) ............................... 22 1.9.1. Định nghĩa về ngoại kiểm tra chất lƣợng ........................................................ 22 1.9.2. Một số khái niệm về quản lý chất lƣợng ......................................................... 22 1.9.3. Các phƣơng thức ngoại kiểm tra ..................................................................... 24 1.9.4. Qui trình thực hiện ngoại kiểm tra chất lƣợng ................................................ 25 1.9.5. Tầm quan trọng của ngoại kiểm tra chất lƣợng xét nghiệm ........................... 27 1.9.6. Phƣơng pháp đánh giá kết quả ngoại kiểm chƣơng trình định tính ................ 29 1.10. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC VỀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG NGOẠI KIỂM ....................................................................................... 30 1.10.1. Trên thế giới .................................................................................................. 30 1.10.2. Ở Việt Nam ................................................................................................... 31 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 33 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................... 33 2.1.1. Dân số mục tiêu ............................................................................................... 33 2.1.2. Dân số nghiên cứu ........................................................................................... 33 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 33 . . 2.1.4. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................... 33 2.1.5. Tiêu chuẩn chọn mẫu ...................................................................................... 33 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................... 34 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ......................................................................................... 34 2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ......................................................................................... 34 2.2.3. Các bƣớc tiến hành .......................................................................................... 34 2.2.4. Tiêu chí đánh giá ............................................................................................. 39 2.2.5. Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu .......................................................... 41 2.2.6. Kiểm soát sai lệch ........................................................................................... 42 2.2.7. Vấn đề y đức ................................................................................................... 42 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................. 43 3.1. ĐỘ ỔN ĐỊNH VÀ ĐỒNG NHẤT CỦA CÁC MẪU ĐƢỢC SẢN XUẤT ..... 43 3.1.1. Độ đồng nhất của mẫu lame ngoại kiểm phết máu ngoại biên ....................... 43 3.1.2. Độ ổn định của mẫu ngoại kiểm phết máu ngoại biên .................................... 44 3.2. PHÒNG XÉT NGHIỆM THAM GIA TRONG CHƢƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN ........................................................................... 45 3.3. ĐÁNH GIÁ XẾP LOẠI PHÒNG XÉT NGHIỆM THAM GIA CHƢƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN QUA 4 ĐỢT ĐẦU 2018 ....................... 45 3.4. ĐÁNH GIÁ DÒNG BẠCH CẦU QUA 4 ĐỢT ĐẦU NĂM 2018 ................... 47 3.5. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ NGOẠI KIỂM DÒNG HỒNG CẦU QUA 4 ĐỢT ĐẦU 2018 ................................................................................................................. 51 3.6. ĐÁNH GIÁ DÒNG TIỂU CẦU QUA 4 ĐỢT ĐẦU 2018 ............................... 53 3.7. THEO DÕI DIỄN TIẾN KẾT QUẢ SAU KHI TÁC ĐỘNG HỖ TRỢ KHẮC PHỤC CỦA CÁC PHÒNG XÉT NGHIỆM XẾP LOẠI “KHÔNG ĐẠT” QUA CÁC ĐỢT NGOẠI KIỂM PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN........................................... 54 3.7.1 Tác động của ngoại kiểm tra chất lƣợng lên dòng bạch cầu ............................ 54 3.7.2. Tác động của ngoại kiểm tra chất lƣợng lên dòng hồng cầu .......................... 58 3.7.3. Tác động của ngoại kiểm tra chất lƣợng lên dòng tiểu cầu ........................... 59 . . 3.8. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ NGOẠI KIỂM TRONG THỜI GIAN THEO DÕI CỦA 2 ĐỢT CUỐI NĂM 2018 VÀ ĐỢT 1 NĂM 2019 ......................................... 60 3.9. ĐÁNH GIÁ SO SÁNH KẾT QUẢ NGOẠI KIỂM PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN NĂM 2018 VÀ ĐỢT 1 NĂM 20191 ........................................................................ 62 3.10. CÁC THÀNH PHẦN THƢỜNG SAI LỆCH TRONG ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN .................................................................................... 65 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ...................................................................................... 66 4.1. PHÒNG XÉT NGHIỆM THAM GIA ...................................................................... 67 4.2. ĐÁNH GIÁ XẾP LOẠI PHÒNG XÉT NGHIỆM THAM GIA CHƢƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN QUA 4 ĐỢT ĐẦU 2018 .......... 68 4.3. ĐÁNH GIÁ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ NGOẠI KIỂM DÒNG BẠCH CẦU ........ 70 4.4. ĐÁNH GIÁ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ NGOẠI KIỂM DÒNG HỒNG CẦU.......... 74 4.5. ĐÁNH GIÁ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ NGOẠI KIỂM DÒNG TIỂU CẦU ............ 76 4.6. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG CỦA CÁC PHÒNG XÉT NGHIỆM THAM GIA SAU TÁC ĐỘNG HỖ TRỢ KHẮC PHỤC CỦA NGOẠI KIỂM TRA PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN............................................................................................................ 78 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN ...................................................................................... 84 CHƢƠNG 6: KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC HÌNH ẢNH PHIẾU THU THẬP DỮ LIỆU NGHIÊN CỨU XÁC NHẬN DANH SÁCH PHÒNG XÉT NGHIỆM THAM GIA CHƢƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN . i. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Việt BC: Bạch cầu CLXN: Chất lƣợng xét nghiệm HC: Hồng cầu KQXN: Kết quả xét nghiệm KTCL: Kiểm tra chất lƣợng NCV: Nghiên cứu viên NK: Ngoại kiểm PMNB: Phết máu ngoại biên PXN: Phòng xét nghiệm TB: Trung bình TC: Tiểu cầu TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam TP.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh TTKCCLXNYH: Trung Tâm Kiểm Chuẩn Chất Lƣợng Xét Nghiệm Y Học Tiếng Anh AV: Assigned Value (Giá trị chuẩn) BASO: Basophil (Bạch cầu hạt ái kiềm) EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid EOS: Eosinophil (Bạch cầu hạt ái toan) EQA: External Quality Assessment (Ngoại kiểm tra chất lƣợng) GLP: Good Laboratory Practice (Thực hành tốt phòng xét nghiệm) IQC: Internal Quality Control (Nội kiểm tra chất lƣợng) ISO: International Organization for Standardization (Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế) LYM: Lymphocyte (Bạch cầu Lympho) . . i MONO: Monocyte (Bạch cầu Mono) NEU: Neutrophil (Bạch cầu hạt trung tính) NRBC: Nucleated Red Blood Cell (Hồng cầu nhân) QA: Quality Assurance (Đảm bảo chất lƣợng) QC: Quality Control (Kiểm soát chất lƣợng) QM: Quality Management (Quản lý chất lƣợng) SD: Standard Deviation (Độ lệch chuẩn) SDI: Standard Deviation Index (Chỉ số độ lệch chuẩn) SOP: Standard Operating Procedures (Quy trình làm việc chuẩn) WHO: World Health Organization – Tổ chức Y Tế thế giới . . ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số quy trình nhuộm phết máu ngoại biên……………..……………..7 Bảng 1.2. Thang điểm đánh giá kích thƣớc và hình dạng hồng cầu trên phết máu ngoại biên theo Kathy W Jones (2009)…………………………...……..............…11 Bảng 1.3. Thang điểm đánh giá mức độ nhƣợc sắc của hồng cầu trên phết máu ngoại biên theo Kathy W Jones (2009) ….………………………………………...14 Bảng 1.4. Thang điểm đánh giá mức độ hồng cầu đa sắc trên phết máu ngoại biên theo Kathy W Jones (2009)……………………………………...…………...…….15 Bảng 1.5. Số lƣợng và tỷ lệ các thành phần bạch cầu trong máu ngoại vi theo Bộ Y Tế (2003)…………………………………………………………………..……….16 Bảng 2.1. Tiêu chuẩn đánh giá chất lu ợng phết máu ngoại biên………………...35 Bảng 2.2. Thang đánh giá kích thƣớc và hình dạng hồng cầu trên phết máu ngoại biên theo Kathy W Jones (2009)…………………………………………….….….39 Bảng 2.3. Thang đánh giá mức độ nhƣợc sắc của hồng cầu trên phết máu ngoại biên theo Kathy W Jones (2009)…………………………………………………..…….39 Bảng 2.4. Thang điểm tiêu chuẩn WHO về đánh giá hình thái…………………....40 Bảng 2.5. Thang điểm tiêu chuẩn WHO về đánh giá xếp loại…………………......40 Bảng 3.1. Độ đồng nhất của mẫu lame ngoại kiểm phết máu ngoại biên..........…...43 Bảng 3.2. Độ ổn định của mẫu ngoại kiểm phết máu ngoại biên……...…………..44 Bảng 3.3. Nhóm phòng xét nghiệm tham gia theo phân hạng bệnh viện của Bộ Y Tế …………...…………………………………………………………………………45 Bảng 3.4. Đánh giá xếp loại các phòng xét nghiệm tham gia qua 4 đợt đầu năm 2018…...……………………………………………………………………………46 Bảng 3.5. Phòng xét nghiệm cần theo dõi thành phần bách phân bạch cầu qua 4 đợt đầu năm 2018…..…………………………………………………………..............49 Bảng 3.6. Đánh giá hiệu quả tác động của chƣơng trình ngoại kiểm phết máu ngoại biên…………...………………………..…………………………………………...60 Bảng 3.7. Đánh giá xếp loại phòng xét nghiệm tham gia ........................…………62 Bảng 3.8. Thành phần sai lệch trong đánh giá phết máu ngoại biên....…….……...65 . . DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ Sơ đồ 2.1: Sơ đồ các bƣớc tiến hành nghiên cứu…………………………………..38 Biểu đồ 3.1. Đánh giá kết quả ngoại kiểm của các phòng xét nghiệm tham gia qua 4 đợt ngoại kiểm PMNB................................................……………………………..45 Biểu đồ 3.2. Kết quả ngoại kiểm về bách phân thành phần bạch cầu của đợt 1………………………………………………………………………………….....47 Biểu đồ 3.3. Kết quả ngoại kiểm về bách phân thành phần bạch cầu của đợt 2………………………………………………………………………………….…48 Biểu đồ 3.4. Kết quả ngoại kiểm về bách phân thành phần bạch cầu của đợt 3………………………………………………………………………………….…48 Biểu đồ 3.5. Kết quả ngoại kiểm về bách phân thành phần bạch cầu của đợt 4………………………………………………………………………………….....49 Biểu đồ 3.6. Kết quả không đạt của thành phần bách phân bạch cầu qua 4 đợt ngoại kiểm đầu năm 2018……………………….……………………………………..…50 Biểu đồ 3.7. Tỷ lệ đạt về kết quả phân tích hình thái dòng hồng cầu qua 4 đợt đầu ngoại kiểm PMNB năm 2018………….…………………………………………..51 Biểu đồ 3.8. Kết quả không đạt về hình thái hồng cầu qua 4 đợt đầu năm 2018………………………………………………………………………………...52 Biểu đồ 3.9. Tỷ lệ đạt về kết quả phân tích hình thái dòng tiểu cầu qua 4 đợt ngoại kiểm PMNB đầu năm 2018………………………………….…………………......53 Biểu đồ 3.10. Kết quả không đạt về hình thái tiểu cầu qua 4 đợt đầu năm 2018………………………………………………………………………………...54 Biểu đồ 3.11. Theo dõi diễn tiến kết quả Neutrophil của phòng BS011, BS016, BS033……………...……………………………………………………………….55 Biểu đồ 3.12. Theo dõi diễn tiến kết quả Eosinophil của phòng BS012, BS027, BS032 và BS33………...…………………………………………………………..56 Biểu đồ 3.13. Theo dõi diễn tiến kết quả Basophil của phòng BS013, BS026 và BS034…………………………………...………………………………………….57 . . Biểu đồ 3.14. Theo dõi diễn tiến kết quả Lymphocyte của phòng BS009, BS016, BS030 và BS033…………………………………………...………………………58 Biểu đồ 3.15. Theo dõi diễn tiến kết quả các thành phần hình thái dòng hồng cầu………………………………………………………………………………….58 Biểu đồ 3.16. Theo dõi diễn tiến kết quả ngoại kiểm các thành phần dòng tiểu cầu…………………………………………...……………………………………..59 Biểu đồ 3.17. Đánh giá hiệu quả tác động của chƣơng trình ngoại kiểm phết máu ngoại biên…………………………………..………..……………………………..60 Biểu đồ 3.18. Đánh giá hiệu quả tác động của chƣơng trình ngoại kiểm lên đánh giá dòng hồng cầu………………………………………….…...……………………...61 Biểu đồ 3.19. Đánh giá hiệu quả tác động của chƣơng trình ngoại kiểm lên đánh giá dòng tiểu cầu…………………………………...………………….……………….62 Biểu đồ 3.20. Đánh giá xếp loại phòng xét nghiệm tham gia năm 2018…………………..…………………………………………………………….63 Biểu đồ 3.21. Đánh giá xếp loại phòng xét nghiệm tham gia năm 2018 và đợt 1 năm 2019……………………………………………..……………………….…………64 . . 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Phết máu ngoại biên là một trong những kỹ thuật xét nghiệm cơ bản và đƣợc sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới để khảo sát hình thái học các thành phần tế bào máu ngoại vi cũng nhƣ phát hiện những bất thƣờng hiện diện trên phết máu ngoại biên dƣới kính hiển vi quang học [3]. Ở nƣớc ngoài, chƣơng trình ngoại kiểm phết máu ngoại biên đã đƣợc triển khai rộng rãi nhất là ở các nƣớc Châu Âu [44], [45], [54]. Phết máu ngoại biên đƣợc chỉ định khi nghi ngờ có các bệnh lý về huyết học hay các bệnh lý ở các cơ quan khác ảnh hƣởng đến các tế bào máu nhƣ tăng hay giảm số lƣợng bạch cầu, giảm số lƣợng tiểu cầu, khảo sát mảnh vỡ hồng cầu hay tìm ký sinh trùng sốt rét… Tại Việt Nam, phết máu ngoại biên là một xét nghiệm cơ bản đƣợc ứng dụng cho hầu hết các bệnh viện cũng nhƣ các cơ sở y tế. Tuy nhiên vẫn chƣa có sự thống nhất về kỹ thuật cũng nhƣ kết quả hình thái học của tế bào phết máu ngoại biên ở các nơi thực hiện đặc biệt là tại bệnh viện tuyến tỉnh cũng nhƣ các phòng xét nghiệm vừa và nhỏ vì đa số đƣợc thực hiện thủ công nên đòi hỏi kiến thức và kỹ năng tốt của kỹ thuật viên khi thao tác. Do đó, sai số là một nguy cơ hoàn toàn có thể xảy ra nếu chúng ta không có quy trình kiểm soát chất lƣợng nghiêm ngặt. Do đó, để thực hiện tốt công tác đảm bảo chất lƣợng xét nghiệm, Bộ Y Tế đã ban hành những quy định bắt buộc các phòng xét nghiệm hƣớng theo tiêu chí đánh giá mức chất lƣợng phòng xét nghiệm, Quyết định 2429, Quyết định 4858, Thông tƣ 01/2013/TT-BYT ngày 11/01/2013, phải kiểm soát chất lƣợng thông qua hoạt động nội kiểm tra và ngoại kiểm tra, trong đó ngoại kiểm tra đƣợc thực hiện từ các trung tâm kiểm chuẩn chất lƣợng bên ngoài nhằm phát hiện sai số từ đó xác định nguyên nhân, khắc phục sai số để nâng cao chất lƣợng xét nghiệm [7], [8], [9], [11]. Với sự ra đời và phát triển của Trung tâm kiểm chuẩn chất lƣợng xét nghiệm y học, chất lƣợng xét nghiệm ngày càng đƣợc nâng cao hơn. Hiện nay, ngày càng có nhiều PXN trực thuộc các bệnh viện từ tuyến Trung ƣơng, tuyến tỉnh, tuyến địa . . 2 phƣơng cùng với các PXN trực thuộc tƣ nhân tham gia chƣơng trình ngoại kiểm chất lƣợng xét nghiệm [6], [19], [20]. Trung tâm kiểm chuẩn chất lƣợng xét nghiệm y học - Đại học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh đã và đang triển khai nhiều chƣơng trình ngoại kiểm tra chất lƣợng và có những thành công nhất định trên nhiều lĩnh vực nhƣ huyết học, vi sinh, sinh hóa, miễn dịch...Và đƣợc sự nhất trí của Bộ Y Tế, Đại học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh, tại hội nghị “ Triển khai tiêu chí đánh giá mức chất lƣợng phòng xét nghiệm, thực hiện liên thông công nhận kết quả xét nghiệm”, Trung tâm kiểm chuẩn chất lƣợng xét nghiệm y học Đại học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh đã từng bƣớc triển khai chƣơng trình ngoại kiểm phết máu ngoại biên đầu tiên và đã có đề tài nghiên cứu sản xuất mẫu để giúp các phòng xét nghiệm có cái nhìn tổng quan về chất lƣợng xét nghiệm và sự cần thiết của ngoại kiểm trong kiểm soát chất lƣợng xét nghiệm phết máu ngoại biên [15], [16], [17], [18]. Hiện nay, với số lƣợng PXN tham gia chƣơng trình ngoại kiểm ngày càng tăng đòi hỏi trung tâm phải tăng cƣờng kiểm soát và đánh giá thƣờng xuyên hiệu quả mà ngoại kiểm phết máu ngoại biên mang lại, đồng thời phát hiện ra nguy cơ, sai số, yếu tố ảnh hƣởng đối với PXN tham gia từ đó kiến nghị, hỗ trợ kịp thời cho PXN. Vì lý do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá hiệu quả ngoại kiểm phết máu ngoại biên tại Trung Tâm Kiểm Chuẩn Chất Lượng Xét Nghiệm Y Học - Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh” . . 3 CÂU HỎI NGHIÊN CỨU Hiệu quả của chƣơng trình ngoại kiểm phết máu ngoại biên tại Trung tâm kiểm chuẩn chất lƣợng xét nghiệm y học - Đại học Y Dƣợc TP.HCM và chất lƣợng phết máu ngoại biên của các phòng xét nghiệm tham gia chƣơng trình ra sao? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu tổng quát: Đánh giá hiệu quả xét nghiệm phết máu ngoại biên của các phòng xét nghiệm tham gia thông qua kết quả ngoại kiểm tại Trung Tâm Kiểm Chuẩn Chất Lƣợng Xét Nghiệm Y Học - Đại học Y Dƣợc Thành Phố Hồ Chí Minh từ khi chƣơng trình triển khai đến nay. Mục tiêu cụ thể: 1. Khảo sát tình hình thực hiện ngoại kiểm phết máu ngoại biên của các phòng xét nghiệm tham gia. 2. Đánh giá kết quả phân tích dòng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu của mẫu lame ngoại kiểm phết máu ngoại biên. 3. Đánh giá hiệu quả ngoại kiểm phết máu ngoại biên mang lại cho các phòng xét nghiệm tham gia. . . 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. LỊCH SỬ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN Vào thế kỷ XVII, Antonie van Leeuwenhoek là ngƣời đầu tiên mô tả các tế bào máu bằng chế phẩm máu mà không phải là phết máu bởi vì kính hiển vi thời kỳ này chƣa phát triển. Vào thế kỷ XIX, sự phát triển của kính hiển vi quang học đã giúp cho sự nghiên cứu tế bào máu bằng cách phết lƣợng ít máu trên mặt kính trƣợt, sấy khô, cố định và sau đó nhuộm màu. Paul Ehrlich giới thiệu Eosin nhƣ là chất nhuộm phết máu ngoại biên đầu tiên vào năm 1856, sau đó là Hematoxylin năm 1865, trễ hơn là nhuộm Romanowsky. Năm 1902, James Homer giới thiệu phƣơng pháp nhuộm Wright dựa trên sự sửa đổi từ phƣơng pháp nhuộm Romanowsky. Phƣơng pháp này giúp phân biệt rõ các tế bào máu và trở thành phƣơng pháp nhuộm rộng rãi. Đến năm 1979, Wiltin giới thiệu dung dịch nhuộm Wright hòa tan có 2 loại dung dịch riêng biệt và trong đó Giemsa Plus Stain Kit là một phƣơng thức sửa đổi của công thức này tạo ra các đặc tính thuốc nhuộm có thời gian nhuộm còn 15 giây, cho phép xác định nhanh. Tuy có sự cải thiện về chất lƣợng thuốc nhuộm, quy trình nhuộm nhƣng các thành tố cơ bản về chuẩn bị và phân tích vẫn không thay đổi trong cho đến nay [1], [55], [66]. 1.2. CHUẨN BỊ PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN 1.2.1. Máu để dàn lame Máu để dàn lame là máu mao mạch hay tĩnh mạch có chống đông EDTA hay có thể sử dụng máu toàn phần đƣợc lấy trực tiếp từ vết chích đầu ngón tay thứ 3 hoặc thứ 4 bàn tay trái hay gót chân đối với trẻ sơ sinh [2], [72]. 1.2.2. Lame kính và Lame kéo Muốn có tiêu bản đẹp phải dùng lame kính mới hoàn toàn. Nếu sử dụng lame kính cũ (tái sử dụng) thì lame kính có thể dính dầu mỡ và gây loang khi kéo [2], [72]. . . 5 Lame kéo đầu phải thật mịn. Nên sử dụng lame kéo chuyên dụng hoặc dùng lame kính mới làm lame kéo nhƣng phải chọn lame có đầu thật mịn hay mài thật nhẵn [2], [72]. 1.2.3. Cách dàn tiêu bản Lấy một lƣợng máu rất ít khoảng một giọt máu để dàn vì nếu không làn máu sẽ rất dầy và không thể quan sát [2], [72]. Nhỏ máu một đầu (2/3) lame kính hay cách đầu lame khoảng 2cm. Một tay cầm lame kính đã có giọt máu, còn tay kia cầm lame kéo đặt trƣớc giọt máu. Nghiên lame kéo một góc khoảng 30 độ về phía giọt máu và kéo lùi lame kéo đến khi chạm phải giọt máu, để cho giọt máu lan tỏa ra hai bên cạnh của lame máu và cách mép lame khoảng 1 cm sau đó đẩy về phía trƣớc. Tốc độ đẩy phải vừa phải, nếu đẩy quá nhanh tiêu bản máu dàn sẽ ngắn và dầy, nếu đẩy quá chậm tiêu bản máu dàn sẽ dài và tạo thành các lớp sóng. Cầm lame kéo tạo một góc khoảng 30-45 độ so với lame kính, đẩy nhẹ về phía đến gần cuối lame hơi chếch lame kéo lên tạo đuôi tiêu bản dạng lƣỡi bò (lƣỡi mèo) [2], [72]. Ghi mã số, thông tin đầy đủ ở phần dày của lame kính, phía trƣớc chỗ đặt giọt máu [2], [72]. Làn máu mỏng đạt yêu cầu: Làn máu phải mỏng đều, không có vết sọc ngang, dọc, không loang lổ [2], [72]. Làn máu có đuôi mỏng: Xem kính hiển vi thấy hồng cầu xếp cạnh nhau chứ không chồng lên nhau và cũng không cách xa nhau [2], [72]. 1.2.4. Nguyên nhân làm lame phết máu không đạt yêu cầu Giọt máu lấy quá nhiều hay quá ít: Tiêu bản không có đuôi máu hay không đạt yêu cầu. Góc độ kéo quá lớn hay quá nhỏ: Làn máu sẽ ngắn và dày hay kéo đến hết lame máu vẫn còn, không tạo đƣợc đuôi dạng lƣỡi mèo. Máu trải không đều, tạo răng cƣa trên làn máu mỏng: Cạnh lame kéo máu không phẳng hoặc tiếp xúc giữa cạnh lame kéo máu và lame kính đựng máu không khít. . . 6 Tốc độ kéo máu không đều, ngập ngừng hoặc máu bắt đầu đông: Tiêu bản sẽ có những vệt dày, sọc. Giọt máu kéo nhanh khi chƣa lan đến mép lame: Làn máu có bề ngang hẹp và dày. Tiêu bản có chỗ trống hoặc lỗ chỗ: Lame kính bẩn, dính dầu mỡ hoặc ruồi, gián ăn [2], [26], [72]. 1.2.5. Để lame phết máu khô trƣớc khi nhuộm Lame máu phải thật khô khi nhuộm để phết máu dàn không bị bong tróc, tế bào máu đẹp. Sau khi kéo lame, để phết máu dàn thật khô mới cố định. Sau khi cố định để thật khô mới tiến hành nhuộm tiêu bản. Nên để khô tự nhiên, nếu độ ẩm quá cao, thời tiết ẩm nên hơ nhanh qua ngọn lửa đèn cồn (không hơ trực tiếp làm teo tế bào) hay để trong tủ ấm 37 độ đến khi lame khô hoàn toàn [2], [72]. 1.3. QUY TRÌNH NHUỘM PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN 1.3.1. Nguyên tắc Nhuộm Wright là phƣơng pháp nhuộm tiêu bản nhiều màu, bao gồm: Methylic, Methylen Blue và Eosin. Methylic để cố định làn máu làm cho làn máu gắn chặt với lame kính. Những phần tử ƣa acid bắt màu eosin có màu hồng đến vàng nhạt. Những phần tử trung tính bắt màu tím. Methylen Blue giúp nhuộm màu những phần tử kiềm của tế bào chất (từ xanh nhạt đến xanh đậm). Những phần tử acid bắt màu eosin (từ màu hồng đến vàng nhạt) [2], [56]. Nhuộm Giemsa bao gồm các thành phần: Methylen Blue, azure B và Eosin. Trong quá trình nhuộm, azure B (trimethylthionine) và Methylen blue sẽ liên kết với các phân tử anion và eosin (tetrabromofluorescein) sẽ liên kết với các phân tử cation trên protein. Vì vậy, những thành phần tế bào có tính acid sẽ bắt màu đỏ của eosin và thành phần có tính kiềm sẽ bắt màu xanh tím đến xanh của azure B và Methylene blue [36]. . . 7 Nhuộm Wright- Giemsa là phƣơng pháp nhuộm tiêu bản nhiều màu, bao gồm Methylen Blue và các sản phẩm oxy hóa của nó, azure B, Eosin Y. Thuốc nhuộm Eosin nhuộm màu phần tử acid của tế bào, thuốc nhuộm Methylen Blue và các sản phẩm oxy hóa của nó, azure B nhuộm màu phần tử kiềm của tế bào [47]. 1.3.2. Quy trình nhuộm Bảng 1.1. Một số quy trình nhuộm phết máu ngoại biên Các bƣớc nhuộm Nhuộm Wright Nhuộm Giemsa Nhuộm Wright- [2] [56] [36], [57]. Giemsa [47] Bƣớc 1 Cố định bằng cồn Cố định bằng cồn Cố định bằng cồn tuyệt đối trong 30 tuyệt đối trong 30 tuyệt đối trong 30 giây, để khô tự giây, để khô tự giây, để khô tự nhiên. Bƣớc 2 nhiên. nhiên. Cho vào Wright Cho vào Giemsa Cho vào Wrightnguyên chất trong 10% trong 10 phút. Giemsa tỷ lệ 1:1 Bƣớc 3 Bƣớc 4 2 phút. trong 4 phút. Cho vào dung dịch Cho vào dung dịch đệm pH 6,4 trong 3 đệm pH 7,4 trong phút. 12 phút. Rửa dƣới vòi nƣớc, Rửa dƣới vòi nƣớc, Rửa dƣới vòi nƣớc, để khô. để khô. để khô. 1.3.3. Một số lƣu ý Trong quá trình cố định làn máu: Dùng cồn 90 độ hay cao hơn để cố định vì cồn có tác dụng đẩy nƣớc bên trong tế bào ra bên ngoài mà không làm biến dạng tế bào. Nếu sử dụng cồn thấp độ sẽ không đẩy hoàn toàn nƣớc trong tế bào ra ngoài nên khi nhuộm tế bào sẽ biến dạng. Trong quá trình rửa tiêu bản: Nên rửa dƣới vòi nƣớc chảy nhẹ để tránh làm bong tiêu bản. Phải rửa bằng phƣơng pháp đuổi tức là dùng nƣớc để tẩy thuốc nhuộm ra chứ không đƣợc đổ hóa chất trên lame đi trƣớc khi xả nƣớc vì nhƣ vậy sẽ làm cặn bám lại trên tiêu bản gây nhầm lẫn khi quan sát. Sau khi rửa xong phải để . . 8 khô tự nhiên, mặt làn máu quay xuống để tránh bụi. Chỉ khi nào tiêu bản thật khô mới soi dƣới kính hiển vi hoặc cất bảo quản trong hộp đựng tiêu bản [2]. 1.3.4. Nguyên nhân sai lầm Lame máu dàn quá dày, thời gian nhuộm quá lâu, rửa không đủ sạch, thuốc nhuộm, dung dịch đệm hay nƣớc rửa quá kiềm làm tiêu bản nhuộm quá xanh : điều chỉnh bằng cách nhỏ từng giọt acid acetic 1% hay acid chlohydric 1% vào dung dịch đệm Wright. Thuốc nhuộm, dung dịch đệm hay nƣớc rửa quá acid làm làn máu nhuộm quá acid : điều chỉnh bằng cách nhỏ từng giọt potassium bicarbonat 1% vào thuốc nhuộm Wright. Rửa lâu, nhuộm thiếu thời gian, dung dịch đệm quá nhiều làm lame máu dàn có màu nhạt. Làn máu bị trôi một phần hay toàn bộ do rửa dƣới vòi nƣớc quá mạnh, làn máu chƣa để khô hoàn toàn trƣớc khi nhuộm. Rửa lame máu không kỹ hay nhuộm Wright ở nơi có gió mạnh, thuốc nhuộm Wright bốc hơi nhanh làm làn máu có cặn. Một lame máu đã phai màu có thể phục hồi bằng cách rửa với Methylic 95% và rửa trở lại với nƣớc thƣờng, để khô, nhuộm lại với thuốc nhuộm Wright [2]. 1.4. ĐÁNH GIÁ PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN 1.4.1. Khảo sát với vật kính 10x Bƣớc 1: Xác định tổng quan chất lƣợng làn máu. Bƣớc 2: Xác định sự phân bố các tế bào trên làn máu, xem các góc cạnh làn máu và phần giữa tiêu bản để đảm bảo không có đám HC, đám BC hay đám TC. Bƣớc 3: Tìm khu vực tối ƣu để xác định và đếm các thành phần tế bào máu. Chọn phần mỏng của làn máu (phải chiếm ít nhất 1/3 toàn bộ làn máu) nơi tế bào HC nằm rời nhau, không có tế bào bị vỡ hay cặn. Cần tránh vùng thân làn máu vì thƣờng có tỷ lệ lymphocyte tăng và các rìa của làn máu vì các tế bào không điển hình có tỷ lệ bạch cầu hạt và monocyte tăng cao. Theo Bain BJ (2016), có khoảng 50% số lƣợng bạch cầu tập trung ở vùng rìa và đuôi làn máu [32], [36], [62]. .