Tài liệu đánh giá biểu hiện gen wt1 trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy trước và sau điều trị tấn công tại bệnh viện truyền máu huyết học thành phố hồ chí minh

. BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --------------------------------- PHAN THỊ THU LÝ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN GEN WT1 TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY TRƢỚC VÀ SAU ĐIỀU TRỊ TẤN CÔNG TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ------------------------ PHAN THỊ THU LÝ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN GEN WT1 TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY TRƢỚC VÀ SAU ĐIỀU TRỊ TẤN CÔNG TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.BS. PHAN THỊ XINH TS.BS. NGUYỄN ĐÌNH TUYẾN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả là hoàn toàn trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tác giả luận văn PHAN THỊ THU LÝ . . LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ tận tình từ thầy cô, gia đình, bạn bè. Nhân đây, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS. Phan Thị Xinh-Trƣởng khoa Di truyền học-Phân tử, Bệnh viện Truyền Máu-Huyết Học thành phố Hồ Chí Minh, giảng viên Bộ môn Huyết học, khoa Y, Đại học Y Dƣợc thành phố Hồ Chí Minh; TS.BS Nguyễn Đình Tuyến giám đốc bệnh viện sản Nhi Quảng Ngãi là thầy, cô đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể các cán bộ Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là PGS.TS.Vũ Quang Huy-Trƣởng Bộ môn Xét nghiệm, Khoa Điều dƣỡng-Kỹ thuật y học, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện để tôi có thể lĩnh hội những kiến thức quý giá về ngành kỹ thuật xét nghiệm y học trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại trƣờng. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, ngày .... tháng .... năm 2019 Học viên PHAN THỊ THU LÝ . . MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... i DANH MỤC THUẬT NGỮ VIỆT - ANH ..................................................... iii DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. v DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ............................................................................... v ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 MỤC TI U NGHI N CỨU.............................................................................. 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4 1.1. Tổng quan về bệnh bạch cầu cấp dòng tủy ............................................ 4 1.2. Bất thƣờng gen WT1 (Wilms tumor) trong BCCDT ........................... 12 1.3. Vai trò của gen ABL trong phản ứng định lƣợng gen WT1 ................. 15 1.4. Các kỹ thuật theo dõi BTLTT.............................................................. 16 1.5. Tình hình nhiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam .............................. 21 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU .............. 24 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................... 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................... 25 2.3. Phƣơng pháp thu thập số liệu .............................................................. 35 2.4. Biến số nghiên cứu .............................................................................. 36 2.5. Phƣơng pháp phân tích dữ liệu: ........................................................... 36 2.6. Đạo đức trong nghiên cứu ................................................................... 36 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ ................................................................................. 38 3.1. Quy trình phản ứng RQ-PCR .............................................................. 38 . . 3.2. Kết quả đánh giá biểu hiện gen WT1 trên bênh nhân ......................... 45 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN .............................................................................. 55 4.1. Quy trình phản ứng RQ-PCR .............................................................. 55 4.2. Đánh giá biểu hiện gen WT1 trên bệnh nhân ....................................... 58 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 65 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 66 . . DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Việt BCCDT Bạch cầu cấp dòng tủy BCCDL Bạch cầu cấp dòng lympho BTLTT Bệnh tồn lƣu tối thiểu BVTMHH Bệnh viện Truyền máu Huyết học DAMD Dấu ấn miễn dịch NST Nhiễm sắc thể TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh ALL Acute Lymphoblastic Leukemia AML Acute Myeloid Leukemia AML1-ETO Acute Myeloid Leukemia 1 gene-Eight Twenty One CBF Core binding factor CBFB-MYH11 Core-binding factor, beta subunit-Myosin heavy chain 11 cDNA Complementary DNA CEBPA CCAAT/enhancer binding protein-α Ct Threshold cycle DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucelside triphosphate DTT Dithiothreitol FAB French-American-British FISH Fluorescence in situ hybridization FLT3 Fms-related tyrosine kinase 3 HTL Human T leukemia virus ITD Internal tandem duplication . . JM juxtamembrane LAP Leukemia-associated phenotype MLL Mixed Lineage Leukemia MRD Minimal residual disease NPM1 Nucleophosmin PCR Polymerase Chain Reaction PML-RARA Promyelocytic Leukemia-Retinoic Acid Receptor RQ-PCR Real time quantitative-Polymerase Chain Reaction RTK Receptor tyrosine kinase RT-PCR Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction TCR T-cell receptor TKD Tyrosine kinase domain WHO World health organization WT1 Wilms tumor 1 . .i DANH MỤC THUẬT NGỮ VIỆT - ANH Tiếng Việt Tiếng Anh Bạch cầu cấp dòng lympho Acute Lymphoblastic Leukemia Bạch cầu cấp dòng tủy Acute Myeloid Leukemia Yếu tố gắn lõi Core binding factor DNA bổ sung Complementary DNA Chu kỳ ngƣỡng Threshold cycle Pháp-Mỹ-Anh French-American-British Lai tại chỗ gắn huỳnh quang Fluorescence in situ hybridization Bệnh tồn lƣu tối thiểu Minimal residual disease PCR định lƣợng Real time quantitative-Polymerase Chain Reaction PCR phiên mã ngƣợc Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction Thụ thể tế bào T T-cell receptor Tổ chức Y tế thế giới World health organization . . DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2. 1. Thành phần tham gia phản ứng PCR tạo dòng .............................. 28 Bảng 2. 2. Thành phần tham gia phản ứng ligation ........................................ 30 Bảng 2. 3. Các đoạn mồi và probe dùng trong nghiên cứu............................. 32 Bảng 2. 4.Thành phần phản ứng Real-time PCR ............................................ 33 Bảng 2. 5. Các biến số nghiên cứu đƣợc thu thập trƣớc và sau điều trị ......... 36 Bảng 3. 1. Kết quả đo mật độ quang các mẫu DNA plasmid ......................... 40 Bảng 3. 2. Tạo dãy nồng độ pha loãng............................................................ 42 Bảng 3. 3. Phƣơng trình đƣờng chuẩn ............................................................ 45 Bảng 3. 4. Bản sao ABL phản ánh chất lƣợng mẫu nghiên cứu ...................... 46 Bảng 3. 5. Kết quả định lƣợng gen WT1 và ABL trƣớc và sau điều trị tấn công . 47 Bảng 3. 6. Biểu hiện gen WT1 ở bệnh nhân BCCDT ..................................... 49 Bảng 3. 7. Kết quả biểu hiện quá mức gen WT1 ở bệnh BCCDT lúc chẩn đoán theo các bất thƣờng gen................................................................................... 50 Bảng 3. 8. Kết quả hai trƣờng hợp không biểu hiện gen WT1 quá mức ......... 52 Bảng 3. 9. Biểu hiện gen WT1 trƣớc và sau điều trị tấn công theo các bất thƣờng gen thƣờng gặp ................................................................................... 53 Bảng 3. 10. Kết quả đáp ứng về sinh học phân tử của 6 trƣờng hợp thuộc nhóm khác ....................................................................................................... 54 . . DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. 1. Sơ đồ cấu trúc của WT1 ................................................................. 13 Hình 1. 2. Nguyên lý của phƣơng pháp PCR .................................................. 18 Hình 1. 3. Minh họa đƣờng biểu diễn khuếch đại của phản ứng RQ-PCR .... 20 Hình 1. 4. Minh họa real-time PCR sử dụng Taqman probe .......................... 21 Hình 3. 1. Minh họa điện di sản phẩm thử điều kiện nhiệt độ lai mồi. .......... 38 Hình 3. 2. Minh họa kết quả tạo dòng T-vector gen WT1. ............................. 39 Hình 3. 3. Phản ứng RQ-PCR với nhiệt độ lai mồi và probe 62oC................. 43 Hình 3. 4. Phản ứng RQ-PCR với nhiệt độ lai mồi và probe 60oC. .............. 43 Hình 3. 5. Đƣờng chuẩn khảo nghiệm ABL. .................................................. 44 Hình 3. 6. Đƣờng chuẩn khảo nghiệm WT1. .................................................. 44 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2. 1. Quy trình thực hiện ....................................................................... 27 . . ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy là một trong những bệnh ung thƣ phổ biến trên thế giới, đặc trƣng bởi sự tăng sinh các tế bào dòng tủy chƣa trƣởng thành [1], [56]. Biểu hiện của bệnh là xuất huyết, sốt, nhiễm trùng và hội chứng thâm nhiễm. Hầu hết các trƣờng hợp mắc bệnh đều không có nguyên nhân rõ ràng. Tuy nhiên một số nghiên cứu đã chỉ ra mối liên quan giữa tỉ lệ mắc bệnh và các yếu tố liên quan nhƣ nhiễm phóng xạ, tiếp xúc với hóa chất, hoặc kèm theo các mắc bệnh khác nhƣ thiếu máu Fanconi hay hội chứng Down. Ngoài ra, bệnh bạch cầu cấp dòng tủy phát sinh do thay đổi bất thƣờng tế bào gốc tạo bạch cầu, làm rối loạn quá trình sản sinh bạch cầu tạo ra tế bào bạch cầu bất thƣờng. Sự bất thƣờng này làm mất chức năng bảo vệ cơ thể dẫn đến tỉ lệ tử vong cao nếu không đƣợc chuẩn đoán, điều trị kịp thời và hiệu quả. Phần lớn bệnh nhân sẽ đƣợc điều trị tấn công trong thời gian đầu phát hiện bệnh. Tuy nhiên, tỉ lệ tồn lƣu tế bào ác tính cao sau điều trị dẫn đến nguy cơ tái phát cao. Nên việc tìm ra các dấu ấn cho phép dự đoán tái phát, đáp ứng điều trị và hƣớng dẫn can thiệp điều trị là rất cần thiết. Các dấu ấn đƣợc sử dụng để theo dõi điều trị (hay theo dõi bệnh tồn lƣu tối thiểu-MRD) trong bạch cầu cấp dòng tủy chủ yếu là các bất thƣờng di truyền thƣờng gặp nhƣ PML/RARA, AML1/ETO, CBFB/MYH11 hay MLL/AF9. Đối với những bệnh nhân không mang các bất thƣờng di truyền thƣờng gặp cần có một chỉ dấu sinh học khác để theo dõi hiệu quả điều trị. Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng mức độ biểu hiện gen WT1 thấp hay cao đi kèm với mức độ lui bệnh hay tái phát tƣơng ứng [14]. Gen WT1 là một gen ức chế khối u, nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 11. Đây là gen liên quan đến sinh bệnh học của bệnh bạch cầu khi ngăn chặn sự phát triển và biệt hóa của tế bào bằng cách ngăn chặn sự nhân đôi. Ở ngƣời bình thƣờng gen WT1 có biểu hiện rất thấp trong tủy xƣơng và không . . tìm thấy ở máu ngoại vi [14], [69]. Trong khi đó, trên ngƣời bệnh bạch cầu cấp dòng tủy, gen này biểu hiện cao trong cả tủy xƣơng và ở máu ngoại vi với tỉ lệ cao, lên đến trên 90% bệnh nhân [14]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tiên lƣợng ở bệnh nhân ung thƣ máu liên quan nghịch với biểu hiện của WT1 [18], [43]. Do đó, sự biểu hiện quá mức của WT1 trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy có thể đại diện cho một dấu ấn độc lập theo dõi bệnh tồn lƣu tối thiểu. Nồng độ WT1 biểu hiện thấp hay cao của nó đi kèm với tỉ lệ lui bệnh và tái phát tƣơng ứng. Vậy nên, WT1 là một yếu tố tiên lƣợng quan trọng và là mục tiêu theo dõi điều trị trong bạch cầu cấp dòng tủy. Hiện nay, các phác đồ điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng tủy trên thế giới đều cho rằng theo dõi bệnh tồn lƣu tối thiểu là một phần không thể thiếu. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen WT1 là một tiêu chuẩn độc lập để theo dõi điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng tủy sau giai đoạn tấn công. Việc theo dõi bệnh tồn lƣu tối thiểu bằng mức độ biểu hiện gen WT1 đƣợc thực hiện bởi kỹ thuật real time PCR. Đây là một kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao, chuyên biệt để xác định chính xác số bản sao của gen. Tại Việt Nam, các bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy trong quá trình điều trị đƣợc theo dõi bệnh tồn lƣu tối thiểu bằng các kỹ thuật nhƣ tế bào dòng chảy, PCR tổ hợp gen đặc hiệu. Tuy nhiên, hiện chƣa có nghiên cứu nào khảo sát biểu hiện của gen WT1 và theo dõi bệnh tồn lƣu tối thiểu dựa vào biểu hiện của gen này ở bệnh bạch cầu cấp dòng tủy. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Đánh giá biểu hiện gen WT1 trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy trƣớc và sau điều trị tấn công tại bệnh viện Truyền máu huyết học Thành phố Hồ Chí Minh” nhằm hỗ trợ cho bác sĩ lâm sàng đánh giá lui bệnh, phát hiện sớm tái phát bệnh và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp cho bệnh nhân. . . MỤC TI U NGHI N CỨU Mục tiêu tổng quát - Xác định mức độ biểu hiện gen WT1 trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy trƣớc và sau điều trị tấn công bằng kỹ thuật Realtime – PCR. Mục tiêu chuyên biệt - Thiết lập quy trình kỹ thuật Real time - PCR định lƣợng gen ABL và gen WT1. - Xác định số bản sao của gen ABL và gen WT1 trên bệnh nhân BCCDT tại thời điểm chẩn đoán và sau khi điều trị tấn công. . . CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về bệnh bạch cầu cấp dòng tủy 1.1.1. Sơ lƣợc về bệnh Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) là bệnh lý ác tính bởi sự tăng sinh và tích lũy trong tủy xƣơng và máu ngoại vi những tế bào máu ác tính. Bệnh đặc trƣng bởi hiện tƣợng tăng sinh không kiểm soát đƣợc của các tế bào ác tính dòng bạch cầu [1], [56], [90]. Hậu quả là các tế bào này lấn áp các dòng tế bào bình thƣờng trong tủy, xâm lấn các cơ quan khác và lan tràn ra máu ngoại vi. Bệnh BCCDT lần đầu tiên đƣợc Velpeau ngƣời Pháp mô tả vào năm 1827 qua một ngƣời bán hoa 63 tuổi mang một căn bệnh đặc trƣng tiến triển bởi sốt, suy nhƣợc, gan to, lách to. Đến năm 1856, thuật ngữ “bệnh bạch cầu” đƣợc đặt ra bởi Rudolf Virchow, nhà bệnh lý học nổi tiếng ngƣời Đức. Năm 2012 tỉ lệ mắc bệnh BCCDT trên toàn thế giới là 351.965 ngƣời và tỉ lệ nam, nữ tƣơng đƣơng 1,4. Trong khi đó, số liệu thống kê năm 2014 tại Hoa Kỳ có khoảng 18.860 ngƣời mắc bệnh, trong đó có khoảng 10.460 ngƣời chết vì căn bệnh này. Độ tuổi mắc bệnh trung bình là 66 tuổi [83]. Bệnh BCCDT chiếm khoảng 80% bạch cầu cấp ở ngƣời lớn, 15-20% BCCDT ở trẻ em [1]. Nguyên nhân gây bệnh còn chƣa đƣợc biết rõ, tuy nhiên có một số yếu tố đƣợc coi là yếu tố thuận lợi cho quá trình phát sinh và phát triển BCCDT nhƣ: yếu tố tia xạ, hóa chất, virus, di truyền, thuốc và phơi nhiễm nghề nghiệp... Tia xạ: có thể gây tổn thƣơng vật liệu di truyền hoặc gây suy giảm miễn dịch. Hoá chất: phơi nhiễm với nhóm Benzen, các tác nhân alkyl hoá, chất dẻo, sản phẩm dầu hỏa, kim loại nặng... có liên quan đến việc tăng tỉ lệ mắc bệnh. . . Virus: virus HTL1, HTL2 (Human T leukemia virus) có thể gây bạch cầu cấp tế bào T ở ngƣời. Virus EBV (Ebstein-Barr virus) gây u Burkitt (u ác tính dòng B lympho). Yếu tố di truyền: có một số bệnh di truyền làm tăng nguy cơ nhƣ bệnh Down, thiếu máu Fanconi, các bệnh thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh (bệnh thất điều giãn mao mạch, hội chứng Wiskott-Aldrich). Về phân loại bệnh: Bệnh BCCDT đƣợc phân loại theo hệ thống phân loại Pháp-Mỹ-Anh (FAB) và hệ thống của Tổ chức Y tế thế giới (WHO). Theo hệ thống phân loại FAB (French-American-British) dựa trên đặc điểm hình thái và hóa học tế bào, bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy đƣợc chia thành 8 nhóm [1] [2]: M0 (bệnh bạch cầu dòng tuỷ chƣa biệt hoá hoặc biệt hóa rất ít); M1 (immature myeloblastic-bệnh bạch cầu cấp nguyên tủy bào kém biệt hóa); M2 (mature myeloblastic-bệnh bạch cầu cấp nguyên tủy bào); M3 (promyelocytic-bệnh bạch cầu cấp tiền tủy bào); M4 (myelomonocytic-bệnh bạch cầu cấp dòng tủy-mono); M5 (monocytic-bệnh bạch cầu cấp dòng mono); M6 (erythrokemia-bệnh bạch cầu cấp dòng hồng cầu); M7 (megakaryocytic-bệnh bạch cầu cấp dòng mẫu tiểu cầu). Hệ thống phân loại này đƣợc sử dụng phổ biến vì cách phân loại dựa trên hình thái tế bào, đơn giản, dễ xác định. Tuy nhiên, còn nhiều hạn chế vì mang tính chất chủ quan, có những trƣờng hợp bệnh nhân không biểu hiện rõ ràng nên không thể phân loại đƣợc. Theo WHO, năm 2001, bệnh BCCDT đƣợc phân loại dựa trên một số tiêu chí: tỉ lệ các tế bào blast (tế bào máu chƣa trƣởng thành); hình thái học tế bào; di truyền học tế bào; di truyền học phân tử; dấu ấn miễn dịch. . . Ví dụ nhƣ dựa vào mức độ tế bào blast, 20% blast trong tủy xƣơng hoặc trong máu ngoại vi đƣợc coi là ngƣỡng cho chẩn đoán. Về chẩn đoán: Xét nghiệm máu bào gồm huyết đồ, phết máu ngoại vi, sinh hóa, đông máu. Kháng nguyên hòa hợp tổ chức (HLA) cần phải thực hiện ngay lúc chẩn đoán ở những bệnh nhân có khả năng tiếp nhận ghép tế bào gốc đồng loại. Tủy đồ và sinh thiết tủy: phân loại FAB, thực hiện hóa tế bào, xác định dấu ấn miễn dịch tế bào, phân tích nhiễm sắc thể và xác định đột biến nhiễm sắc thể với các kỹ thuật sinh học phân tử [3]. 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh Khởi phát và tiến triển của bệnh BCCDT là do nhiều đột biến liên tiếp nhau, làm biến đổi các chức năng tế bào, làm thoát khỏi sự kiểm soát tăng sinh bình thƣờng, ngăn chặn sự biệt hóa của tế bào và đề kháng lại chu trình chết bình thƣờng của tế bào. Trong hầu hết các trƣờng hợp bạch cầu cấp, tế bào đầu dòng tạo máu có những thay đổi di truyền mắc phải. Đột biến bao gồm về số lƣợng và cấu trúc nhiễm sắc thể. Nhƣ chuyển đoạn (trong hầu hết các trƣờng hợp bất thƣờng), đảo đoạn, mất đoạn, đột biến điểm và khuếch đại gen. Cơ chế bao gồm sự biểu hiện bất thƣờng của các protein sinh ung thƣ do sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể gây ra. Sự tăng sinh không kiểm soát đƣợc các tế bào đầu dòng tạo máu chƣa trƣởng thành trong tủy xƣơng dẫn đến sự đàn áp các tế bào máu bình thƣờng gây ra thiếu máu, giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu hạt và thâm nhiễm các cơ quan khác nhƣ: gan, lách, hạch, thần kinh, xƣơng khớp [1], [2]. 1.1.3. Các bất thƣờng gen, tổ hợp gen thƣờng gặp trong BCCDT Các bất thƣờng di truyền thƣờng gặp trong BCCDT liên quan đến các tái sắp xếp NST cân bằng của yếu tố phiên mã trong quá trình tạo máu hoặc . . mất hoặc thêm NST, các đột biến gen và tổ hợp gen thƣờng gặp FLT3, NPM1, CEBPA, PML-RARA... [7]. Tổ hợp gen PML-RARA: Bạch cầu cấp tiền tủy bào thể M3 chiếm khoảng 10-15% trong nhóm BCCDT. Đây là thể bệnh đặc trƣng bởi chuyển vị t(15;17)(q24;q21) tạo thành tổ hợp gen PML-RARA gặp trong 98% các trƣờng hợp [29]. Những bệnh nhân mang tổ hợp gen này có tiên lƣợng tốt và việc theo dõi BTLTT dựa trên khảo sát tổ hợp gen này. BCCDT-CBF: BCCDT liên quan đến CBF(BCCDT-CBF) đặc trƣng bởi một trong hai kiểu chuyển vị t(8;21) và inv(16), tạo ra các tổ hợp gen lần lƣợt là AML1-ETO và CBFB-MYH11. BCCDT-CBF là phân nhóm di truyền thƣờng gặp nhất, với cả hai loại bất thƣờng t(8;21) và inv(16) chiếm khoảng 15-20% trƣờng hợp BCCDT ngƣời lớn mới chẩn đoán và thƣờng xảy ra ở bệnh nhân trẻ tuổi. Các tổ hợp gen này cũng đƣợc coi là dấu ấn độc lập để theo dõi BTLTT [25]. Chuyển vị t(8;21) gặp trong BCCDT thể M2, trong khi đó CBFBMYH11 liên quan đến BCCDT thể M4 kèm tăng eosinophil. Các protein tổ hợp này ức chế chức năng của phức hợp RUNX1/CBFβ nguyên gốc theo cách ức chế âm tính trội bằng cách cạnh tranh để bắt cặp không tƣơng đồng và/hoặc gắn DNA vào các vị trí gắn Runx DNA [28]. Protein tổ hợp RUNX1-ETO tạo ra các phức hợp ức chế phiên mã và ngoại gen, dẫn đến sự im lặng các gen đích của con đƣờng ngoại gen nhƣ PTEN, Bcl-2, CEBPA, ARF và PSGL-1 [68]. Có nhiều bệnh nhân thuộc nhóm BCCDT-CBF nhỏ hơn 60 tuổi, trong đó những bệnh nhân mang inv(16) thƣờng lớn tuổi hơn bệnh nhân mang t(8;21). Những bệnh nhân mang t(8;21) có số lƣợng bạch cầu và tỉ lệ tế bào non trong tủy xƣơng cao hơn và xâm lấn ngoài tủy nhiều hơn [10]. Bệnh nhân nhóm BCCDT-CBF đƣợc báo cáo có khả năng đáp ứng tốt với điều trị . . cytarabine-anthracycline trong giai đoạn tấn công và đạt lui bệnh hoàn toàn khoảng 80-90% các trƣờng hợp. Tuy nhiên, khoảng 40-45% bệnh nhân BCCDT-CBF ngƣời lớn tái phát và thậm chí tử vong do bệnh [10]. Đột biến mất chức năng của RUNX1 đƣợc tìm thấy liên quan đến bệnh bạch cầu, cũng nhƣ các đột biến sai nghĩa, vô nghĩa hoặc lệch khung ở vùng gắn DNA và vùng đầu tận C dẫn đến sự tạo thành các protein bị thiếu tất cả hoặc một phần vùng hoạt hóa dạng trans. Một nghiên cứu trên BCCDT ngƣời Úc và Đức [37] đã tìm thấy đột biến RUNX1 trong 5,6% trƣờng hợp, trong khi đó nghiên cứu trên ngƣời Đài Loan [79] đã báo cáo tỉ lệ cao hơn (13,2%) ở những trƣờng hợp BCCDT chẩn đoán mới, và tần xuất đột biến tăng lên dần theo tuổi. Đột biến RUNX1 chủ yếu gặp ở nhóm bệnh nhân có bất thƣờng NST thuộc nguy cơ trung bình hơn là nhóm tiên lƣợng tốt gồm cả t(8;21), và liên quan nhiều đến BCCDT thể M0. Sự hiện diện của đột biến RUNX1 liên quan đến kháng hóa trị liệu (tỉ lệ kháng là 30%), với thời gian sống không sự kiện, không tái phát và thời gian sống toàn bộ thấp hơn [37]. Tuy nhiên, tiên lƣợng của bệnh nhân BCCDT-CBF không đồng nhất theo bất thƣờng NST. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng giá trị tiên lƣợng đặc trƣng của các bất thƣờng NST thay đổi theo sự đồng xuất hiện các đột biến gen nhƣ KIT và RAS. Các đột biến tăng chức năng của gen tiền sinh ung (protooncogene) KIT trong BCCDT đã đƣợc báo cáo ở vùng ngoại bào (exon 8) và vùng tyrosine kinase (D816). Cả hai kiểu đột biến này đƣợc báo cáo chuyên biệt cho từng nhóm BCCDT: đột biến trên exon 8 gặp ở bệnh nhân mang inv(16) và đột biến D816 gặp ở bệnh nhân mang t(8;21). Tái sắp xếp gen MLL: gen MLL là một histone methyltransferase có vai trò trong phiên mã ngoại gen và quan trọng trong sự phát triển và tạo máu của phôi. Gen MLL có tác động sinh bệnh bạch cầu khi tạo tổ hợp với phổ rộng các gen đối tác bao gồm AF4, AF9, AF10…Các tổ hợp gen gặp . . >70% bệnh nhi sơ sinh mắc BCCDL và khoảng 35-50% các bé sơ sinh mắc BCCDT; các chuyển vị MLL cũng gặp ở bệnh bạch cầu trẻ em lớn tuổi hơn và ngƣời lớn, chiếm khoảng 10% các trƣờng hợp [60]. Tổ hợp gen MLL/AF9 đã đƣợc chứng minh là có vai trò rất quan trọng trong sự phát triển của tế bào gốc và sự hình thành ung thƣ do ức chế sự biệt hóa của những tế bào đầu nguồn hệ tạo máu. Những bệnh nhân BCCDT có mang tổ hợp gen MLL/AF9 xếp vào nhóm có tiên lƣợng trung bình [47]. Đột biến gen FLT3: Gen FLT3 là một thụ thể gắn trên màng có hoạt tính tyrosine kinase (RTK: receptor tyrosine kinase), thuộc họ RTK nhóm 3 đƣợc đặt trƣng bởi 5 vùng ở phần ngoại bào có cấu trúc xoắn giống immunoglobulin, một vùng xuyên màng, một vùng cận màng (juxtamembrane domain) một số vùng nội bào có cấu tạo gồm 2 vùng có hoạt tính tyrosine kinase đƣợc liên kết bởi vùng kinase insert. Trên những bệnh nhân BCCDT, đột biến FLT3 chủ yếu xảy ra ở vùng juxtamembrane (JM) và vùng tyrosine kinase (TKD, tyrosine kinase domain) [61], [88]. Đột biến nhân đoạn bên trong (internal tandem duplication-ITD) xảy ra tại vùng JM domain (có vai trò chính yếu trong sự tự ức chế kinase) đƣợc tìm thấy trên khoảng 28% đến 34% của những bệnh nhân BCCDT có kết quả di truyền học tế bào bình thƣờng [52], trái lại những đột biến điểm trên vùng JM thì hiếm gặp. Đột biến liên quan đến codon 835 và 836 của vùng TKD xảy ra trên 11% đến 14% bệnh nhân BCCDT không có bất thƣờng NST. Tất cả các đột biến đều làm gia tăng quá mức hoạt tính của FLT3 [58]. Đột biến gen NPM1: gen NPM1 định vị trên NST 5q35 với chiều dài 25 kb, gồm 12 exon. Gen NPM1 có thể đƣợc phiên mã thành 3 dạng đồng phân khác nhau là NPM1, NPM1.2 và 1 đồng phân thứ chƣa rõ chức năng trong đó NPM1 là dạng phổ biến và dài nhất với 11 exon, thiếu exon 10, mã hóa cho protein có 294aa. .