Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân giống cây sâm cau (curculigo orchioides gaertn) bằng phương pháp in vitro.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG THỊ PHƢỢNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2011 – 2015 Thái Nguyên - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG THỊ PHƢỢNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chuyên ngành: Khoa: Khóa học: Giảng viên hƣớng dẫn: Chính quy Công nghệ Sinh học CNSH - CNTP 2011 – 2015 1.PGS.TS. Ngô Xuân Bình Bộ Khoa học và Công nghệ 2. ThS. Nguyễn Thị Tình Khoa CNSH - CNTP - Trƣờng ĐH Nông lâm Thái Nguyên Thái Nguyên - 2015 i LỜI CẢM ƠN Sau 6 tháng thực tập tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đến nay em đã hoàn thành xong đề tài của mình. Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô giáo trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc thầy giáo PGS.TS. Ngô Xuân Bình và ThS. Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với những đóng góp và hướng dẫn quý báu của Ks. Lã Văn Hiền trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn tới bạn bè và người thân đã động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 03 tháng 06 năm 2015 Sinh viên thực hiện Hoàng Thị Phượng i ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 3.1: Bảng tên hóa chất dùng trong thí nghiệm.................................................22 Bảng 3.2: Bảng tên thiết bị dùng trong thí nghiệm ...................................................22 Bảng 4.1: Kết quả ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy).....................................................................................29 Bảng 4.2: Kết quả ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) .............................................................................31 Bảng 4.3: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) ..............................................................33 Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp Kinetin đến khả năng nhân nhanh cây Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) ....................................35 Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) .....................................37 Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ của cây Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) ......................................................................39 Bảng 4.7: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ của cây Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) ......................................................................40 ii iii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Hình 2.1. Cây Sâm cau ................................................................................................ 5 Hình 2.2. Lá Sâm cau .................................................................................................. 5 Hình 2.3. Hoa Sâm cau ............................................................................................... 5 Hình 2.4. Quả và hạt Sâm cau ..................................................................................... 5 Hình 2.5: Một số hợp chất có trong dược liệu Sâm cau [37] ......................................8 Hình 4.1: Ảnh chồi cây Sâm cau trên môi trường nền bổ sung BA ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) ...........................................................30 Hình 4.2: Ảnh chồi cây Sâm cau trên môi trường nền bổ sung Kinetin ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) .................................................32 Hình 4.3: Ảnh chồi cây Sâm cau trên môi trường nền bổ sung BA ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) ...........................................................34 Hình 4.4: Ảnh chồi Sâm cau trên môi trường nền bổ sung BA 1,0 mg/l kết hợp Kinetin ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) ...................36 Hình 4.5: Ảnh chồi Sâm cau trên môi trường nền bổ sung BA 1,0 mg/l kết hợp NAA ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) ......................38 Hình 4.6: Ảnh rễ cây Sâm cau trên môi trường nền bổ sung IBA ở các hàm lượng khác nhau(sau 30 ngày nuôi cấy) ............................................................40 Hình 4.7: Ảnh rễ cây Sâm cau trên môi trường nền bổ sung NAA ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) ...........................................................41 iii iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT B1 : Thiamin HCl B2 : Nicotinic acid B5 : Gamborg‟s B6 : Pyridocine BA : 6- Benzyladenine Cs : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation (Hệ số biến động) DNA : Deoxyribonucleic Acid Đ/C : Đối chứng GA3 : Gibberellic Acid IBA : β – Indol Butyric Acid LSD : Least Singnificant Diference Test (Sai khác trung bình có ý nghĩa giữa các công thức ở mức độ tin cậy 95%) KIN : Kinetin MS : Murashige & Skoog (1962) NAA : α -Napthalene Acetic Acid TN Thí nghiệm : iv v MỤC LỤC PHẦN 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................2 1.3. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................2 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................2 1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ..............................................................................2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4 2.1. Giới thiệu chung về cây Sâm cau .........................................................................4 2.1.1. Nguồn gốc .........................................................................................................4 2.1.2. Phân loại ............................................................................................................4 2.1.3. Đặc điểm hình thái học của Sâm cau ................................................................5 2.1.4. Giá trị dược liệu của Sâm cau ...........................................................................6 2.1.5. Phương pháp truyền thống nhân giống Sâm cau ............................................10 2.2. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật .........................10 2.2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................................................10 2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................11 2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào ...................................12 2.3.1. Vật liệu nuôi cấy .............................................................................................12 2.3.2. Điều kiện nuôi cấy ..........................................................................................12 2.3.3. Môi trường dinh dưỡng ...................................................................................13 2.4. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .....................................16 2.5. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sâm cau bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam ..........................................................................................17 2.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................17 2.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ..................................................................19 v vi PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....22 3.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu ........................................................22 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu........................................................................22 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................22 3.1.3 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm.......................................................................22 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ......................................................23 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................23 3.2.2. Thời gian nghiên cứu ......................................................................................23 3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................23 3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số Cytokinin đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau ...............................................................................................23 3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau .................................................23 3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số Auxin đến khả năng ra rễ cây Sâm cau..............................................................................................23 3.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................24 3.4.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số Cytokinin đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau...................................................24 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau .................25 3.4.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Auxin đến khả năng ra rễ cây Sâm cau .....................................................................27 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi đánh giá ............................................................................28 PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .....................................29 4.1. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng Cytokinin đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau .....................................................................................................................29 4.1.1. Kết quả ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau .............29 4.1.2. Kết quả ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau ......31 vi vii 4.2. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau ...................................................................................33 4.2.1. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau .....................................................................................................................33 4.2.2. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau ............................................................................................35 4.2.3. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau ............................................................................................37 4.3. Kết quả ảnh hưởng của hàm loại Auxin đến khả năng ra rễ cây Sâm cau .........39 4.3.1. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ cây Sâm cau.............. 39 4.3.2. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ cây Sâm cau............ 39 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................42 5.1. Kết luận ..............................................................................................................42 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHAO vii 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Sâm cau có nhiều tên như Ngải cau, Cô nốc lan, Tiên mao, với tên khoa học Curculigo orchioides Gaertn thuộc họ thuộc họ thủy tiên (Amaryllidaceae) [17]. Sâm cau là loại cây thân thảo mọc hoang ở những vùng núi rừng tại Việt Nam, Lào, Malysia, Thái Lan, Philippine, Ấn Độ, Trung Quốc [22], [30], [31]. Ở Việt Nam Sâm cau phân bố rải rác ở các tỉnh vùng núi, từ Lai Châu, Tuyên Quang, Cao Bằng đến Tây Nguyên [4]. Theo y học cổ truyền Ấn Độ, Sâm cau có tính chất nhầy dịu, tác dụng lợi tiểu, bổ kích dục, sử dụng chữa trĩ, vàng da, hen suyễn, tiêu chảy. Theo y học cổ truyền Trung Quốc gọi tên Sâm cau với tên gọi “Xianmao” được sử dụng như thuốc bổ để điều trị suy giảm thể lực, chữa bệnh hen suyễn, còi, vàng da, tiêu chảy, đau bụng và bệnh lậu, kháng viêm, chống ung thư và tăng cường chức năng sinh lý cho nam giới [21], [22], [30], [44]. Như vậy có thể nhận thấy rằng, tác dụng chính của S â m c a u là tăng cường sức khỏe và tinh thần, giảm mệt mỏi, tăng sức lực và độ dẻo dai, tăng cường chức năng sinh lý nam giới, củng cố hệ thống miễn dịch,… Trên thị trường nước ngoài đang cho phép bán các chế phẩm có nguồn gốc Sâm cau, chẳng hạn như chế phẩm “KAMA SUTRA CAPSULE” của hãng Alma Health Care, “STRONG-NITE CAPSULE” của hãng Medimix, „POTENCY PLUS” và “BRAINCARE” của Trung Quốc, “AIPANI KAMON” của hãng Vaipani và "SHARMIOTONE SYRUP” của hãng Sharmila [22]. Do giá trị dược liệu lớn vì vậy Sâm cau đã bị khai thác tới mức cạn kiệt trong tự nhiên. Do đó việc tìm ra kỹ thuật nhân giống cho đối tượng này trong tự nhiên là rất quan trọng. Theo tài liệu kỹ thuật nhân giống một số loài cây thuốc quan trọng đang được thương mại, công bố ở Ấn Độ đã mô tả, Sâm cau có thể sử dụng nhân giống vô tính bằng phương pháp cắt mầm giâm hom. Tuy nhiên, với sự tìm hiểu của chúng tôi chưa có quy trình nào công bố về quy trình nhân giống vô tính Sâm cau bằng 1 2 phương pháp cắt mầm giâm hom cũng như bằng hạt. Do đó thực tế đang đòi hỏi phải xây dựng được quy trình nhân giống nhanh, đơn giản, dễ thực hiện, hệ số nhân cao, đem lại hiệu quả kinh tế rõ rệt, để khắc phục hạn chế nhân giống loài cây này trong tự nhiên [23]. Trên thế giới, cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nhân giống cây Sâm cau bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các nghiên cứu đã khẳng định Sâm cau có thể nhân giống bằng phương pháp in vitro. Quy trình nhân giống đơn giản, hệ số nhân giống cao. Và theo các nghiên cứu này cho thấy không có sự thay đổi về hình thái nuôi cấy so với cây mẹ [30], [34], [41]. Ở Việt Nam, tài liệu nhân giống Sâm cau còn ít và hạn chế chính vì vậy việc tìm ra quy trình nhân nhanh loài cây quý hiếm này bằng phương pháp in vitro là cần thiết. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng nhân giống cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn) bằng phƣơng pháp in vitro”. 1.2. Mục đích nghiên cứu Xác định được ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân giống cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn) bằng phương pháp in vitro. 1.3. Yêu cầu của đề tài - Xác định loại Cytokinin thích đến khả năng tái sinh chồi cây Sâm cau. - Xác định được hàm lượng chất kích thích hợp đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau. - Xác định được hàm lượng loại Auxin thích hợp đến khả năng ra rễ cây Sâm cau. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp cho sinh viên củng cố và hệ thống lại kiến thức đã học vào thực tiễn. Đồng thời tiếp cận công tác nghiên cứu khoa học phục vụ cho việc nghiên cứu và công tác sau này. 2 3 - Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một báo cáo tốt nghiệp. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp xây dựng phương pháp nhân nhanh giống cây Sâm cau bằng phương pháp nuôi cấy mô, hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống Sâm cau bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tạo ra số lượng giống Sâm cau với số lượng lớn, chất lượng tốt, đồng đều phục vụ cho quy trình sản xuất. 3 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây Sâm cau 2.1.1. Nguồn gốc Sâu cau đã được ghi nhận trong thực vật chỉ của một số nước từ rất lâu và ở bậc phân loại loài. Theo một số tài liệu, Sâm cau phân bố Ấn Độ, Sri Lanka, Trung Quốc, Nhật Bản, Úc, các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Lào, Thái Lan, Malaysia, v.v [22], [30], [31]. Ở Ấn Độ, Sâm cau được gọi với tên “Golden eye grass” hoặc “Black Musli” Sâm cau là loài thân thảo, thân củ, kích thước nhỏ. Sâm cau có nguồn gốc ở vùng rừng chịu bóng ở Châu Á. Cây sinh trưởng, phát triển tốt ở vùng đồng bằng nơi đất màu mỡ, ẩm, từ độ cao tới 2300 m so với mặt nước biển và đặc biệt trên khe đá, đất đá ong ẩm [40], [41], [61]. 2.1.2. Phân loại Theo bảng phân loại của Chauhan và cs (2010) [29], cây Sâm cau được phân loại như sau: Bảng 2.1: Phân loại cây Sâm sau của Chauhan và cs (2010) Giới (Kingdom) Plantae Ngành (Division) Spermatophyta Lớp (Class) Monocotyledon Bộ (Order) Liliidae Họ (Family) Amaryllidaca Chi (Genus) Curculigo Loài (Species) Orchiodes 4 5 2.1.3. Đặc điểm hình thái học của Sâm cau - Đặc điểm của thân rễ Sâm cau là cây thân thảo sống lâu năm chiều cao khoảng 20 - 30 cm, có khi hơn. Thân rễ mập, hình trụ dài, mọc thẳng, thóp lại ở hai đầu chiều dài 2,5 - 5 cm, đường kính 1,0 - 4,5 cm, bề mặt bên ngoài màu nâu đen mang nhiều rễ phụ có dạng giống thân rễ, bên trong có màu kem; vị nhầy và hơi đắng [4], [52]. Hình 2.1. Cây Sâm cau - Đặc điểm của lá Lá mọc thành túm từ thân rễ xếp nếp và có gân như lá cau, dài 15 - 45 cm, rộng 2,5 - 3 cm, gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn gần như cùng nhau, gân song song, bẹ lá to và dài; cuống lá dài khoảng 10 cm [4], [52]. Hình 2.2. Lá Sâm cau [52] - Đặc điểm của hoa Cụm hoa mọc trên một cán ngắn ở kẽ lá, mang 3 - 5 hoa nhỏ, màu vàng; lá bắc hình trái xoan; đài 3 răng có lông, tràng 3 cánh nhẵn, nhị 6 xếp thành hai dãy, chỉ nhị ngắn, bầu hình thoi, có lông rậm [4], [52]. Hình 2.3. Đặc điểm của hoa - Đặc điểm của quả và hạt Quả nang, thuôn, dài 1,5 - 2 cm, rộng 8 mm, 1 - 4 hạt, phình ở đầu, kích thước 1 - 2 mm, màu đen. Mùa hoa quả: từ tháng 5 - 7 [4], [52]. Hình 2.4. Quả và hạt Sâm cau 5 6 2.1.4. Giá trị dược liệu của Sâm cau 2.1.4.1. Giá trị làm thuốc của Sâm cau Theo y học cổ truyền Ấn Độ, Sâm cau có tính chất nhầy dịu, tác dụng lợi tiểu, kích dục, sử dụng trong điều trị bệnh trĩ, vàng da, hen suyễn, tiêu chảy. Sâm cau được sử dụng bằng cách giã đắp ngoài để chữa ngứa và bệnh ngoài da. Bên cạnh đó Sâm cau còn được sử dụng làm thuốc tăng cường chức năng sinh lý cho nam giới. Trong y học cổ truyền Trung Quốc Sâm cau có tên “Xianmao” được sử dụng như thuốc bổ để điều trị suy giảm thể lực, chữa bệnh hen suyễn, còi, vàng da, tiêu chảy, đau bụng và bệnh lậu, kháng viêm, chống ung thư. Nó cũng được sử dụng để làm giảm đau, lợi tiểu, thuốc bổ và tăng cường chức năng sinh lý cho nam giới [21], [22], [30], [44], [55] Tên dược liệu Sâm cau là Rhizoma Curculiginis. Theo kinh nghiệm dân gian, thân rễ (hay củ) của cây Sâm cau có vị cay, tính ấm, hơi có độc, bổ thận tráng dương, trừ tê, tráng gân cốt, chủ trị tinh lạnh, liệt dương, đái đục ở nữ, bạch đới, người già đái són, lạnh da, thần kinh suy nhược, phong thấp, lưng gối lạnh đau, vận động khó khăn. Sâm cau được phối hợp với các dược liệu khác sử dụng như thuốc điều trị tiêu biểu như trị sốt xuất huyết, chữa tê thấp, đau mình mẩy, chữa cao huyết áp (tiền mãn kinh), bồi bổ, tráng dương, trị nam tinh lạnh, liệt dương, nữ lạnh tử cung, chữa phong thấp, lưng lạnh đau, thần kinh suy nhược, bồi bổ cho người già, phụ nữ sau sinh, chữa liệt dương do rối loạn thần kinh chức năng, chữa tiêu chảy. Sâm cau được thu hoạch quanh năm, nhưng tốt nhất vào mùa thu, bộ phận thu hoạch làm thuốc là thân, rễ mang về cạo sạch vỏ ngoài hoặc để nguyên ngâm nước gạo để khử độc, rồi phơi hay sấy khô cất sử dụng dần [4]. Trên thị trường nước ta đang cho phép bán các chế phẩm có nguồn gốc Sâm cau, chẳng hạn như chế phẩm “OCHUKIM” sử dụng hỗ trợ điều trị suy giảm chức năng sinh lý cho nam giới, vô sinh, hiếm muộn do tinh lạnh, tinh loãng, ngăn ngừa và chống lại những bất thường về tinh trùng, giúp bồi bổ sức khỏe, bổ thận tráng dương, tăng cường sinh lực, giảm căng thẳng mệt mỏi, tăng khả năng làm việc trí óc và chân tay của tập đoàn Tuệ Linh. 6 7 2.1.4.2. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý Thành phần hóa học của Sâm cau Các nghiên cứu đã xác định được thành phần hóa học của Sâm cau gồm các chất chính là glycosids, là những chất có hoạt tính dược học chủ yếu của dược liệu Sâm cau. Các chất có hoạt tính trong củ Sâm cau được xác định gồm flavones, glycosite, steroids, saponins, triterpenoids và các hợp chất khác trong cây đã được báo cáo bởi các tác giả (Ajit 2012, Mistra et al. 1990, Nagesh 2008, Neema et al. 2010, Xu et al. 1992) [22], [40], [41], [61]. Cho đến nay đã có một số chỉ thị khác nhau như các chất glycosides được sử dụng làm chất chuẩn góp phần nhận dạng dược liệu Sâm cau [30] Theo Wealth of India (1950) củ Sâm cau chứa đường tự do (7.56%), mucilage (8.12%), hemicelluloses (12-15%), polysachharides (17.01%) [54]. Thành phần hóa học của thân củ Sâm cau đã được công bố bởi nhiều tác giả, bao gồm các nhóm sau: Nhóm Steroids và triterpenoids: Gồm steroids, sitosterol, stigmasterol [33] và yuccagenin [58]. Trong số 6 triterpenes được chiết tách có 1 triterpene là axit 31methyl-3-oxo-20-ursen-28-oic [39] và số còn lại là cycloartene như cycloartenol [33], curculigol, curculigenin [60], [61], Curculigenin B và curculigenin C [59]. Nhóm Glycosides và saponins: 13 saponins đã được tách chiết và đặc trưng từ thân củ và đặt tên là các chất phenol A - M curculigosaponins [61], [62]. Tiếp đó, 5 chất phenol đã được tách chiết là curculigoside (5-hydroxy-2-O-β-Dglucopyranosyl benzyl-2,6-dimethoxy benzoate [36], curculigine A và orcinol glucoside [59], corchioside A [33]và flavanone glycoside - I(glycoside–5,7dimethoxy-dihydromyricetin-3-O-α-L-xylopyranosyl (4-1)-β-D-glycopyranoside. Nema và cs (2010) đã chiết tách và nhận biết thêm một chất glycoside mới đặt tên là 2-βD-glucopyranosyloxy-5-hydroxybenzyl-2‟,6‟-dimethoxy-3‟-ydroxybenzoate. Công thức phân tử được xác định là C22H26O12 [44]. Nhóm hợp chất chứa Nitơ (Nitrogenous constituents): gồm N-acetyl-Nhydroxy-2-carbamic acid methyl ester, 3-acetyl-5-carbomethoxy-2H-3, 4, 5, 6- 7 8 tetrahydro-1, 2, 3, 5, 6-oxotetrazine, N, N, N‟, N‟-tetra methyl succimmide và Lycorine [58]. Ngoài ra, một số chất được xác định có mặt trong cây như glucose, mannose, xylose, glucoronic acid, resin, tannin, fat, tinh bột. Hàm lượng tổng số của các chất này trong củ Sâm cau khoảng 8-9% [30]. Một số phương pháp đã được sử dụng để xác định chất lượng Sâm cau như xác định hoạt chất curculigosidate bằng đo nồng độ 2,6-dimethoxybenzoic axit trong máy sắc khí lỏng cao áp (HPLC), hoặc sắc khí cột, đo mật độ quang ở bước sóng UV 283 nm. Lu và cs (2002) đã xây dựng phương pháp xác định hàm lượng curculigoside ở Sâm cau (Curculigo orchioides). Hàm lượng curculigoside dao động trong 6 mẫu phân tích khác nhau thu thập tại tỉnh Quảng Đông từ 0,11% to 0,35% [37]. Một số hợp chất chính có trong dược liệu Sâm cau được thể hiện trong hình 2.5. Hình 2.5: Một số hợp chất có trong dƣợc liệu Sâm cau [37] 8 9 Tác dụng dược lý của Sâm cau Hoạt tính bảo vệ gan: Rao và cs (1996) đã cho thấy hoạt tính bảo vệ gan thỏ chống lại độc tố rifampicin, thioacetamide, galactosomine, carbon tetrachlorite của hoạt chất curculignin A và curculigol chiết tách từ Sâm cau [48]. Dịch chiết methanol rễ Sâm cau cũng được phát hiện có tác dụng bảo vệ gan chuột [26]. Hoạt tính chống oxy hóa: Dịch chiết methanol rễ Sâm cau được phát hiện có tác dụng chống oxy hóa ở chuột [57]. Hoạt tính điều hòa miễn dịch: Bafna và cs (2006) đã thử nghiệm dịch chiết methamol Sâm cau trên chuột và nhận thấy tăng đáng kể kháng thể trong cơ thể khi cơ thể nhiễm cyclophosphamide, phản ứng nhạy cảm ở dạng trị hoãn và các mức độ tế bào máu trắng và phụ thuộc vào liều lượng [25]. Hoạt tính tăng cƣờng chức năng sinh lý: Nghiên cứu đã chứng tỏ dịch chiết từ cồn có tác dụng kích thích sinh dục đáng kể thỏ đực qua các thông số theo dõi đã được ghi nhận. Ngoài ra, tác dụng tích lũy số lượng tinh trùng in vitro tăng lên đáng kể so với đối chứng sau 30 phút phản ứng [53]. Dịch chiết đông khô của cây cũng cải thiện đáng kể hoạt động tình dục ở liều lượng 200 mg/kg trọng lượng cơ thể [54]. Chauhan và Dixit (2008) đã khẳng định dịch chiết cồn ở liều lượng 100 mg/kg trọng lượng chuột trắng có tác dụng tăng cường sinh tinh trùng và tăng cường chức năng sinh lý ở chuột đực [29]. Hoạt tính kháng tiểu đƣờng: Cả dạng dịch chiết nước và cồn đều có hoạt tính chống tăng đường huyết đáng kể ở thỏ bị tiểu đường so với đối chứng [28]. Hoạt tính chống loãng xƣơng: Dịch chiết Sâm cau có hoạt tính chống loãng xương ở thỏ đồng thời không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể, tăng phospho, canxi và osteoprotegerin trong huyết thanh, giảm liên kết deoxypyridinoline với creatinine, giảm hormone adrenocorticotropic và mức độ corticosterone nhưng không làm thay đổi factor-alpha, interleukin-6, alkaline phosphate ở chuột [27]. Hoạt tính chống hen: Dịch chiết Sâm cau bằng cồn đã có tác dụng chống hen do ảnh hưởng của histamine ở dê và lợn với nồng độ 100g/ml và 25g/ml tương ứng. Tế bào leucosyte và lymphocyte tăng lên cao nhất (99%) và giảm esinophils tới 0% ở liều lượng 375 mg/kg trọng lượng cơ thể [45]. 9 10 Hoạt tính kháng vi khuẩn: Tinh dầu Sâm cau có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể chống lại các chủng vi khuẩn như Bacillus anthracis, B. suhtilis, Salmonella pullorum, v.v. và nấm như Fusarium monili forme, F. solani, v.v. [35]. Singh & Gupta (2008) đã chứng minh tác dụng kháng vi sinh vật do tác dụng của chất saponin trong dịch chiết [50]. Hoạt tính chống ung thƣ: Dịch chiết Sâm cau đã được phát hiện có tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi dòng tế bào MCF-7 [50]. 2.1.5. Phương pháp truyền thống nhân giống Sâm cau Cây Sâm cau được nhân giống bằng hạt và sinh trưởng chỉ diễn ra vào mùa mưa, tỷ lệ cây tạo hạt và khả năng nảy mầm rất thấp nên đã làm giảm số lượng cá thể loài trong tự nhiên. Đồng thời khai thác quá mức trong thời gian qua đã dẫn đến tình trạng nguy cấp hiện nay của loài cây này ở nhiều nước như Ấn Độ, Trung Quốc v.v. [24], [41]. Sâm cau được nhân giống trong tự nhiên bằng hạt hoặc bằng tách mầm. Thời vụ thích hợp nhất trồng là mùa xuân, các mùa khác trồng cây cần chăm sóc nhiều hơn. Sâm cau là loài cây sống rất khỏe, lá xanh tốt quanh năm vì thế có thể trồng trong chậu làm cây cảnh. Nếu trồng trong đất, có thể trồng với khoảng cách 30 x 40 cm hoặc 30 x 50 cm [4]. 2.2. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô là thuật ngữ dùng để chỉ các quá trình nuôi cấy vô in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý…[8]. Nguyên tắc cơ bản của nhân giống vô tính là: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều do nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào tạo thành. Các tế bào đã phân hóa đều mang thông tin có trong tế bào đầu tiên và là những tế bào độc lập, từ đó xây dựng lại toàn bộ cơ thể [8]. 10 11 2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật Năm 1902, lần đầu tiên nhà thực vật học người Đức Haberlandt đã đưa ra quan niệm: “Mỗi tế bào bất kì (đã biệt hóa) của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh”. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì: “Tất cả mọi tế bào của một cơ thể đều chứa bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có tiềm năng tổng hợp những kiểu protein - enzym giống hệt nhau và nếu được nuôi trong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng cho loài cụ thể và ra hoa, kết trái bình thường. Khả năng đó của tế bào được gọi là tính toàn năng của tế bào thực vật” [12]. Tính toàn năng của tế bào thực vật mà Haberlandt đã đưa ra chính là cơ sở lí luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [12]. 2.2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Theo PGS.TS Nguyễn Quang Thạch (2005) [11]: Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan khác nhau của cơ thể. Tế bào phôi sinh -> Tế bào dãn -> Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên hóa, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá 11