Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát hiện nhanh tụ cầu vàng (Staphylococcus aure...

Tài liệu Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát hiện nhanh tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR.

.PDF
66
3426
128

Mô tả:

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN TUẤN ANH Tên đề tài: BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TỤ CẦU VÀNG (Staphylococcus aureus) KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính Quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 – 2015 Thái Nguyên, năm 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN TUẤN ANH Tên đề tài: BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TỤ CẦU VÀNG (Staphylococcus aureus) KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính Quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Lớp : K43 CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 – 2015 Giảng viên hƣớng dẫn: 1.BS Nguyễn Thị Huyền 2. TS Nguyễn Văn Duy Thái Nguyên, năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy và đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt những năm học vừa qua. Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS. Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài. BS. Nguyễn Thị Huyền, CN. Trần Trung Anh, cùng các KTV. Nguyễn Thị Thủy, Trương Thùy Vi, Dương Minh Phương, Khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi và đã cung cấp các chủng sinh vật để thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn bố mẹ và những người bạn đã luôn ở bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 20 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Tuấn Anh ii DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT CIAA Hỗn hợp gồm 24 chloroform : 1 isoamylalcohol (v/v) CFU Colony Forming Unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc DNA Deoxyribonucleic Acid dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates (Hỗn hợp gồm dATP, dGTP, dCTP, dTTP) OD Optical Density - Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi trùng hợp - chỉ quá trình tổng khuếch đại vùng DNA đặc hiệu in vitro RNA Ribonucleic Acid VSV Vi sinh vật BP Môi trường Baird Parker ELSA Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme VK Vi khuẩn KS Kháng sinh MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus WHO Tổ chức Y tế Thế giới VRSA Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus S. aureus Staphylococcus aureus ANSORP mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á PBP Biến đổi các protein liên kết với Penicillin iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 21 Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu ..................................... 21 Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.................................................. 22 Bảng 4.1: Kiểu hình của 17 chủng S. aureus phân lập được tại Bệnh viên Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên ..................................................................................... 33 Bảng 4.2. Bảng khảo sát tỷ lệ vi khuẩn S. aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên ........................................... 36 Bảng 4.3: Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ 17 chủng S. aureus phân lập được .. 39 Bảng 4.4: So sánh sự có mặt của gen mecA với kiểu hình kháng Methicillin của các chủng Staphylococcus aureus thu thập được.................................................. 43 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Hình thái Staphylococcus aureus ............................................................ 6 Hình 4.1: Phân lập S. aureus trên môi trường thạch máu ..................................... 31 Hình 4.2: Hình ảnh kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ với chủng S. aureus (S4) ......... 32 Hình 4.3: Điện di kiểm tra dung dịch DNA tổng số tách chiết từ một số mẫu S. aureus .................................................................................................................... 39 Hình 4.4: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR .. 41 Hình 4.5: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm Multiplex PCR sử dụng cặp mồi MecAF-MecAR và NucF-NucR ........................................................................... 42 v MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề......................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ......................................................................... 3 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 3 1.2.2. Yêu cầu của đề tài ......................................................................................... 3 1.3. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................. 3 1.3.1. Ý nghĩa trong khoa học ................................................................................. 3 1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ................................................................................. 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4 2.1. Giới thiệu về Staphylococcus: .......................................................................... 4 2.1.1. Lịch sử phát hiện .......................................................................................... 4 2.1.2. Đặc điểm hình thái ....................................................................................... 5 2.1.3. Danh pháp và phân loại của S. aureus .......................................................... 5 2.2. Cấu trúc di truyền của S. aureus .................................................................... 6 2.3. Các chỉ thị phân tử của S. aureus ..................................................................... 7 2.4. Đặc tính sinh học của S. aureus ....................................................................... 8 2.5.Cơ chế gây bệnh ................................................................................................ 9 2.6. Tình Hình Nghiên Cứu Tính Kháng Thuốc Ở S. aureus ................................. 9 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................ 9 2.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước................................................................ 10 2.7. Cơ chế đề kháng kháng sinh .......................................................................... 13 2.7.1. Ức chế bằng enzyme ................................................................................... 13 2.7.2. Giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn ........................................................... 14 2.7.3. Biến đổi vị trí gắn kết .................................................................................. 15 2.7.4. Bơm đẩy ...................................................................................................... 16 vi 2.7.5. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm β-lactam ............................... 17 2.8. Các phương pháp phát hiện S. aureus kháng thuốc ....................................... 18 2.8.1. Phương pháp vi sinh .................................................................................... 18 2.8.2. Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC) ....................... 18 2.8.3. Kỹ thuật PCR .............................................................................................. 19 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 20 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.................................................................. 20 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 20 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ..................................................................................... 20 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu .................................................. 20 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 20 3.2.2. Thời gian nghiên cứu .................................................................................. 20 3.3. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 20 3.3.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài ................................................................ 20 3.3.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài ..................................................................... 21 3.3.3. Dụng cụ, thiết bị .......................................................................................... 22 3.4. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 22 3.4.1. Khảo sát tỷ lệ vi khuẩn S. aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên ..................................................... 22 3.4.2. Phân lập vi khuẩn S. aureus kháng thuốc ................................................... 22 3.4.3. Phát hiện nhanh S. aureus kháng methicillin bằng kỹ thuật PCR .............. 22 3.5. Phương Pháp Nghiên Cứu.............................................................................. 23 3.5.1. Phương pháp phân lập S. aureus, và làm kháng sinh đồ từ các bệnh nhân làm tại bệnh viên). ................................................................................................ 23 3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng hóa chất CTAB ................ 27 3.5.3. Phản ứng PCR ............................................................................................ 29 3.5.4. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR ........................................... 30 vii PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 31 4.1. Kết quả phân lập 17 chủng S. aureus kháng thuốc kháng sinh tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên ...................................................................... 31 4.2. Khảo sát tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của các chủng S. aureus trên các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên .......................... 36 4.3. Thử nghiệm khả năng phát hiện nhanh S. aureus kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử .................................................................................................... 38 4.3.1. Tách chiết DNA tổng số.............................................................................. 38 4.3.2. Kiểm định các chủng S. aureus ................................................................... 40 4.3.3. Nghiên cứu khả năng phát hiện nhanh vi khuẩn S. aureus kháng thuốc .... 41 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 46 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 46 5.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Loài Staphylococcus aureus là một trong số các vi khuẩn ký sinh ở trên da và niêm mạc, nhiều nhất là ở mũi. Có khoảng 10-40% người khỏe mạnh mang S. aureus (Trần Thị Như Hoa, 2012) [6]. Khi có những tổn thương ở da và niêm mạc kèm theo những rối loạn về chức năng thì các nhiễm trùng do S. aureus dễ dàng xuất hiện. Hiện nay, hiện tượng S. aureus kháng kháng sinh trở nên khá phổ biến do tình trạng sử dụng kháng sinh ngày càng nhiều ở cộng đồng với những kháng sinh có hoạt phổ rộng, nhiều loại kháng sinh khác nhau với liều lượng không đúng. Hiện tượng kháng thuốc không chỉ xuất hiện ở các vi khuẩn trong bệnh viện mà còn trên các vi khuẩn ở cộng đồng ngoài bệnh viện. Việc nghiên cứu mức độ kháng thuốc ở vi khuẩn là vấn đề rất cần thiết nhằm theo dõi diễn biến kháng thuốc, dự báo xu thế kháng thuốc và đề ra những biện pháp thích hợp nhằm hạn chế mức gia tăng tính kháng thuốc từ đó giúp cho việc sử dụng kháng sinh ở cộng đồng hợp lý và tiết kiệm (Trần Thị Như Hoa, 2012) [6]. Theo một kết quả khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S. aureus phân lập từ bệnh phẩm có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006) [8]. Cũng theo một báo cáo khác từ tháng 8/2012 - tháng 8/2013, một nghiên cứu với 143 chủng S. aureus về tỉ lệ đề kháng KS của S. aureus trong 4.299 bệnh phẩm, được phân lập tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả cho thấy: S. aureus chiếm 23,6%, đa số được phân lập từ bệnh phẩm mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nước tiểu (11,9%) và phân (10,5%). Qua kết quả từ kháng sinh đồ (KSĐ), tỉ lệ đề kháng của S. 2 aureus với các KS là 93,7% với Penicilline G, 65,0% với Erythromycine, 60,8% với Kanamycine, 58% với Clindamycine. Tỉ lệ MRSA là 39,2% (Nguyễn Hữu An, 2013) [1]. Với việc phát hiện tính kháng thuốc ở vi khuẩn hiện nay chủ yếu dựa trên cơ sở nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường chứa kháng sinh. Đây là phương pháp đã được khẳng định có độ chính xác cao nhưng tốn thời gian và phải thực hiện nhiều thao tác nuôi cấy phức tạp. Việc phát hiện chậm tính kháng thuốc ở vi khuẩn cũng là nguyên nhân góp phần làm cho các chủng vi khuẩn kháng thuốc có cơ hội lây lan. Do đó, việc phát hiện nhanh vi khuẩn kháng thuốc là một yêu cầu cần thiết góp phần giảm nguy cơ lây lan của các vi khuẩn kháng thuốc này, đặc biệt trong môi trường bệnh viện. Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu công bố về các chỉ thị phân tử liên quan đến tính kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn nói chung và S. aureus nói riêng. Đây là những tiền đề cho việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phát hiện nhanh vi khuẩn kháng thuốc. Có nhiều phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn kháng thuốc đã được nghiên cứu công bố như giải trình tự gen, các kỹ thuật PCR, DNA arrays, ELISA… Trong đó PCR là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp nên rất thuận lợi trong việc áp dụng thực tiễn chẩn đoán. Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu của Khoa CNSH và CNTP - Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại Học Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Bƣớc đầu nghiên cứu phƣơng pháp phát hiện nhanh tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR” Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát mức độ kháng thuốc kháng sinh của S. aureus tại các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Thái Nguyên trong thời gian từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5 3 năm 2015 và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nhanh vi khuẩn này kháng Methicillin - 1 trong những thuốc kháng sinh được điều trị phổ biến và có tỷ lệ kháng thuốc cao. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát được thực trạng kháng thuốc của vi khuẩn S. aureus tại Bệnh viện Đa khoa Thái Nguyên và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh S. aureus kháng Methicillin. 1.2.2. Yêu cầu của đề tài - Khảo sát được tỷ lệ vi khuẩn S. aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên. - Phân lập được vi khuẩn S. aureus kháng thuốc. - Ứng dụng được kỹ thuật PCR phát hiện nhanh S. aureus kháng thuốc. 1.3. Ý nghĩa của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa trong khoa học Đánh giá được thực trạng S. aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên và nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phát hiện nhanh S. aureus kháng thuốc. 1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn Nghiên cứu được kỹ thuật phát hiện nhanh S. aureus kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR. Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho việc xây dựng phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn kháng kháng sinh góp phần điều trị có hiệu quả bệnh nhân nhiễm trùng, hạn chế sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong cộng đồng. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về Staphylococcus: Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, Staphylo (chùm nho) và coccus (hạt). Phân loại của vi khuẩn Staphylococcus như sau: o Giới: Prokaryote o Phân loại: Firmicute o Lớp: Firmibacteria o Họ: Micrococceae o Giống: Staphylococcus 2.1.1. Lịch sử phát hiện Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng. S. aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật (VSV) học. Năm 1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa sự hiện diện của hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948, phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi Báo cáo của (Nguyễn Thị An. 2011) [2]. 5 2.1.2. Đặc điểm hình thái Staphylococcus là vi khuẩn gram dương, hình cầu đường kính 0,5 - 1,5 µm, có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùm nho. Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên da và màng nhày của người và động vật máu nóng. Năm 1871, Recklinghausen thu được cầu khuẩn trong thận của bệnh nhân chết do bệnh nhiễm khuẩn huyết. Năm 1880, Alexander Ogston chứng minh được áp-xe sinh mủ là do cầu khuẩn dạng chùm và Ogston được công nhận là người khám phá và đặt tên cho tụ cầu - Staphylococcus vào năm 1882. Năm 1884, Rosenbach nghiên cứu và đặt tên cho cầu khuẩn tạo khuẩn lạc màu vàng là Staphylococcus pyrogen aureus (Scott E Martin, 2000) [41]. 2.1.3. Danh pháp và phân loại của S. aureus Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus, tên khoa học là Staphylococcus aureus (Baba T, 2002) [17]. Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm chính: tụ cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase. S. aureus gây bệnh ngộ độc thực phẩm là tụ cầu có coagulase. Nhờ enzyme này mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng nên còn được gọi là tụ cầu vàng (Phạm Văn Phúc, 2013) [10]. 6  Đặc điểm cấu trúc của Staphylococcus aureus (Hình 2.1) Hình 2.1: Hình thái Staphylococcus aureus 2.2. Cấu trúc di truyền của S. aureus Hiện nay người ta đã thành công trong giải trình tự gen của các chủng tụ cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315, Mn50, N315, Mu50, RF122… (Baird R.M, Lee W.H, 1995) [18] , Steven và cộng sự đã thành công trong việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng S. aureus COL. Kết quả giải trình tự đã được đăng kí trên Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen và CP000045 cho hệ gen plasmid. Theo đó, trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít nhất các cặp G-C, điều này gây ra mối quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới các tác nhân gây bệnh Gram dương khác (Gill S. R,2005) [23]. Trong số các chủng S. aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ giống enterotoxigenic được ước tính khoảng 25%. Tại pháp, trong số 61 chủng phân lập từ phomat và sữ tươi có 15,9% chủng là giống enterotoxigenic. Ở pháp, trong số 332 chủng S. aureus được phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa các 7 gen SEG, SEB, SEI, và SEJ suất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen SEA và SEE, trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế (Lâm Quốc Hùng, 2009) [7]. 2.3. Các chỉ thị phân tử của Staphylococcus aureus Chủng S. aureus sản xuất ra một enzyme ngoại bào chịu nhiệt nuclease (thermonuclease [Tnase] ) với tần số tương ứng với thời điểm mà nó sản xuất ra coagulase (Brakstad O.G, 1992) [20]. Các Tnase là một loại protein có khối lượng phân tử 17.000 Da. Nó là một endonuclease, làm giảm cả DNA, RNA và hoạt động của enzyme có thể chống lại nhiệt độ 1000C trong vòng 1 giờ (Brakstad O.G, 1992) [20]. Trong các phản ứng PCR phát hiện S. aureus, người ta thường dùng các mồi chuyên biệt để phát hiện gen nuc mã hóa nuclease chịu nhiệt (Sasaki T, 2010) [40]. Sasaki T. và cộng sự (2010) đã sử dụng gen nuc trong việc nhận dạng loài Staphylococci dương tính với cogulase bằng phương pháp mulyiplexPCR (Sasaki T, 2010) [40]. Brakstad O.G. và cộng sự (1992) đã sử dụng gen nuc làm gen chỉ thị trong phát hiện S. aureus bằng phản ứng khuếch đại gen nuc (Brakstad O.G, 1992) [20]. Wilson I.G. và cộng sự (1991) đã sử dụng gen nuc làm gen chỉ thị để phát hiện S. aureus trong sữa nghi ngờ bị nhiễm tụ cầu vàng (Wilson I. G, 1991) [44]. Ngoài ra theo nghiên cứu của Pinto B. và cộng sự (2004) cho biết có thể dùng các mồi chuyên biệt khác để phát hiện các gen mã hóa độc tố ruột (enterotoxin), gen tst (gây hội chứng sốc), gen eta và etb (mã hóa độc tố A và B gây mảng tróc), vùng đệm rDNA 16-23S và (Pinto B, 2005) [37]. Còn có nhiều phương pháp dựa trên PCR được dùng để phát hiện nhanh tụ cầu như inter-IS256 PCR, spa typing (Wei H. L, 2002) [43], hay phương pháp DNA fingerprinting cũng như phương pháp RLPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) để phân loại các dòng S. aureus và kỹ thuật PCR-RELP (Randomly Fragment Length Polymorphiism) để phân tích gen aroA (Pinto B, 2005) [37]. 8 2.4. Đặc tính sinh học của S. aureus S. aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme catalase phân giải oxy già, giải phóng oxy và nước: Catalase H2O2 H2O + O2 S. aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Đây được xem là tính chất đặc trưng của S. aureus, là tiêu chuẩn để phân biệt S. aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase: coagulase “cố định” (“bound” coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase “tự do” (“free” coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào. Có hai phương pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thử nghiệm trên lam kính và trong ống nghiệm. Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase “cố định” bằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát hiện những coagulase “tự do” bằng phản ứng dán tiếp với fibrinogen qua cộng hợp với những yếu tố khác trong huyết tương (Sandel M.K, 2002) [39]. Ngoài ra, chúng còn phản ứng với DNAse, phosphatase dương tính, có khả năng lên men và sinh axit từ manitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% muối NaCl (Sandel M.K, 2002) [39]. Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus có mầu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng giộng 25mm ( do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase), (Sasaki T, 2002) [39]. Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol), (Sandel M.K, 2002) [39]. 9 Đa số các dòng S. aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ 35-370C (Trần Linh Thước, 2002) [11]. 2.5. Cơ chế gây bệnh: Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ các bề mặt này bao gồm: - Da, niêm mạc: Khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu. - Các tổ chức sâu hơn: Tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô. S. aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide. Tác nhân gây bệnh như S. aureus mới có khả năng khởi động các quá trình sinh hóa đặc hiệu như: tăng sinh, bài tiết đôc tố, xâm nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu tế bào vật chủ. S. aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzyme như: hyaluronidase, hemolysin, leukocidin… phá hủy các thành phần tế bào vật chủ. Ước tính khoảng 0,1µg S. aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở người (Nguyễn Hữu An, 2013) [1]. 2.6. Tình hình nghiên cứu tính kháng thuốc ở Staphylococcus aureus 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Tụ cầu kháng Methicilline (MRSA). Được phân lập tại Châu Âu đầu tiên năm 1960, phát tán nhanh ở Mỹ và trở thành dịch ở nhiều bệnh viện tại Mỹ ở thập niên 1980 (MRSA gặp với tỷ lệ 10-40%). Ở Canada gặp đầu tiên: 1979, trở thành dịch năm 1981. Từ năm 1995 đến năm 2004 tỷ lệ tăng từ 0,46/1000 ca lên 5,9/1000 ca. Nghiên cứu năm 2006 ở 48 BV tại Canada cho 10 thấy : 11.700 /29.000 bệnh nhân nhập viện có mang MRSA gây bệnh nhiễm trùng (Baba T, 2002) [16]. Một báo cáo mới nhất của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công bố ngày 30/4/2014 cho thấy hầu như tất cả các khu vực đều cho kết quả kháng cao với methicillin trong điều trị S. aureus (MRSA); trong đó, Đông Nam Á hơn 25%, Đông Địa Trung Hải hơn 50%, châu Âu 60%, châu Phi 80%, Tây Thái Bình Dương 80%, châu Mỹ 90% (Tổ chức Y tế thế giới, 2014) [12]. Những phân tích gần đây cho thấy tại Hoa Kỳ hàng năm có khoảng 48000 người tử vong vì MRSA (Methicillin resistant S. aureus). Ước tính có khoảng 19000 người Mỹ tử vong vì MRSA trong năm 2005. 2.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, hầu hết các cơ sở khám, chữa bệnh đang phải đối mặt với tốc độ lan rộng của các vi khuẩn kháng với nhiều loại kháng sinh. Mức độ và tốc độ kháng thuốc ngày càng gia tăng, đang ở mức báo động. Gánh nặng do kháng thuốc ngày càng tăng do chi phí điều trị tăng lên, thời gian điều trị kéo dài, ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh, cộng đồng và sự phát triển chung của xã hội. Trong tương lai, các quốc gia có thể sẽ phải đối mặt với khả năng không có thuốc để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm nếu không có các biện pháp can thiệp phù hợp. Hiện nay, kháng thuốc không phải là vấn đề mới, nhưng đã trở nên nguy hiểm, cấp bách, đòi hỏi phải có sự nỗ lực tổng hợp nhằm giúp nhân loại tránh khỏi nguy cơ quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) nhận định, chúng ta đang sống trong kỷ nguyên phụ thuộc kháng sinh và yêu cầu toàn cầu có trách nhiệm bảo vệ nguồn thuốc kháng sinh quý giá cho thế hệ sau (Trường Đại Học Y Khoa-nhà xuất bản Y học, 1974) [13]. Một khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S. aureus phân lập từ bệnh phẩm cho 11 thấy có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006) [8]. Từ tháng 8/2012 - đến tháng 8/2013, một nghiên cứu với 143 chủng S. aureus về tỉ lệ đề kháng KS của S. aureus trong 4.299 bệnh phẩm, được phân lập tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả cho thấy: S. aureus chiếm 23,6% , đa số được phân lập từ bệnh phẩm mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nước tiểu (11,9%) và phân (10,5%). Qua kết quả từ kháng sinh đồ (KSĐ), tỉ lệ đề kháng của S. aureus với các KS là 93,7% với Penicilline G, 65,0% với Erythromycine, 60,8% với Kanamycine, 58% với Clindamycine. Cho tỉ lệ MRSA là 39,2% (Nguyễn Hữu An, 2013) [1]. Trong một nghiêm cứu khác cũng cho thấy tỉ lệ kháng kháng sinh của S. aureus khác nhau giữa các bệnh viện và giữa các kháng sinh xét nghiệm. Có tới 68,8% các chủng phân lập tại bệnh viện Chợ Rẫy kháng với Gentamicin. Tỉ lệ kháng Oxacillin cao nhất tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế với 63,8% . Theo báo cáo của Bệnh viện Chợ Rẫy năm 2008, có 8% số chủng S. aureus phân lập được đề kháng với Vancomycin. Tuy nhiên, đến năm 2009, phần lớn các bệnh viện kể cả Chợ Rẫy không có chủng S. aureus nào đề kháng với Vancomycin trừ một số bệnh viện tỉnh và bệnh viện trực thuộc Sở y tế cho kết quả đáng nghi ngờ về tỉ lệ kháng Vancomycin của tụ cầu vàng ví dụ như 60,9% S. aureus kháng Vancomycin tại bệnh viện Uông Bí, 24,1% tại bệnh viện Bình Định và 15,6% tại bệnh viện Xanh Pôn. (Nguyễn Văn Duy, 2011) [3]. Theo một nghiên cứu khác cho thấy tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam đã ở mức độ cao. Trong số các nước thuộc mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP), Việt Nam có mức độ kháng Penicillin cao nhất (71,4%) và kháng Erythromycin (92,1%) (Wei H. L,
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan

Tài liệu vừa đăng