Tài liệu Bào chế và tiêu chuẩn hóa cao sâm việt nam ở quy mô pilot

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- NGUYỄN THỊ TÚ NHI BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO SÂM VIỆT NAM Ở QUY MÔ PILOT Luận văn Thạc sĩ Dược học TP. Hồ Chí Minh – Năm 2018 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- NGUYỄN THỊ TÚ NHI BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO SÂM VIỆT NAM Ở QUY MÔ PILOT Ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 Luận văn Thạc sĩ Dược học Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. NGUYỄN MINH ĐỨC TP. Hồ Chí Minh – Năm 2018 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nguyễn Thị Tú Nhi . . LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin kính gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Thầy GS. TS. Nguyễn Minh Đức đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Với sự hướng dẫn và hỗ trợ của Thầy giúp em đạt được những kết quả nghiên cứu tốt, tích lũy kinh kiệm cũng như trưởng thành hơn trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học. Em xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Duy Dũng, giám đốc Trung tâm Ươm tạo và hỗ trợ doanh nghiệp Khoa học và Công nghệ, Bộ Khoa học và Công nghệ, đơn vị chủ trì đề tài độc lập cấp Nhà nước: “Nghiên cứu quy trình công nghệ bào chế một số sản phẩm chất lượng cao từ Sâm Ngọc Linh”, mã số: ĐTĐL.CN-09/16. Nhờ sự chủ trì và hỗ trợ kinh phí của đơn vị giúp nhóm nghiên cứu có điều kiện thực hiện và hoàn thành đề tài này. Em xin chân thành cảm ơn Thầy PGS. TS. Trần Công Luận và Thầy TS. Võ Văn Lẹo đã giành thời gian quý báu để xem xét, đóng góp ý kiến và phản biện, những đóng góp ý kiến quý thầy cô trong hội đồng giúp luận văn tốt nghiệp của em hoàn chỉnh hơn. Em xin cảm ơn quý thầy cô Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh và quý thầy cô Khoa Dược, Trường Đại học Tôn Đức Thắng đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt nghiên cứu của đề tài. TP. Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 9 năm 2018 Nguyễn Thị Tú Nhi . . BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO SÂM VIỆT NAM Ở QUY MÔ PILOT Tổng quan: Sâm Việt Nam (SVN) là một dược liệu quý và có giá trị cao ở Việt Nam. Mục tiêu của đề tài nhằm nghiên cứu bào chế, xây dựng tiêu chuẩn và theo dõi độ ổn định cho cao lỏng và cao khô SVN được sản xuất ở quy mô pilot. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nguyên liệu SVN được xử lý sơ bộ và chiết bằng hệ thống chiết cô tuần hoàn chân không và loại dung môi để thu được cao lỏng và cao khô. Phương pháp HPLC-CAD được tối ưu hóa và thẩm định để định lượng các saponin chính G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2 trong nguyên liệu, cao lỏng và cao khô SVN. Kết quả: Quy trình bào chế ở quy mô pilot thu được khoảng 2,5 kg cao lỏng và 2,5 kg cao khô với độ ẩm lần lượt là 28,93% và 4,42%. Hàm lượng các saponin chính ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd, ginsenosid-Rg1 và majonosid-R2 trong nguyên liệu, cao lỏng và cao khô SVN được xác định sử dụng quy trình HPLC-CAD pha đảo đã xây dựng và thẩm định. Dựa vào kết quả kiểm nghiệm, chúng tôi đã đưa ra bộ tiêu chuẩn cơ sở cho cao lỏng, cao khô SVN. Các cao cũng được theo dõi và đánh giá là ổn định trong khoảng thời gian 9 tháng đối với cao lỏng và 3 tháng đối với cao khô. Kết luận: Đề tài đã nghiên cứu bào chế thành công cao lỏng và cao khô SVN đồng thời đưa ra bộ tiêu chuẩn cơ sở cho các chế phẩm này. Phương pháp HPLC-CAD lần đầu tiên xây dựng và thẩm định để đánh giá hàm lượng các saponin chính trong nguyên liệu và các chế phẩm SVN. STUDY ON MANUFACTURING AND STANDARDIZATION OF VIETNAMESE GINSENG EXTRACT AT PILOT SCALE Introduction: Vietnamese Ginseng (VG) is a high value medicinal plant in Vietnam. The aim of this study is to manufacture at pilot scale, standardize and monitor the stability of VG liquid and dry extracts. Materials and Methods: VG root powder was extracted by Circulating Reflux Extraction and Evaporation System followed by solvent removal to afford liquid and dry extracts. Reversed-phase HPLC-CAD method was developed and validated to quantitatively . . determine the content of main saponins: G-Rb1, G-Rd, G-Rg1, and M-R2 in VG raw material and extracts. Results: By extracting at pilot scale, about 2.5 kg of liquid extract and 2.5 kg of dry extracts were obtained with the water content of 28.93% and 4.42%, successively. By using of a validated RP28 HPLC-CAD method, the content of main saponin in VG raw material and extracts was determine. Base on the analysis result, the standards for VG extracts was established. In addition, VG liquid and dry extracts were proved to be stable for 9 months and 3 months, successively. Conclusion: VG liquid and dry extracts was successfully manufactured at pilot scale with a complete standard set. HPLC-CAD method was the first time developed and validated to quantitatively determine main saponins content of VG raw materials and extracts. . . MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................................. i DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ................................................. vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ........................................... ix ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VIỆT NAM ...........................................................3 1.1.1. Nguồn gốc ...............................................................................................3 1.1.2. Phân bố, sinh thái ....................................................................................4 1.1.3. Đặc điểm hình thái ..................................................................................5 1.1.4. Bộ phận dùng ..........................................................................................6 1.1.5. Thành phần hóa học ................................................................................6 1.1.6. Tác dụng dược lý ....................................................................................9 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SÂM VIỆT NAM ..............10 1.2.1. Tổng quan một số phương pháp xử lý mẫu trong định lượng Sâm Việt Nam.................................................................................................................10 1.2.2. Một số đầu dò sử dụng trong định lượng các saponin trong SVN .......13 1.3. PHƯƠNG PHÁP HPLC- CAD ..................................................................15 1.3.1. Nguyên tắc vận hành ............................................................................15 1.3.2. Một số nghiên cứu định lượng saponin bằng phương pháp HPLC-CAD ........................................................................................................................17 1.4. CAO THUỐC ...............................................................................................18 1.4.1. Phân loại cao thuốc ...............................................................................18 i . . 1.4.2. Phương pháp bào chế cao thuốc: ..........................................................19 1.4.3. Yêu cầu chất lượng ...............................................................................20 1.4.4. Nghiên cứu bào chế cao Sâm Việt Nam ...............................................21 1.5. CÔNG TÁC TIÊU CHUẨN HÓA MỘT THUỐC ...................................22 1.6. ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA THUỐC......................................................................23 1.6.1. Phương pháp thử độ ổn dịnh dài hạn (long term stability study) .........24 1.6.2. Phương pháp lão hóa cấp tốc (accelerated stability study)...................25 1.6.3. Tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định............................................................26 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................27 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .....................................................................27 2.1.1. Nguyên vật liệu .....................................................................................27 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................27 2.1.3. Dung môi, hóa chất ...............................................................................28 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................................28 2.2.1. Xây dựng quy trình định lượng các saponin trong dược liệu Sâm Việt Nam bằng HPLC-CAD ...................................................................................28 2.2.2. Kiểm nghiệm nguyên liệu .....................................................................36 2.2.3. Bào chế cao lỏng và cao khô Sâm Việt Nam .......................................37 2.2.4. Xây dựng quy trình định lượng các saponin trong cao lỏng và cao khô Sâm Việt Nam bằng HPLC-CAD ...................................................................43 2.2.5. Kiểm nghiệm cao lỏng và cao khô Sâm Việt Nam ..............................43 2.2.6. Đóng gói và trình bày các sản phẩm cao lỏng và cao khô Sâm Việt Nam ........................................................................................................................45 2.2.7. Theo dõi độ ổn định của cao lỏng và cao khô Sâm Việt Nam .............45 ii . . CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................46 3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TRONG NGUYÊN LIỆU SÂM VIỆT NAM BẰNG HPLC-CAD ................................46 3.1.1. Khảo sát quy trình chiết xuất ................................................................46 3.1.2. Khảo sát quy trình tinh chế mẫu bằng SPE ..........................................47 3.1.3. Khảo sát thông số HPLC-CAD ............................................................48 3.1.4. Quy trình định lượng ............................................................................53 3.1.5. Thẩm định quy trình định lượng ...........................................................55 3.2. KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU .............................................................63 3.2.1. Đặc điểm thực vật .................................................................................63 3.2.2. Mất khối lượng do làm khô ..................................................................68 3.2.3. Tro toàn phần ........................................................................................68 3.2.4. Tỷ lệ vụn nát .........................................................................................68 3.2.5. Tạp chất ................................................................................................68 3.2.6. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật .......................................................69 3.2.7. Định tính ...............................................................................................70 3.2.8. Định lượng ............................................................................................70 3.3. BÀO CHẾ CAO SÂM VIỆT NAM ............................................................73 3.3.1. Bào chế cao lỏng Sâm Việt Nam ..........................................................73 3.3.2. Bào chế cao khô Sâm Việt Nam ...........................................................75 3.3.3. Xây dựng quy trình định lượng saponin trong cao Sâm Việt Nam bằng HPLC-CAD ....................................................................................................75 3.3.4. Thẩm định quy trình định lượng các saponin trong cao lỏng Sâm Việt Nam.................................................................................................................75 iii . . 3.4. KIỂM NGHIỆM CAO SÂM VIỆT NAM .................................................80 3.4.1. Cao lỏng Sâm Việt Nam .......................................................................80 3.4.2. Cao khô Sâm Việt Nam ........................................................................83 3.5. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO SÂM VIỆT NAM ..............................87 3.5.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao lỏng Sâm Việt Nam ............................87 3.5.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao khô Sâm Việt Nam .............................89 3.6. THEO DÕI ĐỘ ỔN ĐỊNH CAO SÂM VIỆT NAM.................................90 3.6.1. Theo dõi độ ổn định của cao lỏng Sâm Việt Nam ................................90 3.6.2. Theo dõi độ ổn định của cao khô Sâm Việt Nam .................................92 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................................93 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................95 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................97 iv . . DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Saponin nhóm protopanaxadiol ..................................................................7 Bảng 1.2. Saponin nhóm protopanaxatriol ..................................................................8 Bảng 1.3. Saponin nhóm ocotillol ...............................................................................8 Bảng 1.4. Saponin nhóm olean ...................................................................................9 Bảng 1.5. Các nghiên cứu phân tích gần đây trên các dược liệu chi Panax sử dụng phương pháp HPLC-CAD .........................................................................................17 Bảng 1.6. Nhiệt độ và độ ẩm của 4 vùng khí hậu .....................................................24 Bảng 1.7. Thông số khí hậu tính toán và điều kiện bảo quản cho thử dài hạn .........25 Bảng 2.1. Dụng cụ và trang thiết bị sử dụng .............................................................27 Bảng 2.2. Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu.........................................28 Bảng 2.3. Nồng độ giai mẫu xây dựng đường tuyến tính HPLC-CAD ....................32 Bảng 3.1. Thông số sắc ký ứng với đỉnh G-Rb1 trong mẫu chuẩn ...........................55 Bảng 3.2. Giá trị các thông số sắc ký ứng với đỉnh G-Rd trong mẫu chuẩn ............56 Bảng 3.3. Giá trị các thông số sắc ký ứng với đỉnh G-Rg1 trong mẫu chuẩn ...........56 Bảng 3.4. Giá trị các thông số sắc ký ứng với đỉnh M-R2 trong mẫu chuẩn ............57 Bảng 3.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của các saponin chính trong phương pháp HPLC-CAD ......................................................................................................58 Bảng 3.6. Kết quả xử lý thống kê khảo sát tính tuyến tính của các saponin chính trong quy trình định lượng HPLC-CAD ............................................................................60 Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ chính xác của quy trình định lượng (% kl/kl) .........60 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng của G-Rb1 ........................................................61 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng của G-Rd .........................................................61 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ đúng của G-Rg1 ......................................................62 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ đúng của M-R2 ......................................................62 Bảng 3.12. Mất khối lượng do làm khô của SVN .....................................................68 Bảng 3.13. Kết quả độ tro toàn phần của SVN .........................................................68 Bảng 3.14. Tỷ lệ vụn nát của SVN............................................................................68 Bảng 3.15. Tỷ lệ tạp chất của SVN ...........................................................................69 v . . Bảng 3.16. Hàm lượng các saponin chính trong các mẫu đại diện trong nguyên liệu SVN ...........................................................................................................................73 Bảng 3.17. Kết quả độ lặp lại của quy trình định lượng G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và MR2 trong cao SVN bằng phương pháp HPLC-CAD .................................................77 Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng của G-Rb1 ......................................................78 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ đúng của G-Rd .......................................................78 Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ đúng của G-Rg1 ......................................................79 Bảng 3.21. Kết quả khảo sát độ đúng của M-R2 ......................................................79 Bảng 3.22. Kết quả mất khối lượng do làm khô của cao lỏng SVN .........................80 Bảng 3.23. Kết quả độ tro toàn phần của cao lỏng SVN ..........................................80 Bảng 3.24. Kết quả pH của cao lỏng SVN ................................................................81 Bảng 3.25. Kết quả giới hạn kim loại nặng của cao lỏng SVN ................................81 Bảng 3.26. Kết quả giới hạn nhiễm khuẩn của cao lỏng SVN .................................82 Bảng 3.27. Hàm lượng G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2 trong cao lỏng SVN định lượng bằng HPLC-CAD và HPLC-UV ...............................................................................83 Bảng 3.28. Kết quả mất khối lượng do làm khô của cao khô SVN ..........................84 Bảng 3.29. Kết quả độ tro toàn phần của cao khô SVN ...........................................84 Bảng 3.30. Kết quả pH của cao khô SVN .................................................................84 Bảng 3.31. Kết quả giới hạn kim loại nặng của cao khô SVN .................................85 Bảng 3.32. Kết quả giới hạn nhiễm khuẩn của cao khô SVN...................................85 Bảng 3.33. Hàm lượng G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2 trong cao khô SVN định lượng bằng HPLC-CAD và HPLC-UV. ..............................................................................87 Bảng 3.34. Tiêu chuẩn cơ sở cao lỏng SVN .............................................................88 Bảng 3.35. Tiêu chuẩn cơ sở cao khô SVN ..............................................................89 Bảng 3.36. Kết quả theo dõi độ ổn định cao lỏng SVN ............................................90 Bảng 3.37. Kết quả theo dõi độ ổn định cao khô SVN .............................................92 vi . . DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). .................................5 Hình 1.2. Bộ phận dưới mặt đất của Sâm Việt Nam trồng từ 2 đến 6 tuổi. ................5 Hình 1.3. Sắc ký đồ HPLC-UV định lượng đồng thời G-Rg1, G-Rb1, G-Rd (ở 203 nm) và M-R2 (ở 190 nm) ..........................................................................................11 Hình 1.4. Sắc ký đồ HPLC của hỗn hợp các chất chuẩn (A), dịch chiết rễ SVN (B) phát hiện bằng ELSD và UV (196 nm). ....................................................................12 Hình 1.5. Sắc ký đồ HPLC/ELSD của SVN chưa chế biến (A) và được hấp ở 120 °C trong 2 giờ (B), 4 giờ (C), 6 giờ (C), 8 giờ (D), 12 giờ (E), 16 giờ (F) và 20 giờ (G). ...................................................................................................................................14 Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo và nguyên tắc vận hành của đầu dò CAD ..........................16 Hình 1.7. Sắc ký độ HPLC-CAD của hỗn hợp 14 chuẩn (A), cao lỏng Nhân sâm (B), cao khô Nhân sâm (C). ..............................................................................................18 Hình 2.1. Hệ thống chiết cô tuần hoàn chân không quy mô pilot tại Công ty Cổ phần BV Pharma ................................................................................................................38 Hình 2.2. Quy trình bào chế cao lỏng SVN ..............................................................40 Hình 2.3. Hệ thống sấy phun tại Công ty Cổ phần BV Pharma ...............................41 Hình 2.4. Quy trình bào chế cao khô SVN ...............................................................42 Hình 3.1. Kết quả SKLM của các dịch chiết SVN ...................................................46 Hình 3.2. Kết quả SKLM khảo sát dung môi loại tạp (a); thể tích loại tạp (b) và thể tích rửa giải (c) của SVN...........................................................................................47 Hình 3.3. Sắc ký đồ dịch chiết SVN phát hiện bằng đầu dò UV 196 nm (A) và CAD (B) trong cùng điều kiện sắc ký ................................................................................49 Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC-CAD khảo sát điều kiện của mẫu thử ở điều kiện 1 (A), điều kiện 2 (B), ..........................................................................................................51 Hình 3.5 Sắc ký đồ HPLC-CAD khảo sát điều kiện của mẫu thử ở điều kiện 3 (C), điều kiện 4 (D), .........................................................................................................52 Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC-CAD khảo sát điều kiện của mẫu thử ở điều kiện 5 (E) ...................................................................................................................................53 vii . . Hình 3.7. Sắc ký đồ đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp HPLC-CAD .............57 Hình 3.8. Đường biểu diễn phương trình hồi quy của G-Rb1 ...................................58 Hình 3.9. Đường biểu diễn phương trình hồi quy của G-Rd ....................................59 Hình 3.10. Đường biểu diễn phương trình hồi quy của G-Rg1 .................................59 Hình 3.11. Đường biểu diễn phương trình hồi quy của M-R2..................................59 Hình 3.12. Bộ phận dưới mặt đất của mẫu dược liệu SVN khảo sát ........................63 Hình 3.13. Cấu tạo giải phẫu thân rễ SVN ................................................................65 Hình 3.14. Cấu tạo giải phẫu rễ củ SVN ...................................................................66 Hình 3.15. Các cấu tử có trong bột dược liệu SVN ..................................................67 Hình 3.17. Kết quả SKLM định tính SVN ................................................................70 Hình 3.18. Sắc ký đồ định lượng các saponin chính trong SVN bằng HPLC-CAD 71 Hình 3.19. Sắc ký đồ định lượng các saponin chính trong SVN bằng HPLC-CAD 72 Hình 3.20. Kết quả SKLM của 3 dịch chiết Sâm Việt Nam .....................................74 Hình 3.21. Cao lỏng SVN .........................................................................................74 Hình 3.22. Sắc ký đồ thể hiện tính đặc hiệu của phương pháp HPLC-CAD định lượng các saponin chính trong cao lỏng SVN .....................................................................76 Hình 3.23. Sắc ký lớp mỏng định tính cao lỏng SVN...............................................82 Hình 3.24. Sắc ký lớp mỏng định tính cao khô SVN ................................................86 viii . . DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT CHỮ TẮT Ý NGHĨA CHỮ NGUYÊN Đầu dò khí dung tích điện CAD Charged Aerosol Detector CHCl3 cloroform DAD Diode Array Detector DĐVN Dược điển Việt Nam ELSD Evaporative Light Scattering Detection Đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi EtOH ethanol G-Rb1 ginsenosid-Rb1 G-Rd ginsenosid-Rd G-Rg1 ginsenosid-Rg1 HPLC High Performance Liquid Đầu dò dãy diod quang Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng MeOH methanol M-R2 majonosid-R2 MS Mass Spectrometry NĐT Nhiệt độ thử RID Refractive Index Detetor Đầu dò chỉ số khúc xạ RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn Khối phổ ix . . CHỮ TẮT Ý NGHĨA CHỮ NGUYÊN SPE Solid Phase Extraction SVN Sâm Việt Nam SKLM Sắc ký lớp mỏng T0 0 tháng T3 3 tháng T6 6 tháng T9 9 tháng TB Trung bình TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TLC Thin Layer Chromatography TLTK Tài liệu tham khảo UV Ultraviolet V-R1 Vinaginsenosid-R1 V-R2 Vinaginsenosid-R2 Chiết pha rắn Sắc ký lớp mỏng Tử ngoại x . . ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv., Araliaceae, SVN) là một loài Sâm quý và đặc hữu của Việt Nam được phát hiện và nghiên cứu hơn 40 năm. Thành phần hóa học chính của SVN ngoài các saponin thuộc nhóm protopanaxatriol (notoginsenosid-R1, ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Re, ginsenosid-Rh1) và protopanaxadiol (ginsenosid-Rb1, ginsenosid -Rd) tương tự như trong Nhân sâm, Sâm Hoa Kỳ và Tam Thất còn chứa hàm lượng rất cao các saponin nhóm ocotillol, đặc biệt là M-R2 với hàm lượng trên 5 % [17], [18], [19]. Các nghiên cứu dược lý đã chứng minh SVN có tác dụng tăng cường sinh lực, tăng sức đề kháng, miễn dịch, bảo vệ gan, chống ung thư... [6], [30], [37]. Do đó, SVN ngày càng thu hút việc nghiên cứu cả trong và ngoài nước. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp khác nhau để phát hiện và định lượng các saponin trong SVN. Đầu dò UV/DAD là một đầu dò thường quy trong các phòng kiểm nghiệm nhưng hạn chế trong việc phát hiện các saponin nhóm ocotillol vốn hấp thu kém tia tử ngoại [13]. Một số phương pháp khác sử dụng các đầu dò vạn năng như đầu dò khúc xạ anh sáng (RID), đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD) có thể phát hiện được các hầu hết các hợp chất không bay hơi, tuy nhiên các đầu dò này cũng có những hạn chế nhất định. Đối với đầu dò RID, mẫu khảo sát phải ở nồng độ cao do độ nhạy thấp, nhiệt độ môi trường phải ổn định và không thể sử dụng rửa giải gradient [16]. Đầu dò ELSD khắc phục được nhược điểm của RID, cho phép rửa giải gradient nhưng độ nhạy, độ lặp lại không cao [32]. Đầu dò khí dung tích điện (Charged Aerosol Detector, CAD) là một đầu dò gần như vạn năng mới phát triển mạnh gần đây, giúp khắc phục được các nhược điểm trên và đã được ứng dụng trong việc kiểm nghiệm hiệu quả các loài sâm. Nhân sâm (Panax ginseng) đã được nghiên cứu từ những năm 60 của thế kỷ trước với hàng loạt dạng chế biến như Bạch sâm, Hồng sâm cùng với nhiều dạng chế phẩm như cao lỏng, cao khô, viên nang cứng, viên nang mềm, kẹo sâm, trà sâm. Điều này tạo giá trị kinh tế lớn và vị thế cao của dược liệu này trên thị trường. Trong khi đó, 1 . . hiện nay SVN chỉ mới được sử dụng ở dạng đơn giản như nước sắc, rượu thuốc vốn mất nhiều thời gian chế biến, vị rất đắng gây khó chịu khi uống trực tiếp. Ngoài ra, chất lượng của nguyên liệu đầu vào cũng là một vấn đề đáng báo động và chưa được kiểm soát gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm cũng như uy tín của SVN. Vì các lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu bào chế cao lỏng và cao khô SVN ở quy mô pilot, nhằm ra các sản phẩm mới, đồng thời cũng là nguồn nguyên liệu tiêu chuẩn để bào chế các dạng chế phẩm hiện đại cho SVN, góp phần cung cấp cho thị trường các sản phẩm chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu người sử dụng. Đồng thời, chúng tôi cũng xây dựng quy trình định lượng các saponin chính trong SVN nguyên liệu và các cao SVN bằng phương pháp HPLC-CAD. Đề tài bao gồm các nội dung sau: - Bào chế cao lỏng và cao khô SVN trên quy mô pilot. - Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng các saponin chính trong SVN cũng như cao SVN bằng phương pháp HPLC-CAD. - Tiêu chuẩn hóa cao lỏng và cao khô SVN. - Theo dõi độ ổn định của các cao SVN. 2 . . CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VIỆT NAM Tên khoa học: Panax vietnamensis Ha et Grushv., họ Nhân sâm (Araliaceae). Tên Việt Nam: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm khu 5, Sâm K5, cây Thuốc giấu (dân tộc Xê Đăng), củ Ngải rợm con, Sâm đốt trúc. Tên tiếng Anh: Vietnamese ginseng [6], [7], [11] Vị trí phân loại trong hệ thống phân loại thực vật có hoa của Armen Takhtajan (2009) [38]: Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Cúc (Asteridae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Nhân sâm (Araliaceae) Chi Sâm (Panax) Loài SVN (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 1.1.1. Nguồn gốc Cây SVN trước đây được biết đến là cây thuốc “giấu” của đồng bào dân tộc Xê Đăng trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam, cây sống xen trong quần thể thực vật đa dạng vùng núi hiểm trở, lạnh và mây mù quanh năm, không có cư dân. Cây SVN còn có tên khác là “Ngải rợm con” vì hình dạng phần thân rễ có đốt giống củ ngải rợm. Năm 1973, Dược sĩ Đào Kim Long và đoàn điều tra Dược liệu của Ban Dân y Khu 5 đã phát hiện ra loài Sâm này mọc thành quần thể ở độ cao 1.800 m ở vùng Ngọc Lây, huyện Đăk Tô, tỉnh Kom Tum. 3 . . Năm 1976, công trình nghiên cứu sơ bộ của Nguyễn Thới Nhâm cho thấy thành phần hóa học cây Sâm K5 khá giống với cây Nhân Sâm và Tam Thất. Năm 1978, khu ủy Khu 5 đã cho bảo vệ chặt chẽ vùng sâm này và Sâm K5 được sử dụng chữa bệnh có hiệu quả cho các thương bệnh binh, cán bộ và nhân dân. Tháng 9 năm 1985, Hà Thị Dụng và Igor Vladimirovitch Grushvitsky sau khi nghiên cứu 50 mẫu vật đối chiếu với những mẫu vật của thế giới đã kết luận Sâm Ngọc Linh là một loài mới, một loài sâm đặc hữu của khu hệ thực vật Việt Nam và đặt tên là Panax vietnamensis Ha et Grushv. [6], [12]. 1.1.2. Phân bố, sinh thái SVN mọc hoang chủ yếu tại vùng núi Ngọc Linh (thuộc huyện Đắk Tô và Đắk Glây, tỉnh Kon Tum và huyện Trà My, tỉnh Quảng Nam). Tháng 10 năm 2006, SVN còn được phát hiện ở đỉnh núi Ngọc Lum Heo (Quảng Nam) [6], [12]. SVN là loại cây thảo đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng. Cây mọc ở độ cao 1.500-2.200 m, rải rác hay thành đám dưới tán rừng lá rộng thường xanh, đôi khi xen cả cây lá kim, độ tàn che từ 70-90 %, ít dốc, dọc theo các suối ẩm, chỗ đất có nhiều mùn. Cây mọc đơn lẻ hay mọc thành đám nhỏ gồm nhiều cá thể ở các lứa tuổi khác nhau [5]. SVN sinh trưởng mạnh trong mùa xuân - hè. Chồi thân (ở đầu thân rễ) sẽ mọc lên vào giữa tháng 2, cây ra hoa và kết quả khoảng từ tháng 3 đến tháng 10, mùa quả chín từ tháng 10 đến tháng 11. Sau khi quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông khoảng trên 4 tháng thì sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau. Cùng với quá trình sinh trưởng và phát triển của phần thân mang lá, hàng năm phần thân rễ dưới mặt đất cũng phát triển dài thêm. Phần thân mang lá tàn lụi hàng năm, để lại vết sẹo rõ trên thân rễ. SVN có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt rất tốt. Có thể nhân giống bằng hạt hay phần đầu mầm của thân rễ [6], [12]. Gần đây, phương pháp nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô cũng đã được nghiên cứu, nhưng đến này vẫn chưa thành công trên thực tế. 4 .