Tài liệu Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm pseudomonas spp. bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGÔ THANH PHONG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM PSEUDOMONAS SPP. BÓN CHO CÂY LÚA CAO SẢN VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC Mã số 62 42 40 01 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS. CAO NGỌC ĐIỆP Cần Thơ - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGÔ THANH PHONG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM PSEUDOMONAS SPP. BÓN CHO CÂY LÚA CAO SẢN VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC Mã số 62 42 40 01 Cần Thơ - 2012 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ------------------------------------ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas spp. bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu Long” là của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Ngô Thanh Phong i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Thầy - PGS.TS. Cao Ngọc Điệp, người đã tận tâm hướng dẫn khoa học, tư vấn và giúp tôi tiếp cận các khía cạnh khoa học cho sự thành công của đề tài nghiên cứu sinh. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Phòng Đào Tạo, Phòng Quản Lý Khoa Học, Khoa Sau Đại Học và các Phòng Ban chức năng khác của Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi. Chân thành cảm ơn quí Thầy Cô và anh chị đồng nghiệp ở Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên và Viện Nghiên Cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trợ và tư vấn cho tôi trong thời gian học tập cũng như thực hiện luận án này. Cảm ơn ThS. Trần Thị Xuân Mai đã tư vấn thiết kế cặp mồi chuyên biệt cho Pseudomonas stutzeri A1501; cảm ơn ông Đào Văn Sơn (nông dân ở nông trường Sông Hậu) đã hỗ trợ đất ruộng để triển khai thí nghiệm chủng vi khuẩn cho cây lúa cao sản trồng ngoài đồng; cảm ơn các học viên cao học và các sinh viên đã có sự cộng tác trong thời gian qua. Chân thành cảm ơn Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp cơ sở đã có những ý kiến nhận xét và góp ý giúp cho luận án được hoàn chỉnh hơn trước khi trình phản biện kín và bảo vệ luận án cấp Trường; cảm ơn hai nhà khoa học đã tham gia phản biện kín cho luận án tiến sĩ; xin cảm ơn Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường. Cảm ơn gia đình và những người thân đã chia sẻ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi để tôi được an tâm học tập và hoàn thành luận án tiến sĩ. Xin chân thành cảm ơn! Ngô Thanh Phong ii TÓM LƯỢC Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas spp. bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện từ tháng 11 năm 2008 đến tháng 9 năm 2011. Những nội dung của đề tài đã được thực hiện nhằm đạt đến mục tiêu tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm hữu hiệu với cây lúa cao sản. Kết quả nghiên cứu của đề tài đã đạt được như sau: Phân lập được 150 dòng vi khuẩn cố định đạm từ 130 mẫu đất vùng rễ lúa của 13 tỉnh thành ở đồng bằng sông Cửu Long trên môi trường Pseudomonas Isolation Agar (Difco). Tất cả 150 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+ trong đó có 86/150 dòng có khả năng tổng hợp NH4+ cao hơn 5 mg/l. Các dòng tổng hợp NH4+ cao được phân tích PCR-16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 để nhận diện Pseudomonas. Kết quả có 55/86 dòng vi khuẩn có băng ở vị trí 1500 bp so với thang chuẩn. Tiếp tục phân tích PCRnifH rRNA với cặp mồi đặc hiệu PolF-115 và PolR-476 để nhận diện Pseudomonas có đoạn gen nifH , đã phát hiện 32/55 dòng vi khuẩn có băng tương ứng 361 bp so với thang chuẩn. Chọn 20 trong số 32 dòng vi khuẩn có đoạn gen nifH để kiểm chứng lại khả năng cố định nitơ và cả 20 dòng vi khuẩn đều biểu hiện hoạt tính của nitrogenase thông qua phương pháp khử acetylene (ARA). Đánh giá hiệu quả của 20 dòng vi khuẩn này lên chiều cao và trọng lượng khô của cây lúa cao sản trồng trong dung dịch khoáng (không sử dụng đạm) trong 20 ngày, đã chọn được 6 dòng vi khuẩn có độ hữu hiệu cao để tiến hành thí nghiệm trên cây lúa cao sản trồng trong chậu ở nhà lưới. Kết quả thí nghiệm đã xác định được 6 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp 25 – 75% nhu cầu đạm sinh học cho sự phát triển của cây lúa trồng trong chậu. Chọn 11 dòng vi khuẩn hữu hiệu nhất (bao gồm 6 dòng hiệu quả với cây lúa trồng trong chậu và 5 dòng khác cũng có triển vọng cố định đạm cao) để tiến hành định danh. Sử dụng cặp mồi PST3422-5 và PST3422-580 (được thiết kế nhận diện gen nifH của Pseudomonas stutzeri A1501), đã phát hiện 4/11 dòng có băng tương ứng 575 bp và tương đồng với băng của dòng vi khuẩn đối chứng là Pseudomonas stutzeri A1501 trong phổ điện di của các sản phẩm PCR. Kết quả giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI cho thấy cả 4 dòng này đều tương đồng di truyền 98-99% iii so với Pseudomonas stutzeri. Trong đó, hai dòng AG9 và BT2 tương đồng 99%, hai dòng TG1 và BT1 tương đồng 98% với dòng CP000304.1 Pseudomonas stutzeri A1501 và dòng CP002881.1 Pseudomonas stutzeri ATCC 17588. DNA của 7/11 dòng vi khuẩn còn lại được tiếp tục giải trình tự (theo sản phẩm PCR dựa trên cặp mồi FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 tương ứng với đoạn 16S rRNA của Pseudomonas) và so sánh với các dòng có trong ngân hàng dữ liệu NCBI. Kết quả cho thấy cả 7 dòng này đều tương đồng di truyền 97-100% so với các loài thuộc giống Burkholderia. Trong đó, dòng CT1 tương đồng 100% với dòng AB568313.1 Burkholderia vietnamiensis 16S-rRNA, dòng VL2 tương đồng 99% với FJ436055.1 Burkholderia vietnamiensis dòng SYe-6586, dòng KG14 tương đồng 99% với DQ979871.1 Burkholderia vietnamiensis dòng AU0829, dòng VL8 tương đồng 98% với EF158393.1 Burkholderia vietnamiensis dòng TVV75, dòng KG1 tương đồng 98% với DQ979872.1 Burkholderia vietnamiensis dòng AU0913, dòng CM1 và KG8 cùng tương đồng 97% với AY098590.1 Burkholderia kururiensis dòng KP23 (dòng KG8 cũng tương đồng 97% với AY098588.1 Burkholderia brasilensis dòng M113) có trong ngân hàng dữ liệu NCBI. Thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện để đánh giá khả năng cố định đạm của 4 dòng vi khuẩn P. stutzeri PS1 (TG1), P. stutzeri PS4 (BT1), B. vietnamiensis BV3 (KG1) và B. vietnamiensis BV5 (CT1) (được chọn lọc từ 6 dòng vi khuẩn đã thí nghiệm trong nhà lưới) trên cây lúa cao sản (OM2517) trồng trên đất phù sa tại nông trường Sông Hậu – Cần Thơ vào vụ Hè Thu 2011. Kết quả cho thấy từng dòng vi khuẩn P. stutzeri PS4 và B. vietnamiensis BV3 đều cung cấp đến 50% đạm sinh học trong khi dòng P. stutzeri PS1 và B. vietnamiensis BV5 chỉ cung cấp được 25% nhu cầu đạm sinh học cho sự phát triển của cây lúa cao sản. Từ khóa: Burkholderia vietnamiensis, cố định đạm sinh học, đất phù sa, đất vùng rễ, gen nif, lúa cao sản, Pseudomonas stutzeri iv SUMMARY Thesis "Isolation and selection of nitrogen-fixing bacteria Pseudomonas spp., it’s application on high-yielding rice cultivated on the alluvial soil of the Mekong Delta" was done from November 2008 to September 2011. The aim of this study was isolation and selection Pseudomonas spp. strains with the high biological nitrogen fixation (BNF) ability to apply to high-yielding rice cultivated on the soil of the Mekong Delta. The results achieved as follows: One hundred and fifty isolates were isolated from 130 soil samples (rice rhizosphere soils of 13 provinces in Mekong Delta). All of them were able to synthesize NH4+, 86/150 isolates synthesized NH4+ higher than 5 mg/l. The effective isolates (high NH4+ biosynthesis) were analysed by PCR-16S rRNA technique with primers FGPS4-281bis and FGPS1509'-153 to identify Pseudomonas spp. The results showed that 55/86 isolates having band at 1500 bp in comparision to standard ladder; 32/55 isolates were determined nifH gene with PCR technique with specific primer PolF-115 and PolR-476 which had band at 361 bp in electrophoresis gel. Twenty isolates in 32 isolates had high nitrogenase activity through ARA method. Screening of 20 isolates by evaluation of 20 isolates’s effectiveness on rice cultivated mineral solution free N in 20 days (in-vitro), the results showed that six isolates having high BNF ability manifested on height and dry weight of high-yielding rice. With in-pots experiment, these six isolates provided 25 to 75% nitrogen requirement in the rice growth. Using primer PST3422-5 and PST3422-580 in PCR technique identified 4/11 isolates having band 575 bp together with reference strain (P. stutzeri A1501) in electrophoresis. Isolates were sequenced, DNA sequencing were compared with GenBank database of NCBI by BLAST N software; the results showed that four isolates were similarity of 98-99% with P. stutzeri, such as AG9 and BT2 strains were similarity of 99%, TG1 and BT1 strains were similarity of 98% with both strains CP000304.1 Pseudomonas stutzeri A1501 and CP002881.1 Pseudomonas stutzeri ATCC 17588. Besides that, seven isolates were further sequenced with DNA from PCR-16S rRNA products, the results showed that all of them were 97-100% similarity v with species of the genus Burkholderia, such as CT1 strain was similarity of 100% with AB568313.1 Burkholderia vietnamiensis 16S-rRNA, VL2 strain was similarity of 99% with FJ436055.1 Burkholderia vietnamiensis strain SYe-6586, KG14 strain was similarity of 99% with DQ979871.1 Burkholderia vietnamiensis strain AU0829, VL8 strain was similarity of 98% with EF158393.1 Burkholderia vietnamiensis strain TVV75, KG1 strain was similarity of 98% with DQ979872.1 Burkholderia vietnamiensis strain AU0913, two strains CM1 and KG8 strain were similarity of 97% with AY098590.1 Burkholderia kururiensis strain KP23 (in which one isolates the identity 97% with AY098588.1 Burkholderia brasilensis strain M113) in the GenBank database of NCBI. A field experiment was conducted to evaluate biological nitrogen fixation ability of four isolates (P. stutzeri PS1, P. stutzeri PS4, B. vietnamiensis BV3 and B. vietnamiensis BV5 and they were selected from in-vitro and in-pots experiments) on high-yielding rice (OM2517) cultivated on alluvial soil of Song Hau farm, Can Tho city in Summer-Autumn cropping-season 2011. The results showed that PS4 strain and/or BV3 strain had biological nitrogen fixation ability equivalent to 50% inorganic fertilizer while two strains (PS1 and/or BV5) only provided 25% nitrogen requirement for rice growth. Keywords: alluvial soil, biological nitrogen fixation, Burkholderia vietnamiensis, high-yielding rice, nif gene, Pseudomonas stutzeri, rhizosphere soil vi MỤC LỤC Trang Lời cam đoan ............................................................................................................ i Lời cảm ơn ............................................................................................................... ii TÓM LƢỢC ............................................................................................................ iii SUMMARY .............................................................................................................. v MỤC LỤC ................................................................................................................ vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... xi DANH SÁCH BẢNG .............................................................................................. xii DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................... xiii CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU – TỔNG QUAN ĐỀ TÀI .1. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................... 1 .2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu ..................................................................... 3 .3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ..................................................................... 4 .4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 4 .5. Những đóng góp của luận án ............................................................................ 5 .6. Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học ................................................................ 6 CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cố định đạm sinh học ………………................................................................. 7 2.1.1. Khái quát về cố định đạm sinh học ...................................................... 7 2.1.2. Chu trình nitơ …………........................................................................ 8 2.1.3. Vi khuẩn cố định đạm sống tự do …………………............................. 10 2.2. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas ................................................................ 11 2.2.1. Đặc điểm của Pseudomonas ................................................................. 11 2.2.2. Phân loại Pseudomonas ........................................................................ 13 2.2.3. Những loài Pseudomonas có khả năng cố định đạm ............................ 15 2.2.4. Phân lập và xác định Pseudomonas ..................................................... 16 2.3. Cơ chế cố định đạm của Pseudomonas .............................................................. 17 vii 2.3.1. Enzyme nitrogenase ............................................................................. 17 2.3.2. Bộ gen của Pseudomonas và sự điều khiển tổng hợp nitrogenase ..... 20 2.3.3. Cơ chế cố định đạm .............................................................................. 24 2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm ................................ 25 2.4. Ứng dụng cố định đạm của Pseudomonas .......................................................... 28 2.4.1. Một số ứng dụng .................................................................................. 28 2.4.2. Triển vọng ứng dụng Pseudomonas trong tương lai ............................ 30 2.5. Vai trò của đạm đối với cây lúa .......................................................................... 31 CHƢƠNG III: NỘI DUNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 33 3.2. Phương tiện nghiên cứu ..................................................................................... 33 3.2.1. Vật liệu ................................................................................................. 33 3.2.2. Dụng cụ ................................................................................................ 34 3.2.3. Thiết bị ................................................................................................. 34 3.2.4. Các loại hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn ............................. 35 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Thu mẫu đất vùng rễ lúa ...................................................................... 38 3.3.2. Phân lập vi khuẩn cố định đạm từ đất vùng rễ lúa .............................. 38 3.3.3. Xác định khả năng cố định đạm (in-vitro) của vi khuẩn ..................... 40 3.3.3.1. Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Burk không đạm ..................... 40 3.3.3.2. Đo hàm lượng NH4+ bằng phương pháp Phenol – Nitroprusside...... 41 3.3.3.3. Thử hoạt tính nitrogenase bằng phương pháp khử acetylen (ARA)... 42 3.3.4. Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử ....................... 43 3.3.4.1. Tách chiết DNA (Neumann et al., 1992) .......................................... 43 3.3.4.2. Khuếch đại DNA .............................................................................. 45 3.3.4.3. Điện di các sản phẩm PCR ............................................................... 46 3.3.4.4. Chụp hình gel điện di chứa sản phẩm phản ứng PCR ........ .............. 46 3.3.4.5. Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI ............. 47 viii 3.3.5. Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản ............................................................................. 47 3.3.5.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn lên cây lúa trồng trong ống nghiệm .......... 47 3.3.5.2. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa trồng trong chậu .... 49 3.3.5.3. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa ngoài đồng ............ 50 3.3.6. Khảo sát mật số vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường lỏng .................. 51 3.3.7. Thống kê, xử lý và phân tích số liệu ……………………………….... 52 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu mẫu đất vùng rễ lúa ........................................................................ 53 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm ............................................................. 53 4.2.1. Các dòng vi khuẩn đã được phân lập ………………………………… 53 4.2.2. Đặc điểm của khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn …………………………. 54 4.3. Kết quả đánh giá khả năng cố định đạm của vi khuẩn ....................................... 56 4.3.1. Khả năng tổng hợp NH4+……………………………………………... 56 4.3.2. Hoạt tính nitrogenase …………………………………………............ 60 4.4. Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử ..................................... 63 4.4.1. Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR................................. 63 4.4.2. Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI ................ 65 4.5. Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản .................... 72 4.5.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn với cây lúa trồng trong ống nghiệm ……..... 72 4.5.2. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa trong chậu …............. 73 4.5.3. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa ngoài đồng ................ 77 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận ............................................................................................................... 87 5.2. Đề nghị ................................................................................................................88 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................. 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 90 ix PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một số loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn .............................................. a Phụ lục 2: Môi trường trích DNA và phản ứng PCR ............................................... b Phụ lục 3: Chuẩn bị gel agarose và điện di ............... ............................................... d Phụ lục 4: Qui trình giải trình tự DNA ...................................................................... e Phụ lục 5: Phân bón cho cây lúa thí nghiệm trong chậu và ngoài đồng .................... h Phụ lục 6: Phân tích đạm tổng số bằng phương pháp micro-Kjeldahl ...................... j Phụ lục 7: Đường chuẩn đo NH4+ .............................................................................. k Phụ lục 8: Bảng kết quả thu mẫu đất vùng rễ lúa và phân lập vi khuẩn .................... k Phụ lục 9: Bảng đặc điểm khuẩn lạc và hình dạng tế bào của 150 dòng vi khuẩn…. m Phụ lục 10: Khả năng phát triển và tổng hợp NH4+ của 150 dòng vi khuẩn.............. p Phụ lục 11: Xử lý số liệu của thí nghiệm trồng lúa in-vitro....................................... u Phụ lục 12: Xử lý số liệu của các thí nghiệm trong chậu (in-pots) ............................w Phụ lục 13: Xử lý số liệu của các thí nghiệm ngoài đồng ......................................... aa Phục lụ 14: Trình tự DNA của các dòng vi khuẩn BV và BK …………………....... hh Phụ lục 15: Bảng kết quả khử acetylen của 20 dòng vi khuẩn ……………………. oo x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 16S-rRNA/DNA gene 16S-ribosomal RNA/DNA coding gene ARA Acetylene reduction assay BNF Biological nitrogen fixation Blast Basic local alignmeht search tool BV, BK Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia kururiensis DNA, rRNA Deoxyribonucleic acid, ribosomal ribonucleic acid dNTP Deoxy nucleoside triphotphate ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium Bromide Gen nif Nitrogen fixing gene HG, ST, BL, CM Hậu Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau KG, AG, ĐT, TV Kiên Giang, An Giang, Đồng Tháp, Trà Vinh LA, TG, VL, BT, CT Long An, Tiền Giang. Vĩnh Long, Bến Tre, Cần Thơ NCBI National centre for biotechnology information NT Nghiệm thức PCR Polymerase chain reaction PS Pseudomonas stutzeri xi DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Bảng số liệu xây dựng đường chuẩn NH4+ 41 3.2 Các nghiệm thức trồng lúa trong ống nghiệm 48 3.3 Các nghiệm thức trồng lúa trong chậu 49 3.4 Các nghiệm thức trồng lúa ngoài đồng 50 4.1 Các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông 53 Cửu Long 4.2 Tỉ lệ phần trăm về các đặc điểm khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn 55 4.3 Bảng tổng hợp sự phát triển và khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng 58 vi khuẩn trong môi trường Burk lỏng không đạm 4.4 Mật số vi khuẩn (sau 2 ngày nuôi cấy) và hàm lượng NH4+ được tổng 60 hợp ở 20 dòng vi khuẩn 4.5 Hàm lượng NH4+ (mg/l) và hàm lượng nitrogenase (mM) được tổng 61 hợp ở 10 dòng vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy (đợt 1) 4.6 Hàm lượng NH4+ (mg/l) và hàm lượng nitrogenase (mM) được tổng 62 hợp ở 10 dòng vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy (đợt 2) 4.7 Hiệu quả của 20 dòng vi khuẩn lên chiều cao và trọng lượng khô cây 73 lúa ở giai đoạn 20 ngày tuổi 4.8 Hiệu quả của 6 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học trên thành phần 75 năng suất và năng suất lúa cao sản (thí nghiệm trong chậu) 4.9 Khả năng cố định đạm sinh học của 6 dòng vi khuẩn cho nhu cầu sinh 77 trưởng và phát triển của cây lúa cao sản (OM2517) (thí nghiệm trồng lúa trong chậu) 4.10 Hiệu quả của 4 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học trên thành phần năng suất lúa cao sản (OM2517) trồng trên đất phù sa nông trường Sông Hậu, huyện Cờ Đỏ, Cần Thơ (vụ Hè Thu 2011) xii 78 DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Chu trình nitơ 9 2.2 Quan hệ tương tác giữa vi sinh vật và thực vật ảnh hưởng đến sự tăng 10 trưởng của thực vật 2.3 Một số nguồn nitơ cung cấp cho cây 11 2.4 Pseudomonas dưới kính hiển vi điện tử 12 2.5 Khuẩn lạc của Pseudomonas stuzeri và Pseudomonas fluorescens 15 2.6 Cây di truyền (phylogenetic tree) biểu diễn mức độ tương quan di 16 truyền giữa các loài Pseudomonas dựa vào kết quả phân tích di truyền phân tử 2.7 Cây di truyền (phylogenetic tree) của các loài Burkholderia 17 2.8 Nitrogenase có khả năng xúc tác chuyển hóa, khử N2 thành NH3 18 2.9 Các thành phần protein cấu thành nitrogenase 19 2.10 “Vùng cố định đạm” (nitrogen fixation region) của Pseudomonas 22 stutzeri A1501 2.11 Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định đạm sinh học 25 2.12 Các phản ứng cố định đạm trong nitrogenase 26 3.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn từ mẫu đất vùng rễ lúa cho đến khi trữ ròng 40 3.2 Các ống nghiệm xây dựng đường chuẩn đo ammonium 42 3.3 Trồng lúa trong dung dịch khoáng có bổ sung 0,8% agar 48 3.4 Sơ đồ pha loãng mật số vi khuẩn 51 4.1 Hình ảnh một số khuẩn lạc (Theo thứ tự từ trái qua phải là các dòng 55 vi khuẩn TG7, BL4, LA7) 4.2 Dòng KG7 được chụp dưới kính hiển vi điện tử quét JSM 5500 ở độ 56 phóng đại 8500 lần 4.3 Dòng VL2 được chụp dưới kính hiển vi điện tử quét JSM 5500 ở độ 56 phóng đại 10000 lần 4.4 Mức độ tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn 57 4.5 Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi 63 khuẩn Pseudomonas với cặp mồi tổng (M: thang chuẩn 100bp plus) xiii Hình Tên hình Trang 4.6 Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi 64 khuẩn với cặp mồi xác định gen nifH (Thang chuẩn 100bp) 4.7 Phổ điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của 5 dòng P. 65 stutzeri A1501 (PS5), TG1, AG9, BT2 và BT1 4.8 So sánh trình tự DNA của dòng PS1 với GenBank 66 4.9 So sánh trình tự DNA của dòng PS2 với GenBank 66 4.10 So sánh trình tự DNA của dòng PS3 với GenBank 67 4.11 So sánh trình tự DNA của dòng PS4 với GenBank 67 4.12 So sánh trình tự DNA của dòng PS5 – Pseudomonas stutzeri A1501 68 (dòng vi khuẩn đối chứng) với GenBank 4.13 So sánh trình tự của 5 dòng P. stutzeri (PS1, PS2, PS3, PS4 và PS5) 69 với nhau cho thấy dòng PS1 và PS3 chỉ khác nhau 3 vị trí; dòng PS4 khác PS2 và PS5 (A1501) ở 8 vị trí. 4.14 Cây phả hệ (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ về mặt di truyền 70 giữa 4 dòng vi khuẩn với dòng chuẩn P. stutzeri A1501 4.15 Hiệu quả của vi khuẩn PS1 và phân đạm hóa học trên sự phát triển 77 của cây lúa và PS4 lên chiều cao cây lúa cao sản OM2517 4.16 Ruộng lúa thí nghiệm tại Nông trường Sông Hậu (trái) và các bụi lúa 79 ở các nghiệm thức chủng P. stutzeri PS4 (phải) được 89 ngày sau khi gieo sạ (trước khi thu hoạch 1 ngày). 4.17 Hiệu quả của 4 chủng vi khuẩn và phân đạm hóa học trên năng suất 80 lúa cao sản (tấn/ha) trồng trên đất phù sa Nông trường Sông Hậu, Cần Thơ (vụ Hè Thu 2011). 4.18 Tương quan tuyến tính giữa chiều cao cây và số bông/m2 với năng 81 suất lúa ở mức ý nghĩa 5% 4.19 Hiệu quả của 4 chủng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên hàm lượng 82 protein trong gạo (%) 4.20 Tương quan tuyến tính giữa hàm lượng protein trong gạo (%) với 83 năng suất lúa (tấn/ha) ở mức ý nghĩa 5% 4.21 Hiệu quả của 4 chủng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên nitơ tổng số (%) của đất trồng lúa ở Nông trường Sông Hậu, Cần Thơ xiv 84 xv CHƢƠNG I MỞ ĐẦU - TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI .1. Tính cấp thiết của đề tài Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích gần 4 triệu ha, trong đó có 1,7 triệu ha đất nông nghiệp được sử dụng để trồng lúa với diện tích canh tác lúa hàng năm lên đến 3,9 triệu ha (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2008). Phân bón nói chung và phân đạm hoá học nói riêng đã góp phần quan trọng trong việc gia tăng năng suất cây trồng. Để đảm bảo năng suất, nông dân đã sử dụng rất nhiều phân bón nhưng hiện nay giá cả phân bón hóa học ngày càng tăng cao làm tăng giá thành sản xuất và giảm hiệu quả kinh tế trong nông nghiệp. Sự lạm dụng phân đạm hóa học sẽ dẫn đến chi phí cao, đồng thời cũng sẽ dẫn đến những hậu quả như thay đổi lý, hóa tính của đất, giảm độ phì, mất cân bằng sinh thái... gây ảnh hưởng tiêu cực lên hệ sinh thái nên không đảm bảo thân thiện với môi trường canh tác trong nông nghiệp (Kannaiyan, 1999). Theo Võ Minh Kha (2003), cây lúa hấp thu chỉ khoảng 50-60% lượng đạm được bón vào trong đất. Số còn lại sẽ được lưu tồn trong đất hoặc bị rửa trôi gây hưởng đến môi trường nước. Bón quá nhiều phân đạm hóa học cho cây trồng đã góp phần dẫn đến chi phí sản xuất cao, hiệu quả kinh tế thấp, đồng thời không đảm bảo cho một hệ sinh thái phát triển bền vững. Để khắc phục những tác hại do sử dụng quá nhiều phân đạm hóa học thì việc sử dụng phân đạm sinh học có chứa các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm (BNF: biological nitrogen fixation) là một trong những biện pháp có hiệu quả mà không gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí sản xuất nhưng vẫn đảm bảo chất lượng đồng thời vẫn tăng năng suất nông sản. Việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn cố định đạm sinh học đã và đang là những đề tài được nghiên cứu rộng rãi khắp thế giới. Những vi khuẩn cố định đạm đã được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng như vi khuẩn Rhizobium (Keyser và ctv., 1982; Scholla và Elkan, 1984); Bradyrhizobium cố định đạm với cây họ đậu (Elkan, 1992; Dowdlé và Bohlool, 1987; Buendia-Clavaria và ctv., 1994); vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và 1 các chất dinh dưỡng khác (Bilal và ctv., 1990; Seshadri và ctv., 2000; Somers và ctv., 2005; Lăng Ngọc Dậu và ctv., 2007), loài Azospirillum lipoferum cũng đã được phân lập từ cây lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2007); vi khuẩn Azotobacter có khả năng cố định đạm (Döbereiner, 1974), như loài Azotobacter paspali là loài vi khuẩn nội sinh đặc hiệu cho cây cỏ Paspalum notatum và khoai lang (Döbereiner, 1976); vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có một số đặc tính như cố định đạm, tổng hợp kích thích tố tăng trưởng ở thực vật (phytohormone) như auxin và gibberellin, làm giảm độ pH môi trường để hòa tan lân khó tan (Bastian và ctv., 1998; Muthukumarasamy và ctv., 2002a; Tejera và ctv., 2003; Madhaiyan và ctv., 2004), chúng thường hiện diện ở đất quanh rễ cây cà phê, khóm, lúa, khoai lang (Jimenaz-Salgalo và ctv., 1997; Hernandez và ctv., 2000; Muthukumarasamy và ctv., 2002b) đồng thời cũng xác định được nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định đạm mạnh mẽ làm tăng sản lượng mía đường, khóm, khoai lang (Prabudoss và Stella, 2009); vi khuẩn Burkholderia có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần với những cây họ đậu vùng nhiệt đới (Mounlin và ctv., 2001), cộng sinh với nhiều loại cây trồng giúp cố định đạm và kích thích sự tăng trưởng khi chúng hiện diện ở đất quanh vùng rễ và trong rễ của một số loại cây trồng như bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpella và ctv., 2003; Chen và ctv., 2006), khóm, chuối (Weber và ctv., 1999) và loài Burkholderia vietnamiensis đã được tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Việt Nam (Gillis và ctv., 1995); Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển thực vật như tổng hợp kích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae (Glickmann et al, 1998; Patten và Glick, 1987; Suzuki và ctv., 2003; Xie và ctv., 1996), hòa tan lân ở dạng khó tan thành dạng dễ tan giúp cây trồng hấp thụ như: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas chlororaphis (Cattenlla và ctv., 1999), cố định đạm như Pseudomonas stutzeri (Krotzky và Werner, 1987). 2 Các loài thuộc giống Pseudomonas có khả năng cố định đạm đã được khẳng định từ lâu (Chan và ctv., 1994), trong đó có Pseudomonas stutzeri (Krotzky và Werner, 1987; Vermeiren, 1999). Ngoài ra, các nhà khoa học cũng đã xác định một số loài vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm và giúp tăng năng suất lúa (Gillis và ctv., 1995; Tran Van và ctv., 2000; Nguyễn Ngọc Dũng và ctv., 2000). Hiện nay, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu và sử dụng các chủng vi khuẩn cố định đạm sinh học. Việc nghiên cứu ứng dụng các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu bón cho cây lúa ở đồng bằng sông Cửu Long mang tính cấp thiết nhằm góp phần giảm sử dụng phân đạm hóa học cho cây lúa nhưng vẫn giữ vững năng suất, bảo vệ môi trường và góp phần đảm bảo cho sự phát triển nông nghiệp bền vững trong khu vực. Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas spp. bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện nhằm nhận diện và xác định được những dòng Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm hữu hiệu trên cây lúa cao sản. .2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu - Mục tiêu chính: Chọn lọc được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. mang gen nif có khả năng cố định đạm hữu hiệu, cung cấp 25-50% nhu cầu đạm cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa cao sản. - Mục tiêu cụ thể: (1) Phân lập và tách ròng các dòng Pseudomonas bản địa có trong đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông Cửu Long làm nguồn vi khuẩn cố định đạm với cây lúa cao sản; (2) Khảo sát đặc điểm, khả năng cố định đạm sinh học và nhận diện vi khuẩn Pseudomonas trên các mức độ hình thái, hóa sinh và sinh học phân tử (DNA); (3) Đánh giá hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản ở mức độ in-vitro cho đến nhà lưới và ngoài đồng ruộng. 3