Tài liệu ảnh hưởng của acid boric lên một số đặc tính sinh học của tế bào gốc dây chằng nha chu người – in vitro

. BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Ảnh hưởng của acid boric lên một số đặc tính sinh học của tế bào gốc dây chằng nha chu người – in vitro Mã số: Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Phạm Anh Vũ Thụy Tp. Hồ Chí Minh, 2018 . . BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Ảnh hưởng của acid boric lên một số đặc tính sinh học của tế bào gốc dây chằng nha chu người – in vitro Mã số: Chủ nhiệm đề tài PGS.TS. Phạm Anh Vũ Thụy Tp. Hồ Chí Minh, 2018 . . ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm nha chu là bệnh nhiễm khuẩn mạn tính có liên quan đến sự phá hủy các cấu trúc nâng đỡ răng gồm nướu, dây chằng nha chu và xương ổ răng. Bệnh khởi phát do sự tích tụ vi khuẩn ở sát cổ răng, ảnh hưởng tới một hay nhiều răng, nếu không điều trị có thể dẫn tới mất răng, đặc biệt là ở người trưởng thành. Việc loại bỏ các vi khuẩn gây viêm nha chu và tái tạo các mô nha chu bị mất do bệnh là mục tiêu lý tưởng và quan trọng trong điều trị [65]. Lấy cao răng và xử lý mặt chân răng được coi là phương pháp điều trị chính. Tuy nhiên, nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng việc lấy cao răng và xử lý mặt chân răng thường không thể loại bỏ hoàn toàn được vi khuẩn nằm sâu trong túi nha chu [8], [80]. Sự hình thành một lớp mùn cơ học sau đó có thể ức chế sự gắn lại tế bào vào bề mặt chân răng và gây hại cho sự lành thương của mô nha chu [14]. Do đó, bên cạnh việc lấy cao răng và xử lý mặt chân răng cần thiết phải có các phương pháp điều trị hỗ trợ để tiến trình điều trị viêm nha chu được hiệu quả hơn. Các phương pháp điều trị hỗ trợ hiện nay đang được sử dụng khá phổ biến như kháng sinh toàn thân hay tại chỗ, các dung dịch có tính kháng khuẩn bơm rửa hay súc miệng. Trong đó, lấy cao răng và xử lý mặt chân răng kết hợp với dung dịch sát khuẩn bơm rửa túi nha chu là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến trong điều trị viêm nha chu để loại bỏ vi khuẩn gây bệnh và cải thiện khả năng tương thích sinh học trên bề mặt chân răng [36], [49], [75]. Vì vậy, việc nghiên cứu một dung dịch bơm rửa có khả năng kháng khuẩn, không có tác dụng phụ cũng như không gây độc cho mô nha chu là điều đáng được quan tâm. Acid Boric là acid của nguyên tố Boron từ lâu đã được sử dụng trong y học như một chất kháng khuẩn nhẹ cho các vết thương và nhiều lĩnh vực khác. Hiệu quả của nó cũng đã được công nhận trong lĩnh vực nha khoa nói chung đặc biệt là trong điều trị hỗ trợ viêm nha chu nói riêng. Luan và cộng sự (2008) đã chứng minh được những hợp chất có chứa Boron có khả năng kháng lại một số vi khuẩn liên quan đến bệnh nha chu như Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis, Eubacterium nodatum và Treponema denticola [59]. Trong một nghiên cứu khác của Saglam và . . cộng sự (2013) đã cho thấy Acid Boric có hiệu quả làm giảm độ sâu túi và giảm chảy máu nướu trong điều trị viêm nha chu mạn ở nồng độ 0,75% [70]. Những hiệu quả trên lâm sàng mà Acid Boric mang lại là điều đã được công nhận, tuy nhiên những nghiên cứu in vitro về ảnh hưởng của dung dịch này trên các dòng tế bào khác nhau của mô nha chu vẫn còn hạn chế, đặc biệt là trên tế bào gốc dây chằng nha chu người (hPDLSCs). hPDLSCs được nuôi cấy từ mô dây chằng nha chu người, biểu hiện những dấu ấn phân tử (marker) của tế bào gốc trung mô như CD44, CD73, CD90 và sở hữu những đặc tính đa tiềm năng có thể biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau như nguyên bào xương, tế bào tạo mô mỡ và tế bào sụn [26], [74]. Các tế bào này không chỉ quan trọng đối với sự hình thành, duy trì mô mà còn có khả năng sửa chữa, tu bổ, cung cấp nguồn tế bào để tái tạo các mô khác bị mất trong viêm nha chu (dây chằng nha chu, xê măng và xương ổ răng) [38], [74]. Chính vì vậy, hPDLSCs thường được là lựa chọn ưu tiên hàng đầu trong công nghệ tái tạo và sửa chữa mô nha chu trong điều trị viêm nha chu. Hiện tại chưa có nghiên cứu nào đánh giá về độc tính cũng như ảnh hưởng của Acid Boric lên các đặc tính sinh học như sự tăng sinh, sự di cư và khả năng bám dính trên bề mặt chân răng đã xử lý của hPDLSCs. Với mong muốn bổ sung thêm những bằng chứng khoa học về ảnh hưởng của Acid Boric trên tế bào mô nha chu, cụ thể là hPDLSCs trong việc hỗ trợ điều trị viêm nha chu một cách toàn diện hơn chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu “Ảnh hưởng của Acid Boric lên một số đặc tính sinh học của tế bào gốc dây chằng nha chu người – in vitro”. . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. CÂU HỎI NGHIÊN CỨU Ở nồng độ nào thì Acid Boric không gây độc lên hPDLSCs và tại các nồng độ an toàn thì Acid Boric có ảnh hưởng đến các đặc tính sinh học như sự tăng sinh, sự di cư và khả năng bám dính trên bề mặt chân răng đã xử lý của hPDLSCs hay không? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Xác định nồng độ Acid Boric an toàn (không gây độc) lên hPDLSCs. 2. Xác định ảnh hưởng của các nồng độ Acid Boric an toàn đến sự tăng sinh của hPDLSCs. 3. Xác định ảnh hưởng của các nồng độ Acid Boric an toàn đến sự di cư của hPDLSCs. 4. Xác định ảnh hưởng của các nồng độ Acid Boric an toàn đến sự bám dính trên bề mặt chân răng đã xử lý của hPDLSCs. . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU VÀ DÒNG TẾ BÀO NGHIÊN CỨU Dung dịch Acid Boric 6% được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1,2g Acid Boric nguyên chất (công ty Merck - Đức) trong 20ml môi trường tiêu chuẩn và lọc qua màng lọc 0,22µm vô trùng. Dung dịch này được tiếp tục pha loãng trong môi trường để đạt được các nồng độ thí nghiệm. Nguồn hPDLSCs ở thế hệ P3 được cung cấp từ phòng thí nghiệm Kỹ nghệ mô và Vật liệu Y Sinh (TEBM Lab) thuộc Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Nguồn tế bào này đã được chứng minh biểu hiện những dấu ấn phân tử (marker) của tế bào gốc trung mô như CD44, CD73, CD90 và cũng sở hữu đặc tính đa tiềm năng có thế biệt hóa thành những loại tế bào khác nhau như nguyên bào xương và tế bào tạo mỡ in vitro [6]. 2.3 HÓA CHẤT 2.3.1 Môi trường tiêu chuẩn nuôi cấy tế bào Gồm các thành phần: DMEM/F12 (Sigma - Aldrich, Mỹ) FBS (Fetal bovine serum) 10% (Sigma - Aldrich, Mỹ) Kháng sinh 100IU/ml Penicillin, 100µg/ml Strepomycin (Sigma - Aldrich, Mỹ) 2.3.2 Các hóa chất khác ✓ Dung dịch PBS 1X (1000ml) PBS 10X (Gibco, Mỹ) 100ml Nước cất 2 lần 900ml Dung dịch được hấp vô trùng ở 121ºC, 1atm trong 20 phút, bảo quản ở 4ºC. ✓ Enzyme tách tế bào Trypsin - EDTA 0,25% (Sigma - Aldrich, Mỹ) ✓ Thuốc nhuộm tế bào Trypan blue (Sigma, Mỹ) ✓ Dung dịch MTT (5mg/ml) (10ml) MTT (Sigma, Mỹ) . 50mg Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PBS 1X 10ml Dung dịch được lọc vô trùng, sau đó bảo quản -20ºC, tránh sáng. ✓ Dung dịch DMSO/Ethanol Ethanol (Merck) 50ml DMSO (Sigma, Mỹ) 50ml ✓ Dung dịch DMSO 20% DMSO (Sigma, Mỹ) Môi trường tiêu chuẩn 5ml 20ml 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu, thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.4.1.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu in vitro có nhóm chứng. 2.4.1.2 Thời gian thực hiện nghiên cứu: Thời gian huấn luyện từ tháng 10/2017 đến tháng 11/2017. Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2017 đến tháng 6/2018. 2.4.1.3 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Kỹ nghệ mô và Vật liệu Y sinh (TEBM Lab) thuộc Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Khu phố 6, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.4.2 Sơ đồ tóm tắt nghiên cứu . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. Quá trình nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ ở Hình 2.2. Acid Boric (0,5%; 0,75%; 1%; 1,5%; 3%; 6%) hPDLSCs (thế hệ P4) Đánh giá độc tính in vitro (Thử nghiệm MTT) Xác định nồng độ Acid Boric an toàn Ảnh hưởng lên hPDLSCs Đánh giá sự tăng sinh (Phương pháp đếm số lượng tế bào) Đánh giá sự di cư (Phương pháp đường rạch mô phỏng tổn thương) Đánh giá sự bám dính trên bề mặt chân răng đã xử lý (Thử nghiệm MTT và Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử quét - SEM) Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt nghiên cứu. 2.4.3 Quy trình nghiên cứu 2.4.3.1 Chuẩn bị tế bào Nguồn hPDLSCs ở thế hệ P3 được cấy chuyền đến thế hệ P4 (các tế bào đạt được sự đồng nhất về hình dạng). Theo dõi sự tăng sinh của các tế bào cho đến khi chúng trải thành một lớp đơn phủ kín bề mặt bình Roux (đạt được độ bao phủ khoảng 80%). Lúc này các tế bào đã sẵn sàng để tiến hành các thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric lên khả năng sống cũng như sự tăng sinh, sự di cư và khả năng bám dính trên bề mặt chân răng đã xử lý của hPDLSCs. ✓ Quy trình cấy chuyền từ bình Roux sang bình Roux - Dùng pipette hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ trong bình Roux. . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. - Rửa với 3ml dung dịch PBS. - Tách tế bào trong bình Roux với 1ml Trypsin - EDTA 0,25%, ủ trong tủ 37ºC, CO2 5% khoảng 2 phút. - Bổ sung 2ml môi trường tiêu chuẩn để bất hoạt Trypsin. - Chuẩn bị 2 - 3 bình Roux mới, cho vào mỗi bình 3ml môi trường và lượng huyền phù tế bào được chia đều cho mỗi bình. - Nuôi tế bào ở tủ 37ºC, CO2 5% - Môi trường được thay thế cách ngày. - hPDLSCs ở thế hệ P4 được nuôi trong bình Roux đạt được mật độ khoảng 80% có thể thực hiện nghiên cứu. ✓ Phương pháp xác định số lượng tế bào trong bình Roux - Dùng pipette hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ trong bình Roux. - Rửa với 3ml dung dịch PBS. - Tách tế bào trong mỗi giếng với 1ml Trypsin - EDTA 0,25%, ủ trong 2 phút, đợi tế bào nuôi cấy bong tách hết. - Bổ sung 2ml môi trường nuôi cấy để bất hoạt Trypsin. Huyền phù đều dịch trong bình Roux. - Cho hết dung dịch vào ống Falcon 15ml, đem quay ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào. - Bổ sung 2ml môi trường nuôi cấy, huyền phù đều. - Hút 20µl dịch huyền phù có tế bào vào Eppendorf 1,5ml, pha loãng với 0,4% Trypan blue theo tỉ lệ 1:1 và trộn đều. - Phủ buồng đếm với lamelle và cho một giọt huyền phù tế bào vào buồng đếm bằng cách nhỏ sát vị trí tiếp xúc giữa lamelle và buồng đếm. Nhờ hệ thống mao dẫn mà giọt huyền phù sẽ tràn đầy buồng đếm. - Đếm số lượng tế bào tại 4 vùng đếm ở bốn góc (vùng 1, 2, 3, 4). Đếm tất cả các tế bào to, tròn, sáng rõ. Đếm theo nguyên tắt cạnh trên - bên phải: Nếu các tế bào nằm ở vạch ranh giới, đếm cách tế bào nằm ở phía trên và bên phải của ô đang đếm, không đếm những tế bào nằm phía dưới bên trái (Hình 2.3). . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. - Đếm 2 mẫu rồi lấy số lượng tế bào trung bình là A, xây dựng công thức tính mật độ tế bào. A 1 B 2 3 4 Hình 2.2 Buồng đếm tế bào A: hình ảnh minh họa, B: hình chụp từ nghiên cứu này. ✓ Công thức tính mật độ tế bào - Trong mỗi buồng đếm có 9 vùng đếm. Chỉ đếm số lượng tế bào tại 4 vùng đếm ở xung quanh. Số lượng tế bào trung bình ở mỗi vùng đếm là A/4 - Mỗi vùng đếm có 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ, mỗi ô vuông nhỏ có thể tích: 1/20 × 1/20 × 1/10 = 1/4000mm3 - Thể tích một vùng đếm: 400 × 1/4000 = 1/10mm3 = 10-4ml - Suy ra mật độ tế bào trung bình trong 1ml dung dịch môi trường: (A/4) × 104 × độ pha loãng (tế bào/ml) - Vì khi nhuộm với Trypan blue theo tỉ lệ 1:1 nên độ pha loãng là 2. Vậy lượng tế bào trong 1ml huyền phù (N) là: N = (A/4) × 104 × 2 (tế bào/ml). 2.4.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric lên khả năng sống của hPDLSCs ✓ Cơ sở khoa học Đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric lên khả năng sống của hPDLSCs dựa trên phương pháp MTT theo tiêu chuẩn ISO10993-5:2009 ISO là liên đoàn tiêu chuẩn quốc tế nhằm nâng cao sự phát triển của tiêu chuẩn hóa được đặt ở Thụy Sĩ. ISO hoạt động như là quá trình quản lý hài hòa để . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. đảm bào sự an toàn, chất lượng, và quy trình chế tạo thiết bị y tế. ISO10993-5 đưa ra quy trình đánh giá độc tính in vitro thông qua thử nghiệm MTT. MTT được viết tắt từ 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide, là một loại tetrazole có màu vàng sẽ chuyển thành tinh thể formazan màu xanh tím trong tế bào sống dưới tác dụng của enzym sucinate dehydrogenase, một loại enzym reductase trong ti thể. Số lượng tế bào sống càng lớn sẽ tạo ra lượng formazan càng lớn và làm chỉ số mật độ quang tăng. Phương pháp này giúp đánh giá được số tế bào còn sống hoặc khả năng tăng trưởng của tế bào ở thời điểm khảo sát [43], [52]. ✓ Tiêu chí đánh giá Đánh giá hình thái tế bào: hình thái tế bào sau khi ủ trong dung dịch Acid Boric 24 giờ được ghi nhận bằng hình ảnh chụp dưới kính hiển vi đảo pha CKX53 (Olympus, Nhật) cùng phần mềm ghi nhận hình ảnh (CellSens) và so sánh với các nhóm chứng. Đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric sau thử nghiệm MTT dựa theo hướng dẫn ISO10993-5, chúng tôi chia mức độ độc tế bào thành 5 giai đoạn bằng cách phân tích tỉ lệ tăng trưởng tương đối (RGR). RGR được xác định theo tiêu chuẩn ISO10993 [43], [52] theo công thức: % RGR = x 100% OD570e: giá trị trung bình mật độ quang của giếng tế bào ủ trong Acid Boric được đo ở bước sóng 570nm. OD570b: giá trị trung bình mật độ quang của giếng tế bào ủ trong môi trường tiêu chuẩn được đo ở bước sóng 570nm. RGR được tóm tắt trong Bảng 2.3 với mức độ 0 và 1 được xác định là không gây độc cho tế bào [43], [52]. . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. Bảng 2.1 Mức độ gây độc tế bào theo tiêu chuẩn ISO10993-5:2009 RGR (%) Mức độ gây độc tế bào 100 0 75 - 99 1 50 - 74 2 25 - 49 3 1 - 24 4 0 5 ✓ Phương pháp thực hiện Thử nghiệm thực hiện trên các nghiệm thức (mỗi nghiệm thức 3 giếng) - Dung dịch Acid Boric 0,5% - Dung dịch Acid Boric 0,75% - Dung dịch Acid Boric 1% - Dung dịch Acid Boric 1,5% - Dung dịch Acid Boric 3% - Dung dịch Acid Boric 6% - Môi trường tiêu chuẩn (Chứng âm) - Dung dịch DMSO 20% đã được chứng minh gây độc cho tế bào (Chứng dương) [10]. Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa 96 giếng. Chuẩn bị tế bào - Nuôi hPDLSCs cho đến khi tế bào tăng sinh bao phủ khoảng 75 - 80% bề mặt đĩa nuôi thì tiến hành tách tế bào và cấy vào đĩa khảo sát. - Tách tế bào bằng cách bổ sung 1ml Trypsin - EDTA, ủ 2 phút. - Bổ sung 2ml môi trường để bất hoạt Trypsin, ly tâm 3000 vòng/5 phút thu cặn tế bào. - Tiến hành pha loãng để kiểm soát mật độ tế bào ở 105 tế bào/ml . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. - Cho 100µl môi trường có tế bào vào mỗi giếng trên đĩa 96 giếng (mật độ mỗi giếng là 104 tế bào/giếng) và nuôi tế bào ở 37ºC, CO2 5% trong 24 giờ để ổn định tế bào. Ủ tế bào - Môi trường trong các giếng được loại bỏ. - Cho vào đó 100µl các dung dịch đã chuẩn bị ở từng nghiệm thức, ủ ở 37ºC, CO2 5% trong 24 giờ. Thử nghiệm MTT - Dung dịch trong các giếng được loại bỏ. - Cho vào mỗi giếng 10µl dung dịch MTT (5mg/ml) và 90µl môi trường tiêu chuẩn, ủ 4 giờ ở 37ºC, CO2 5%. - Quan sát ghi nhận các tinh thể formazan màu xanh tím được tạo ra. - Hút bỏ toàn bộ môi trường. - Cho vào đó 100µl dung dịch DMSO/Ethanol (tỷ lệ 1:1), huyền phù đều trong mỗi giếng để hòa tan các tinh thể formazan tạo thành dung dịch đồng nhất và tiến hành đo độ hấp thu quang học OD ở bước sóng 570nm bằng máy đo. 2.4.3.3 Đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric lên sự tăng sinh của hPDLSCs ✓ Cơ sở khoa học Đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric lên sự tăng sinh của hPDLSCs bằng phương pháp đếm số lượng tế bào trong mỗi giếng tại thời điểm ngày thứ 1, 3, 5, 7, 9 bằng kính hiển vi quang học. Phương pháp này giúp đánh giá được khả năng tăng trưởng của tế bào ở thời điểm khảo sát. ✓ Tiêu chí đánh giá So sánh sự tăng sinh tế bào tại các thời điểm ngày thứ 3, 5, 7, 9 với ngày thứ 1 ở mỗi nhóm. So sánh số lượng tế bào giữa các nhóm thí nghiệm với nhau và với nhóm chứng ở cùng thời điểm khảo sát. ✓ Phương pháp thực hiện Thử nghiệm thực hiện trên các nghiệm thức (mỗi nghiệm thức 3 giếng) . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. - Dung dịch Acid Boric 0,5% - Dung dịch Acid Boric 0,75% - Môi trường tiêu chuẩn (Nhóm chứng) Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa 96 giếng. Chuẩn bị tế bào - Nuôi hPDLSCs cho đến khi tế bào tăng sinh bao phủ khoảng 75 - 80% bề mặt đĩa nuôi thì tiến hành tách tế bào và cấy vào đĩa khảo sát. - Tách tế bào bằng cách bổ sung 1ml Trypsin - EDTA, ủ 2 phút. - Bổ sung 2ml môi trường để bất hoạt Trypsin, ly tâm 3000 vòng/5 phút thu cặn tế bào. - Tiến hành pha loãng để kiểm soát mật độ tế bào ở 104 tế bào/ml - Cho 100µl môi trường có tế bào vào mỗi giếng trên đĩa 96 giếng (mật độ mỗi giếng là 103 tế bào/giếng) và nuôi tế bào ở 37ºC, CO2 5% trong 24 giờ để ổn định tế bào. Ủ tế bào - Môi trường trong các giếng được loại bỏ. Sau đó chia thành 2 nhóm: + Nhóm 1: trong Acid Boric dài hạn: cho vào mỗi giếng 100µl các dung dịch đã chuẩn bị ở từng nghiệm thức. Tiến hành đếm số lượng tế bào trong các nhóm tại thời điểm ngày thứ 1, 3, 5, 7, 9 bằng kính hiển vi quang học. + Nhóm 2: trong Acid Boric 24 giờ: cho vào mỗi giếng 100µl các dung dịch đã chuẩn bị ở từng nghiệm thức. Sau 24 giờ, loại bỏ hết các dung dịch này, thay vào 100µl môi trường tiêu chuẩn. Sau đó, tiến hành đếm số lượng tế bào trong các nhóm tại thời điểm ngày thứ 1, 3, 5, 7, 9 bằng kính hiển vi quang học. - Các tế bào được nuôi ở 37ºC, CO2 5%. - Dung dịch ở từng nhóm được thay thế cách ngày. - Đếm 3 giếng của mỗi nhóm nghiệm thức, mỗi giếng đếm 2 lần. Cách đếm số lượng tế bào tương tự như ở Phần 2.4.3.1. 2.4.3.4 Đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric lên sự di cư của hPDLSCs ✓ Cơ sở khoa học . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. Đánh giá tác động của Acid Boric lên sự di cư của hPDLSCs bằng phương pháp Scratch wound healing tạo khoảng trống vô bào trên bề mặt đĩa nuôi cấy tế bào để mô phỏng tổn thương. Đánh giá sự lành thương thông qua sự di cư của tế bào vào vùng trống định tính bằng hình ảnh và định lượng mức độ di cư của tế bào dựa vào phần trăm diện tích vùng trống tại các thời điểm 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ. ✓ Tiêu chí đánh giá Đánh giá định tính dựa vào quan sát hình ảnh: ghi nhận bằng hình ảnh chụp dưới kính hiển vi đảo pha CKX53 (Olympus, Nhật) cùng phần mềm ghi nhận hình ảnh (CellSens) và so sánh với nhóm chứng. Đánh giá định lượng mức độ di cư của tế bào: bằng phần mềm phân tích hình ảnh Image-Analysis J 1.45S (Wayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, MD) dựa vào phần trăm diện tích vùng trống. Từ đó, so sánh định lượng mức độ di cư của hPDLSCs giữa các nhóm thí nghiệm và so với nhóm chứng. Diện tích vùng vô bào càng thu hẹp chứng tỏ tế bào di cư vào vùng này càng nhiều [42]. ✓ Phương pháp thực hiện Thử nghiệm thực hiện trên các nghiệm thức (mỗi nghiệm thức 3 giếng) - Dung dịch Acid Boric 0,5% - Dung dịch Acid Boric 0,75% - Môi trường tiêu chuẩn (Nhóm chứng) Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa 6 giếng. Chuẩn bị tế bào - Nuôi hPDLSCs cho đến khi tế bào tăng sinh bao phủ khoảng 75 - 80% bề mặt đĩa nuôi thì tiến hành tách tế bào và cấy vào đĩa khảo sát. - Tách tế bào bằng cách bổ sung 1ml Trypsin - EDTA, ủ 2 phút. - Bổ sung 2ml môi trường để bất hoạt Trypsin, ly tâm 3000 vòng/5 phút thu cặn tế bào. - Tiến hành pha loãng để kiểm soát mật độ tế bào ở 5 x 104 tế bào/ml - Cho 2ml môi trường có tế bào vào mỗi giếng trên đĩa 6 giếng (mật độ mỗi giếng là 105 tế bào/giếng) và nuôi tế bào ở 37ºC, CO2 5%. . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. Ủ tế bào - Quan sát tế bào đạt được độ bao phủ khoảng 75 - 80% thì loại bỏ môi trường. Thay vào đó môi trường DMEM/F12 không huyết thanh để qua đêm nhằm bỏ đói tế bào. - Môi trường trong các giếng được loại bỏ. Sau đó chia thành 2 nhóm: + Nhóm 1: trong Acid Boric dài hạn: cho vào mỗi giếng 2ml các dung dịch đã chuẩn bị ở từng nghiệm thức. Tạo vùng trống vô bào trên mỗi giếng bằng cách rạch 1 đường thẳng bằng đầu tip vô trùng 1000µl trên lớp đơn tế bào đang bám dính ở đáy. Đánh dấu điểm tham chiếu bằng bút lông để đảm bảo các vùng đánh giá không bị sai lệch giữa các lần khảo sát. Quan sát giếng dưới kính hiển vi đảo ngược, chụp ảnh ghi nhận sự di cư của tế bào tại thời điểm 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ. + Nhóm 2: trong Acid Boric 24 giờ: cho vào mỗi giếng 2ml các dung dịch đã chuẩn bị ở từng nghiệm thức. Sau 24 giờ, loại bỏ hết các dung dịch này, thay vào đó 2ml môi trường tiêu chuẩn. Tương tự như nhóm 1, tạo khoảng trống vô bào và đánh giá sự di cư của tế bào tại thời điểm 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ. 2.4.3.5 Đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric lên sự bám dính của hPDLSCs trên bề mặt chân răng đã xử lý ✓ Cơ sở khoa học Đánh giá tác động của Acid Boric lên sự bám dính của hPDLSCs bằng phương pháp MTT, quan sát sự hình thành các tinh thể formazan màu xanh tím do phản ứng của enzyme sucinate dehydrogenase trong tế bào sống với chất MTT trên bề mặt chân răng đã xử lý bằng kính hiển vi soi nổi. Số lượng tế bào sống càng lớn thì lượng tinh thể formazan được tạo thành càng nhiều chứng tỏ tế bào bám dính trên bề mặt chân răng càng nhiều. ✓ Tiêu chí đánh giá Ghi nhận sự hình thành tinh thể formazan màu xanh tím trên bề mặt chân răng đã xử lý bằng cách quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, so sánh giữa các nhóm với nhau. ✓ Phương pháp thực hiện . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. Thử nghiệm thực hiện trên các nghiệm thức (mỗi nghiệm thức 3 giếng) - Dung dịch Acid Boric 0,5% - Dung dịch Acid Boric 0,75% - Môi trường tiêu chuẩn (Nhóm chứng) Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa 4 giếng. Chuẩn bị bề mặt chân răng - Tiêu chuẩn chọn mẫu răng: các răng tiền cối còn nguyên vẹn, nhổ vì lí do chỉnh nha được thu nhận từ các Phòng khám Răng Hàm Mặt, Thành phố Hồ Chí Minh. Các răng sau khi vừa nhổ xong được cho vào trong ống Falcon và chuyển về phòng thí nghiệm. - Xử lý bề mặt chân răng: răng sau khi chuyển về phòng thí nghiệm sẽ được cắt bỏ phần thân răng, chân răng còn lại sẽ được cắt dọc thành 2 phần và điều chỉnh tạo thành khối có kích thước khoảng 1 x 1cm và tiến hành xử lý bề mặt chân răng thành hai nhóm: + Nhóm còn xê măng: cạo sạch hết mô mềm, mảng bám trên chân răng và để lại một phần xê măng bằng dụng cụ nạo Gracey. + Nhóm loại bỏ xê măng: dùng đĩa mài sạch hết mô mềm, mảng bám và cả phần xê măng chân răng cho đến khi gặp ngà răng. - Đánh giá kết quả xử lý bề mặt chân răng: bề mặt chân răng sau khi xử lý sẽ được đem đi chụp SEM (Scanning Electron Microscopy) tại trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Khu phố 6, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh để kiểm tra. - Phương pháp khử trùng: sau khi xử lý bề mặt chân răng, các mẫu răng của 2 nhóm còn và loại bỏ xê măng sẽ được khử trùng bằng tia gamma tại Trung tâm nghiên cứu và triển khai công nghệ bức xạ (202A Đường 11, Khu phố 5, Phường Linh Xuân, Quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh). Ủ chân răng Các chân răng được đặt vào đĩa 4 giếng. Thêm vào mỗi giếng 500µl các dung dịch đã chuẩn bị ở từng nghiệm thức, ủ trong 24 giờ (Hình 2.4). . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. Hình 2.3 Cách bố trí thí nghiệm Cấy hPDLSCs lên bề mặt chân răng đã xử lý - Hút hết dịch trong mỗi giếng, cho vào 20µl huyền phù hPDLSCs lên mỗi bề mặt chân răng đã xử lý với nhóm chứng là chân răng không cấy tế bào. - Sau 30 phút để ổn định tế bào, bổ sung mỗi giếng 500µl môi trường tiêu chuẩn, nuôi tế bào trong tủ ủ ở 37ºC, CO2 5% trong 24 giờ. Thử nghiệm MTT - Dung dịch trong các giếng được loại bỏ. - Thay vào mỗi giếng 50µl dung dịch MTT (5mg/ml) và 450µl môi trường tiêu chuẩn, ủ 4 giờ ở 37ºC, CO2 5%. - Quan sát các tinh thể formazan màu xanh tím được tạo ra trên bề mặt chân răng dưới kính hiển vi soi nổi. 2.4.4 Thu thập và phân tích số liệu Số liệu sau khi thu nhận được nhập vào máy tính và xử lý với phần mềm thống kê SPSS phiên bản 22.0 (IBM, NY). Thống kê mô tả: tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn. Thống kê suy lý: Sử dụng phép kiểm One - Sample T Test để so sánh phần trăm RGR của mỗi nhóm với 75% ở cùng 1 thời điểm trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric lên khả năng sống của hPDLSCs. . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. Sử dụng phép kiểm Paired - Sample T Test để so sánh số tế bào tăng sinh trung bình của các ngày (3, 5, 7 và 9) so với ngày thứ 1 trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric lên sự tăng sinh của hPDLSCs và so sánh phần trăm diện tích vùng trống hPDLSCs tại các thời điểm 24 giờ và 48 giờ với 0 giờ trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric lên sự di cư của hPDLSCs của mỗi nhóm. Phân tích phương sai một yếu tố One - way ANOVA (post hoc test Tukey HSD) được dùng để so sánh số lượng tế bào trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric lên sự tăng sinh của hPDLSCs và so sánh diện tích vùng trống hPDLSCs trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của Acid Boric lên sự di cư của hPDLSCs của các nhóm tại các thời điểm khác nhau. Các phép kiểm được tiến hành với độ tin cậy ở mức xác xuất p = 95%. 2.4.5 Kiểm soát sai lệch trong nghiên cứu. Trước khi thực hiện nghiên cứu, học viên thực hiện nghiên cứu được chuyên viên (giảng viên) phòng thí nghiệm hướng dẫn, huấn luyện các thao tác về kỹ thuật và thực hiện thí nghiệm giả định nhiều lần. Tất cả các thao tác cấy chuyền, đếm tế bào đến cấy tế bào ra đĩa trong các mẫu nghiên cứu đều thực hiện bởi cùng một người dưới sự giám sát của chuyên viên theo một quá trình chuẩn của Phòng thí nghiệm Kỹ nghệ mô và Vật liệu Y sinh (TEBM Lab) thuộc Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả đếm tế bào trong thí nghiệm tăng sinh được chuyên viên phòng thí nghiệm kiểm chứng bất kỳ 5 mẫu cho 1 lần đếm. Kết quả được chấp nhận khi sai số không quá ± 5 tế bào/vùng đếm tương ứng. . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA ACID BORIC LÊN KHẢ NĂNG SỐNG CỦA hPDLSCs 3.1.1 Kết quả nuôi cấy hPDLSCs Nguồn hPDLSCs được cung cấp ở thế hệ P3 từ Phòng thí nghiệm Kỹ nghệ mô và Vật liệu Y sinh thuộc Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Nguồn tế bào này đã được chứng minh biểu hiện những dấu ấn phân tử của tế bào gốc trung mô như CD44, CD73 và CD90 [6]. Hình thái của hPDLSCs được nhận dạng là tế bào bám dính, có nhân lớn hình oval và đuôi bào tương, tế bào có dạng hình thoi đồng đều trải dài trên bề mặt đĩa nuôi cấy (Hình 3.1). Các tế bào này tiếp tục tăng sinh và hợp dòng trải dài, đồng nhất, cuộn lại với nhau theo hình cung tròn (Hình 3.1 D). Những đặc điểm hình thái này được duy trì A B C D Hình 3.1 Hình dạng hPDLSCs ở thế hệ P4. A: ở vật kính 4x, B: ở vật kính 10x, C: ở vật kính 20x, D: sau khi tăng sinh và hợp dòng ở vật kính 4x. nhân lớn hình oval của hPDLSC, đuôi bào tương của hPDLSC .