Tài liệu NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  ----------------------- ------------------------ ĐẶNG NGỌC HÙNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH THÁI NGUYÊN – NĂM 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  ----------------------- ------------------------ ĐẶNG NGỌC HÙNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC MÃ SỐ: 60.62.60 LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. LÊ ĐÌNH KHẢ THS. ĐOÀN THỊ MAI THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Lời nói đầu Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục hình ảnh Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 3 1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp ........................................... 3 1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô và nhân giống cây Lâm nghiệp ......................... 3 1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ................................ 4 1.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật ............................................................ 4 1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào................................................. 4 1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào ........ 6 1.4.1. Môi trường nuôi cấy ................................................................................... 6 1.4.2. Các chất điều hoà sinh trưởng.................................................................... 8 1.4.3. Môi trường vật lý ........................................................................................ 10 1.4.4. Vật liệu nuôi cấy ......................................................................................... 11 1.4.5. Điều kiện vô trùng ...................................................................................... 11 1.4.6. Buồng nuôi cấy ........................................................................................... 12 1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống ........................................ 12 1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị ..................................................................................... 12 1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động ............................................................................. 13 1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh................................................................................ 13 1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ) ........................................................................ 14 1.5.5. Đưa cây ra môi trường tự nhiên ................................................................. 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.6. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) và Bạch đàn liễu (E. exserta) ........... 16 1.6.1. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)......................................................... 16 1.6.2. Bạch đàn liễu (Eucalyptus exserta) ............................................................ 17 1.6.3. Bạch đàn lai ................................................................................................ 17 1.6.4. Nhân giống Bạch đàn bằng nuôi cấy mô ................................................... 20 1.7. Một số kết quả nổi bật về nuôi cấy mô cây thân gỗ và Bạch đàn ............... 21 1.7.1. Trên thế giới................................................................................................ 21 1.7.2. Nhân giống cây gỗ bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam ............... 25 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................................................... 28 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 28 2.2. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................... 28 2.2.1. Một số đặc điểm chính của dòng UE35 và dòng UE56 .............................. 28 2.2.2. Cây mẹ lấy vật liệu ...................................................................................... 28 2.2.3. Vật liệu nuôi cấy (mẫu cấy) ........................................................................ 29 2.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 29 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 30 2.4.1. Chọn loại môi trường phù hợp ................................................................... 31 2.4.2. Ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu..................... 31 2.4.3. Ảnh hưởng của vitamin B2 đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu .... 32 2.4.4. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến hệ số nhân chồi (HSNC) và chất lượng chồi (TLCHH) ............................................................................... 32 2.4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH................................. 32 2.4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP+IAA đến HSNC và TLCHH ........................ 33 2.4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH ..................... 34 2.4.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH ................. 34 2.4.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin + NAA đến HSNC và TLCHH ..... 35 2.4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ ............................................................................................. 35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.4.4.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA+ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ .............................................................................. 36 2.4.4.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm ........................................................................................................... 36 2.4.4.9. Điều kiện thí nghiệm ................................................................................. 37 2.4.5. Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 38 2.4.6. Thu thập và xử lý số liệu............................................................................. 38 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 41 3.1. Khử trùng mẫu cấy ....................................................................................... 41 3.2. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu ...................... 43 3.3. Nghiên cứu loại môi trƣờng thích hợp cho nhân nhanh chồi ..................... 44 3.4. Ảnh hƣởng của việc bổ sung vitamine B2 vào môi trƣờng MS * đến HSNC và TLCHH ........................................................................................................... 46 3.5. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng trong môi trƣờng MS * đến HSNC và TLCHH ............................................................................................... 50 3.5.1. Ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH ............................................. 50 3.5.2. Ảnh hưởng phối hợp của BAP + IAA đến HSNC và TLCHH ................... 52 3.5.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA trong môi trường MS * đến HSNC và TLCHH .......................................................................................... 55 3.5.4. Ảnh hưởng của sự phối hợp BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH ......... 58 3.5.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC và TLCHH ................................................................................................................. 60 3.5.6. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ IBA trong môi trường 1/2 MS* tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài của rễ ............................................. 63 3.5.7. Ảnh hưởng của tổ hợp IAA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài của rễ ................................................................................. 66 3.5.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con ở vườn ươm.................................................................................................... 68 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 4: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ ........................................ 72 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 72 4.2. Tồn tại ........................................................................................................... 72 4.3. Kiến nghị ....................................................................................................... 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 75 Tài liệu tiếng việt ................................................................................................ 75 Tài liệu tiếng Anh ................................................................................................ 77 Phụ Lục Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI NÓI ĐẦU Nâng cao chất lượng đào tạo bằng nghiên cứu khoa học là mục tiêu quan trọng trong việc đào tạo cao học của Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Để hoàn thành chương trình đào tạo cao học Lâm nghiệp khoá học 2006-2009, được sự đồng ý của Khoa sau đại học - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu nhân giống các dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus urophylla và E. exsertar bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”. Sau thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ tận tình về nhiều mặt của Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên, đặc biệt là khoa sau đại học, cùng các thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy, cũng như lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Hà Nội, bộ môn công nghệ tế bào thuộc Viện khoa học sự sống - trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô giáo, đặc biệt là GS.TS. Lê Đình Khả, Th.s. Đoàn Thị Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả bạn bè đồng nghiệp và người thân đã giúp đỡ tôi có được bản luận văn này. Nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là một vấn đề khó trong nghiên cứu ứng dụng sản xuất giống cây lâm nghiệp. Việc nghiên cứu nhân giống một số dòng Bạch đàn lai nói trên trong đề tài nhằm góp phần xây dựng cơ sở hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất cây với số lượng lớn, đồng đều, có chất lượng cao do vậy không thể tránh khỏi những khiếm khuyết, rất mong được sự chỉ bảo bổ sung ý kiến của các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp để công trình nghiên cứu này được hoàn thiện. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 4 năm 2009 Tác giả Đặng Ngọc Hùng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng TT Trang 3.1a Bảng tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE35 (180 mẫu) …... 41 3.1b Bảng tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE56 (180 mẫu) ….... 42 3.2 Bảng ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi…………….... 43 3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 5 loại môi trường đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và UE56 (tổng số 180 mẫu/môi trường) 44 …….…. 3.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung vitamine B2 đến HSNC và TLCHH của UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công thức) …………………………….. 47 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của Bạch đàn lai dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/công thức) …………………….……... 51 3.6 Ảnh hưởng sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/ công thức) ……………………… 53 3.7 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH của 2 dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công thức)…………………………………………………………………… 56 3.8 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH của 2 dòng UE35 và UE56 (180 chồi cấy/công thức) ……… 59 3.9 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC và TLCHH (180 chồi cấy/công thức) …………………………. 61 3.10 Ảnh hưởng nồng độ IBA đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều dài của rễ (180 chồi cây/ công thức) ………………………………….. 64 3.11 Ảnh hưởng của IBA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều dài rễ của dòng UE35 và UE56 ………………………………… 66 3.12 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây con tại vườn ươm sau 1 tháng (90 cây mạ /công thức)……………………….. 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TT Tên biểu đồ Trang 3.1a: Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến HSNC của dòng UE35 và UE.......... 48 3.1b: Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến TLCHH của dòng UE35 và UE ....... 48 3.2a: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến HSNC của dòng UE35 và UE ................... 51 3.2b: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến TLCHH của dòng UE35 và UE................. 52 3.3a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................................. 54 3.3b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến TLCHH của dòng UE35 và UE ................................................................................................. 54 3.4a: Biểu đồ ảnh hưởng của của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 56 3.4b: Biểu đồ ảnh hưởng của của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến TLCHH của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 58 3.5a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................................. 59 3.5b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến TLCHH của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 60 3.6a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................ 62 3.6b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến TLCHH của dòng UE35 và UE ............................................................................. 62 3.7a: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tỷ lệ ra rễ của dòng UE35 và UE ......... 65 3.7b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tới số rễ trung bình của dòng UE35 và UE .................................................................................................................... 65 3.8a: Biểu đồ ảnh hưởng của tổ hợp IBA + ABT1tới tỷ lệ ra rễ của dòng UE35 và UE .......................................................................................................... 67 3.8b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA + ABT1 tới số rễ trung bình của dòng UE35 và UE ................................................................................................. 67 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TT Tên bảng Trang 3.1. Ảnh khử trùng mẫu cấy và mẫu nuôi cấy sau 20 ngày ……………... 43 3.2. Ảnh dòng UE35 cấy trong 5 loại môi trường ………………………. 46 3.3 Ảnh mẫu được cấy sang môi trường có bổ sung vitamin B2 sau 10 ngày nuôi cấy ……………………………………………………….. 47 3.4a. Ảnh chồi nuôi cấy trong môi trường MS* có bổ sung 2,0mg/l B2 … 48 3.4b. Ảnh chồi nuôi cấy trong môi trường MS* có bổ sung 2,0mg/l B2 … 49 3.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH ……………………………………………………………... 55 3.6. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA …………………………………………………………... 58 3.7. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1 mg/l N AA + 0,5 mg/l Kinetin …………………………………………… 62 3.8. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung ABT1 vào môi trường ra rễ sau 15 ngày nuôi cấy ……………………………………………………….. 68 3.9. Ảnh cây con tại vườn ươm của 2 dòng ……………………………... 71 3.10. Ảnh sơ đồ cho quy trình nuôi cấy mô 2 dòng UE35 v à UE56 …….. 74 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABT1 : Chất kích thích ra rễ của Trung Quốc BAP : 6- Benzyl amino purine B2 : Riboflavil Bộ NN&PTNT : Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Ca (0Cl)2 : Hypoclorit canxi GA3 : Gibberellin acid 3 HgCl2 : Clorua thuỷ ngân HSNC : Hệ số nhân chồi IAA : Indol acetic acid IBA : 3-Indol butyric acid Kinetine : 6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05 NAA : Nathyl acetic acid Na0Cl : Hypoclorit natri TTG1 : Thuốc kích thích ra rễ có gốc IBA của Trung tâm giống - Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam TLCHH : Tỷ lệ chồi hữu hiệu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Kỹ thuật này ra đời nhanh chóng có vị trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất giống cây trồng. Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là có thể nhân nhanh, giữ được đặc điểm di truyền ổn định, có thể sản xuất với số lượng cá thể lớn trong thời gian ngắn. Cây nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom lại thường không có rễ cọc, rễ cây không thể làm đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis). Vì thế nuôi cấy mô tế bào còn là một biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp. Mặc dù nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp (Lê Đình Khả, Đoàn Thị Mai, 2002, tr. 166-182). Bạch đàn là cây mọc nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn, có khả năng sinh trưởng trên nhiều dạng lập địa khác nhau, thích hợp cho rừng trồng sản xuất nguyên liệu như: gỗ, ván dăm, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ củi. Bạch đàn được trồng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Nhiều giống Bạch đàn được cải thiện cùng với kỹ thuật trồng rừng thâm canh cho năng suất cao. Ở Việt Nam, Bạch đàn chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng. Tuy nhiên năng suất và chất lượng rừng Bạch đàn trồng rừng ở nước ta còn thấp và rất khác nhau. Từ năm 1996 Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng - Viện khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu lai tạo và chọn được một số tổ hợp lai có nhiều triển vọng về khả năng sinh trưởng. Các tổ hợp lai trong loài và khác loài của các loài Bạch đàn urophyla (Eucalyptus urophyla) với Bạch đàn liễu (E. exserta) trong đó Eucaluptus urophyla được dùng làm mẹ, E. exserta được dùng làm bố. Những dòng cây lai được chọn là các dòng vô tính thuộc các tổ hợp lai U29E2 (dòng 35) và U29E4 (dòng 56). Hai dòng cây lai này đều có mẹ là Bạch đàn uro (U29), bố là Bạch 2 đàn liễu (E2), song lại thuộc hai cây khác nhau là E2 và E4 vì vậy có đặc điểm sinh trưởng khác nhau. Các dòng vô tính này thuộc các tổ hợp lai đã được Bộ NN&PTNT công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật thích hợp với điều kiện lập địa ở vùng đất đồi nghèo dinh dưỡng có thể cho năng suất gấp 2-4 lần so với loài bố mẹ (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2001). Việc nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô những giống lai mới được chọn tạo này có ý nghĩa rất lớn để sớm đưa vào sản xuất trên diện rộng mà vẫn giữ được các đặc tính ưu việt của chúng. Để hạn chế lây lan của dịch bệnh có thể xảy ra thì một trong những biện pháp kỹ thuật là trồng hỗn loài các dòng vô tính khác nhau. Ở Nước ta hiện nay có khoảng 12 dòng Bạch đàn đã được Bộ NN&PTNT công nhận và cho phép trồng rừng sản xuất, trong khi đó mới có U6, GU8, PN2, PN14, PN32 là những dòng đã được nhân giống bằng nuôi cấy mô đã qua khảo nghiệm, nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô để cung cấp cho rừng trồng. Hiện nay, nhu cầu cây giống Bạch đàn có năng suất cao và đã qua khảo nghiệm, cũng như của hai dòng này nhằm phục vụ trồng rừng khá lớn. Thời gian qua Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp đã thử nghiệm áp dụng quy trình nhân giống nuôi cấy mô hai dòng UE35 và UE56 và đã có kết quả bước đầu. Việc nghiên cứu nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô để hoàn thiện công nghệ và phục vụ sản xuất giống là rất cần thiết. Từ những đặc điểm, nhu cầu thực tiễn và nhu cầu khoa học nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân giống các dòng bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus urophyla và E. exserta bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô”. Đây cũng là một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu nhân giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch đàn urophyla, Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và Lát hoa bằng công nghệ tế bào” - chủ nhiệm đề tài: Đoàn Thị Mai - Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam thực hiện. 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp Giống lai là giống được tạo ra do lai tự nhiên hoặc lai nhân tạo giữa các cá thể có kiểu gen (genotype) khác nhau. Giống lai thường có năng suất cao và có tính chống chịu với các điều kiện bất lợi tốt hơn bố mẹ. Vì thế, tạo và sử dụng giống lai đang là mối quan tâm hàng đầu của các nhà chọn giống nông lâm nghiệp trên thế giới (Lê Đình Khả, 2006). 1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô và nhân giống cây Lâm nghiệp Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tissue culture). Vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây (George, 1930) đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp. Các bộ phận được dùng để nuôi cấy có thể là chồi bất định, chồi bên, chồi đỉnh, bao phấn, phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm (hypocotyl) vv. (Isikawa và cs, 1996, Preece, 1997, Tripepi, 1997, Merkle, 1997, Nguyễn Đức Thành, 2000). Song nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định (Preece, 1997, Tripepi, 1997) là những phương pháp chính được dùng trong nhân giống cây rừng mà không đề cập các nội dung khác. Nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt, thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom lại thường không có rễ cọc, rễ cây không thể đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis) như đã đề cập ở trên. Ví dụ: cây mô keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng như các loài cây bố mẹ là Keo tai tượng và Keo lá tràm) cũng có đủ các loại lá kép một lần, kép hai lần và lá giả, lại có rễ theo kiểu rễ cọc như những cây mọc từ hạt điển hình, thì cây hom cũng của giống này lại chỉ có lá giả của cây trưởng thành và không có rễ cọc (nghĩa là tính trẻ hoá bị hạn chế, còn tính bảo lưu cục bộ thì biểu hiện rõ rệt). Vì thế nuôi cấy mô còn là biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp. Mặc dầu nuôi cấy mô đòi hỏi 4 kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp. Tuy vậy, tính trẻ hoá của cây nuôi cấy mô vẫn kém hơn cây mọc từ hạt, Brand và Lineberger (1992) nghiên cứu so sánh mức độ trẻ hoá của cây mô, cây hom lấy từ cành của cây trưởng thành và cây ghép của cây Bulô (Betula sp.) đã thấy rằng sau 1 tháng cây nuôi cấy mô có các băng protein giống như cây mọc từ hạt, sau 4-8 tháng lại giống với cây trưởng thành, còn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trưởng thành sau 4-8 tháng đã có một số cây có hoa, trong lúc cây mọc từ hạt nhanh nhất cũng phải sau 8 năm mới có hoa (Grosdova, 1985). Điều đó chứng tỏ cây nuôi cấy mô tuy có mức độ trẻ hoá cao hơn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trưởng thành (chứ không phải lấy từ chồi của cây đã trẻ hoá) song không thể trẻ như cây mọc từ hạt. 1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào 1.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật. Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen (genom). Đặc tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ. 1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hoá và phản phân hoá tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mô có được cấu trúc chuyên môn hoá nhất định nhờ vào sự phân hoá. 5 Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân hoá có thể diễn như sau: Tế bào phôi sinh Tế bào dẫn Tế bào phân hoá chức năng Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân hoá, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào. Phân hoá Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyển hoá Phản phân hoá Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994). Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng 6 của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau theo quy luật được biểu thị ở sơ đồ bên. Theo sơ đồ, khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA, IBA, NAA, 2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, ngược lại nếu tỷ lệ cao thì mô nuôi cấy sẽ theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus). 1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau, quá trình này có thể chia thành các nhân tố sau: 1.4.1. Môi trường nuôi cấy Trong nuôi cấy in vitro, môi trưởng nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được xem là vấn để quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro. Cho đến nay, đã có nhiều môi trường dinh dưỡng được tìm ra (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ thuộc vào đối tượng và mục đích nuôi cấy. Vấn đề lựa chọn môi trường thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển tối ưu trong từng giai đoạn của nôi cấy mô là rất quan trọng. Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các acid amine và các chất điều hoà sinh trưởng (cũng có thể bổ sung thêm một số chất phụ gia khác như than hoạt tính, nước dừa …) tuỳ từng loài, giống, nguồn gốc mẫu, thậm chí từng cơ quan trên cùng cơ thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau. Vì vậy, vấn đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng, số lượng và các loại hoá chất phải cần độ chính xác cao và phù hợp cho từng giai đoạn, đối tượng cụ thể. Môi trường nuôi cấy bao gồm thành phần sau: 7 + Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991). Nguồn cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/l có tác dụng giúp mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài ra nó đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Người ta thường sử dụng 2 loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994). + Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển mô. Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là HN 4+ và NO3- (nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH4+. Nhưng đôi khi NO3- gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất. + Các nguyên tố đa lượng: là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg, Ca… cần thiết và thay đổi tuỳ đối tượng nuôi cấy. Nhìn chung, các nguyên tố này được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Các nguyên tố này có chức năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường được thuận lợi. Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau, chúng ta có thể lựa chọn sử dụng. Nói chung, môi trường giàu Nitơ và Kali thích hợp cho việc hình thành chồi, còn môi trường giàu Kali sẽ thúc đẩy quá trình trao đổi chất mạnh hơn. Thành phần khoáng của một môi trường cấy được xác định do sự cân bằng nồng độ của những ion khác nhau trong dung dịch (nồng độ ion thể hiện bằng mg/l). Việc lựa chọn thành phần và hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất khó đòi hỏi người làm công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh lý thực vật đối với dinh dưỡng khoáng. + Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng 8 vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993). + Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được Vitamin, nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số Vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các Vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là những Vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1-1mg/l (Trần Văn Minh, 1994). + Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men, cà rốt, chối, khoai tây... được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan. Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1941 và được sử dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in vitro. Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và DNA. Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: Myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993). + Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l. Độ thoáng khí của môi trường thạch có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy. Nồng độ thạch dao động trong khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy. 1.4.2. Các chất điều hoà sinh trưởng Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác. Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid. Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy. 9 + Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid), IAA (Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực vật Auxin thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ (Nguyễn Văn Uyển, 1993). + Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các hợp chất thường sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05), BAP (6Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất này thì Kenitin và BAP được sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành rẻ. Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà Cytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau. Ở nồng độ thấp (10 -7- 10-6M) chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở nồng độ 10 -6- 10-5M chúng kích thích sự phân hoá chồi. Trong nuôi cấy mô để kích thích sự nhân nhanh người ta thường xử dụng Cytokinin với nồng độ 106 - 10-4 (Lê Văn Chi, 1992). + Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan trọng nhất là GA3 (Gibberellin acid 3). GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó GA3 còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) cũng như tạo chồi phụ (Street, 1973). Ngoài ra, có còn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây. + Abscisic acid (ABA): là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên nhưng vẫn được dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro. ABA có ảnh hưởng âm tính đến mô nuôi cấy, khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng BAP riêng rẽ (lê Văn Chi, 1992). + Ethylen: có biểu hiện tác động hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở giai đoạn sớm nhưng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn. Trong một số trường hợp, Ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng một số trường hợp nó lại kìm hãm quá trình này (Nguyễn Văn Uyên, 1993).