Tài liệu ứng dụng chỉ thị phân tử mas trong chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ------------o0o ----------- LUẬN VĂN THẠC SỸ Đề tài Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 Hƣớng dẫn Học viên: : TS. Lƣu Thị Ngọc Huyền Phạm Thị Minh Hiền Hà Nội – 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 1 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Lúa (Oryza sativa L.) là một cây lương thực quan trọng ở Việt Nam, đồng thời cũng là nguồn thức ăn quan trọng nhất cho một nửa dân số thế giới. Việt Nam là nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 trên thế giới sau Thái Lan. Lúa gạo là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp xuất khẩu Việt Nam và cũng là nguồn thức ăn chính của 86 triệu dân số trong nước. Đồng bằng Sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long có sản lượng gạo lần lượt là 17% và 50. Do vậy, vấn đề lương thực được đặt ra như một mối đe dọa đến sự an ninh và ổn định của thế giới nói chung và nước ta nói riêng trong tương lai. Theo dự đoán của các chuyên gia về dân số học, nếu dân số thế giới tiếp tục tăng trong vòng 20 năm tới thì sản lượng lúa gạo phải tăng 80% mới đáp ứng đủ nhu cầu. Vì thế, năng suất lúa luôn là điều quan tâm hàng đầu. Trong thực tế, việc trồng lúa luôn bị đe dọa bởi thiên tai, dịch bệnh như đạo ôn, bạc lá, rầu nâu… Theo ước tính thì sản lượng lúa hiện nay chỉ bằng 53,6% sản lượng có khả năng đạt được nếu không bị dịch bệnh. Rầy nâu (Nilaparvata Lugens Stal) là một trong số các côn trùng gây hại trên lúa làm giảm nghiêm trọng sản lượng lúa trồng ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới, nhất là các nước nhiệt đới. Từ những năm 70 của thế kỷ XX, rầy nâu đã nổi lên như một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở châu Á [14]. Những thiệt hại do rầy nâu gây ra hàng năm làm giảm khoảng 10% sản lượng lúa, đôi khi tới 30% hoặc hơn nữa tại vùng dịch [1], có khi “cháy rầy” làm mất trắng như ở Bắc Bộ năm 1986-1987, 1992-1993, năm 2000 hơn 2000 ha lúa bị nhiễm rầy. Ngoài tác hại trực tiếp rầy nâu còn là môi giới truyền nhiễm bệnh siêu vi trùng cho lúa như bệnh vàng lùn và xoắn lá [14]. Cho đến nay, biện pháp chủ yếu để ngăn chặn dịch rầy nâu là sử dụng thuốc hoá học và kết hợp sử dụng giống kháng. Tuy nhiên, việc sử dụng tràn lan các loại thuốc trừ sâu hay sử dụng thuốc trừ sâu không đúng liều còn là nguyên nhân gây bùng phát của loại côn trùng này như kết quả của sự thích nghi có chọn lọc [20]. Sự thay đổi độc tính của các quần thể rầy nâu diễn ra thường xuyên để thích nghi với ký chủ mới, hoặc tạo ra các dạng “biotype mới” do sức ép chọn lọc từ việc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 2 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ độc canh một giống lúa trồng. Sử dụng giống lúa kháng là biện pháp ưu việt, một mặt giảm chi phí phòng trừ, hạn chế dùng thuốc hoá học gây ô nhiễm môi trường, mặt khác góp phần ổn định môi trường sinh thái. Trong công tác chọn giống lúa kháng rầy nâu thì việc sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng rầy nâu được coi là hiệu quả và ưu việt. Các phương pháp chọn giống truyền thống thông thường để chọn thành công một giống lúa mới ít nhất phải mất từ 4 - 5 năm. Hơn nữa, quá trình chọn lọc gặp nhiều khó khăn, tốn kém về sức người, sức của. Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS - Marker Assisted Seletion) sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn vừa nâng cao hiệu quả chọn lọc, vừa rút ngắn thời gian chọn giống. Đến nay đã có hơn 10.000 chỉ thị phân tử SSR ở lúa được phát hiện và thiết kế, các nghiên cứu về tìm chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng rầy nâu đã được tiến hành ở một số phòng thí nghiệm trên thế giới. 2. Mục tiêu của đề tài Sử dụng công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử để tạo 1-2 dòng lúa thuần ưu việt kháng ổn định với quần thể rầy nâu cho Đồng bằng sông Hồng 3. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài: - Từ năm 2010 đến năm 2013 - Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Bảo vệ Thực vật 4. Ý nghĩa của đề tài: Trong đề tài này đã qui tụ được 2 gen kháng rầy nâu vào 1 giống lúa, có sử dụng chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen kháng. Phối hợp với chọn giống truyền thống đã chọn tạo dòng lúa kháng rầy nâu KR1-1. Điểm kháng rầy nâu trong nhà lưới 1-3 với quần thể rầy nâu của ĐBSH . Có thời gian sinh trưởng vụ mùa 105-112 ngày, năng suất trung bình là 59-60tạ/ha. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 3 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. RẦY NÂU VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG RẦY NÂU Ở LÚA 1.1. Đặc tính sinh học của rầy nâu Rầy nâu (brown planthopper) là một loại côn trùng có tên khoa học là Nilaparvata lugens Stal. Đây là loài côn trùng có vòng đời tương đối ngắn và khả năng sinh sản của chúng tương đối cao, dễ phát triển thành các quần thể sinh học mới. Rầy nâu gây hại trực tiếp bằng cách hút nhựa cây, dẫn đến cháy rầy. Ngoài ra rầy nâu còn gây hại gián tiếp thông qua việc truyền các bệnh virút cho cây như bệnh vàng lùn và lùn xoăn lá (Hồ Văn Chiến và cs, 2000) [29]. Loại côn trùng này đã làm giảm đáng kể sản lượng lúa trên thế giới. Nạn dịch rầy nâu được coi là loại dịch côn trùng quan trọng nhất trên cây lúa ở Malaysia sau sự bùng nổ và lan rộng của dịch rầy nâu năm 1977. Ngoài ra, dịch rầy còn phá hại nghiêm trọng mùa màng tại nhiều nước trồng lúa khác như Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Bangladesh, Srilanka, Thái Lan v.v... Tại Việt Nam, những thiệt hại do rầy nâu gây ra hàng năm làm mất khoảng 10% sản lượng lúa, đôi khi tới 30% hoặc hơn nữa. Rầy nâu không phải là đối tượng gây hại chính trên cây lúa, mật số rầy nâu luôn bị khống chế bởi các loài thiên địch, ký sinh và ít khi xảy ra hiện tượng bộc phát trên diện rộng. Nhưng kể từ cuộc cách mạng "xanh" cách mạng về giống lúa, các giống lúa ngắn ngày được lai tạo để đáp ứng nhu cầu thâm canh tăng vụ, giải quyết nhu cầu lương thực cho con người. Do thâm canh tăng vụ, bón nhiều phân hoá học, đặc biệt là phân đạm đã tạo điều kiện thuận lợi cho sâu bệnh phát sinh gây hại. Việc phòng trừ sâu hại, đặc biệt là sâu ăn lá ở giai đoạn đầu của cây lúa (0 - 40 ngày sau sạ) đã giết chết các loài thiên địch, ký sinh và rầy nâu đã trở thành đối tượng gây hại chính trên cây lúa. Trong những thập niên gần đây, ở nước ta, rầy nâu đã bộc phát vào những năm 1980, 1990. Ikeda và Vaughan (2006) cho rằng rầy nâu hiện nay có 4 biotype: Biotype 1phân bố rộng ở Ðông Á và Ðông Nam Á; Biotype 2 có nguồn gốc ở Philipine phát sinh sau khi sử dụng rộng rãi các giống có gen Bph 1; Biotype 3 phát sinh tại các phòng thí nghiệm ở Nhật Bản và Philipine, Biotype 4 chưa thấy ở vùng Nam Á. Theo công bố mới đây của Jena và cs (2006) [58] tại IRRI đã phát hiện ra gen kháng rầy Bph18 trên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 4 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ giống lúa hoang Oryza australiensis. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, quần thể rầy nâu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long có thể là sự pha trộn giữa hai loại biotype 2 và 3. 1.1.1. Phân bố và ký chủ Rầy nâu có mặt trên khắp các nước trồng lúa. Dịch rầy bùng phát mạnh từ năm 1977 đến nay gây thiệt hại trầm trọng tại Philippin, Thái Lan, Indonesia, Ấn Độ, Mã Lai, Đài Loan, Trung Quốc, Srilanka và Việt Nam. Ngoài cây lúa, rầy nâu còn tác hại trên các cây trồng khác ngô, lúa mì, lúa mạch, kê, cỏ gấu, cỏ lồng vực. 1.1.2. Đặc điểm sinh học của rầy nâu  Thành trùng Có 2 dạng cánh dài và cánh ngắn. Dạng cánh dài: con cái dài 4,5-5,0 mm, bụng màu nâu vàng, đỉnh đầu nhô ra phía trước. Cánh trong suốt, giữa cạnh sau của mỗi cánh có một đốm đen, khi hai cánh này xếp lại hai đốm chồng lên nhau tạo thành một đốm đen to trên lưng. Mắt kép màu nâu nhạt, mắt đơn màu nâu đỏ. Gốc râu có hai đốt phình to, con đực dài 3,6-4,0 mm, màu nâu đậm bé hơn con cái, cuối bụng dạng loa kèn. Dạng cánh ngắn: con cái dài 3,5-4 mm, cánh trước kéo dài đến đốt thứ sáu. Con đực dài 2,0-2,5 mm, mình nhỏ màu đen nâu, cánh trước kéo dài tới 2/3 chiều dài bụng. (b) (a) (c) (d) Hình 1.1. Các giai đoạn sinh trưởng của rầy nâu: (a) trứng, (b) ấu trùng, (c) rầy cánh dài, (d) rầy cánh ngắn (Nguồn: www.khuyennongvn.gov.vn/anh/vllxl.pdf) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 5 http://www.lrc-tnu.edu.vn/  Ấu trùng Có 5 tuổi qua 4 lần lột xác, ấu trùng mới nở còn gọi là rầy cám, kích thước lớn dần từ 0,5-4mm, màu sắc thay đổi từ trắng ngà đến vàng nâu, bụng có màu trắng sữa, mầm cánh kéo dài đến đốt bụng thứ 4.  Trứng Hình bầu dục dài hơi cong, ổ trứng có hình nảy chuối, nằm trong nhu mô bẹ lá.  Đặc điểm sinh lý, sinh thái Rầy cái đẻ từ 300-715 trứng trong suốt một chu kỳ sống. Trứng được đẻ thành từng đám gồm từ 4-10 trứng. Trứng nở sau 21 ngày ở nhiệt độ 20oC và sau 18 ngày ở 30oC. Trứng có thể ngủ nghỉ ở nhiệt độ 10-30oC. Rầy cái cánh dài có thể sống lâu hơn rầy đực ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Rầy trưởng thành thường sống 10-20 ngày ở mùa hè và 30-50 ngày ở mùa thu vì thế rầy nâu thường phát triển ở vụ khô hơn là vụ mưa. Rầy có thể phổ biến ở vùng lúa nước tưới tiêu và lúa nước trời trong suốt chu kỳ sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Thường có 3 lứa rầy trong một vụ lúa ngắn ngày (100-110 ngày). Ở Đồng Bằng sông Cửu Long mỗi năm có từ 10-12 lứa rầy nâu, cây lúa bị hại nặng vào tháng 1, 2 và tháng 6, 7, 8 dương lịch. Trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, rầy nâu sống quanh năm và biến động mật số tuỳ vào giống lúa, hệ thiên địch và điều kiện môi trường. Sau khi lúa gặt xong rầy nâu di chuyển lên cỏ dại nhưng không sống tiềm sinh ở đó. Tuy nhiên chúng chỉ qua đông ở dạng trứng và rầy non tuổi 5 trong vùng ôn đới như Nhật Bản. Sau khi lúa mới sạ hay cấy, rầy nâu di chuyển từ cỏ dại sang ruộng lúa. Như vậy, sự xuất hiện theo mùa xảy ra ở vùng có giai đoạn hưu miên và hoạt động quanh năm ở nơi không có miên kỳ nhưng phát triển mạnh vào mùa khô từ tháng 9-10 và gối lứa liên tục. Trong điều kiện dẫn thuỷ tốt, trồng lúa liên tục, thời vụ lai rai kéo dài, gieo sạ dày với giống lúa nhiễm rầy lại bón nhiều phân đạm, phun thuốc trừ sâu bừa bãi thì rầy nâu sẽ bùng phát mạnh do có tiểu khí hậu phù hợp ẩm độ cao, nhiệt độ tối hảo và không khí êm mát.  Tập tính sinh sống và qui luật phát sinh gây hại Rầy trưởng thành thường tập trung thành từng đám ở trên thân cây lúa phía dưới khóm để hút nhựa. Khi bị khua động thì lẩn trốn bằng cách bò ngang, nhảy sang cây khác hoặc nhảy xuống nước hay bay xa đến chỗ khác. Ban ngày trưởng thành ít hoạt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 6 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ động ở trên lá lúa, chiều tối bò lên phía trên thân lúa hoặc lá lúa. Khi lúa ở thời kỳ chín phần dưới cây lúa đã cứng khô nên chúng tập trung phía trên cây lúa hoặc gần chỗ non mềm của cuống bông để hút nhựa. Rầy trưởng thành có xu tính ánh sáng mạnh (trừ rầy trưởng thành dạng cánh ngắn). Do đó, vào đêm tối trời, lặng gió, trời bức chúng bay vào đèn nhiều nhất là khoảng 20-23 giờ. Tỷ lệ rầy cái và đực biến động và phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ, độ ẩm và trạng thái của cây lúa. Thời kỳ lúa đẻ nhánh-ngậm sữa, lúc dảnh lúa còn non mềm thì tỷ lệ rầy cái 70-80%, khi thân lúa đã cứng (lúc lúa chín) thì tỷ lệ rầy cái và rầy đực tương đương. Sự xuất hiện rầy cánh dài và cánh ngắn phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ, ẩm độ và dinh dưỡng. Nhiệt độ thấp, ẩm độ cao, thức ăn phong phú thì xuất hiện dạng cánh ngắn nhiều. Rầy cánh ngắn có thời gian sống dài, tỷ lệ đực/cái cao, số lượng trứng cao hơn loại cánh dài. Vì thế khi rầy cánh ngắn xuất hiện nhiều thì hiện tượng “cháy rầy” dễ xảy ra. Quá trình phát sinh của rầy như sau: đầu vụ dạng cánh dài di cư từ lúa chét, cỏ dại, mạ bay vào ruộng lúa, đại đa số chúng là dạng cánh dài. Gặp lúa đẻ nhánh chúng sinh ra rầy non mà đa số sau này hình thành rầy cánh ngắn. Sự thay đổi tỷ lệ hai loại hình trong quá trình phát triển của cây lúa như sau: đầu vụ 90-100% cánh dài, bắt đầu đẻ rộ 15-20% cánh ngắn, ngậm sữa 70-80% cánh ngắn và tới khi lúa chín tỷ lệ rầy cánh ngắn chỉ còn 20-25%. Thời gian phát dục các giai đoạn của rầy nâu biến động phụ thuộc vào các yếu tố ngoại cảnh. Rầy nâu có vòng đời ngắn trung bình từ 20-30 ngày. Trong vụ xuân vòng đời là 25-30 ngày, trong vụ mùa vòng đời là 20-25 ngày. Rầy trưởng thành có thể sống từ 20-50 ngày. Trung bình thời gian phát dục các giai đoạn của rầy nâu biến động như sau: trứng 6-8 ngày, rầy non từ 12-14 ngày (mỗi tuổi 2-3 ngày). Rầy nâu phát sinh, gây hại đầu tiên thành từng vạt giữa ruộng, sau đó lan dần ra quanh ruộng. Những ruộng trũng, đất tốt rầy thường phát sinh mạnh. Khi mật độ rầy cao, trong ruộng thường xuất hiện “váng rầy” là váng mỏng lan toả trong ruộng. Do rầy tiết ra chất đường mật nên nấm muội đen phát triển và bám vào thân lúa. Qui luật phát sinh và mức độ gây hại liên quan đến nhiều yếu tố sinh cảnh. Thường khi nhiệt độ không khí cao, ẩm độ cao, lượng mưa nhiều trong một thời gian, sau đó trời Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 7 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ hửng nắng thì rầy nâu dễ phát sinh thành dịch. Thông thường nhiệt độ từ 20-30oC và ẩm độ từ 80-85% là điều kiện thích hợp cho rầy nâu sinh sống và phát triển. Hình 1.2. Vòng đời rầy nâu (Nguồn: www.khuyennongvn.gov.vn/anh/vllxl.pdf) 1.1.3. Tình hình dịch rầy nâu và mức độ gây hại a. Tình hình dịch rầy nâu hại lúa trong những năm gần đây tại Việt nam: - Ở các tỉnh phía Bắc: dịch rầy nâu bùng phát trong các năm: 1981-1984, 19861987, 1992-1993. Đặc biệt năm 2000: hơn 200 nghìn hecta lúa bị nhiễm rầy, 66 nghìn hecta bị nhiễm nặng - Ở các tỉnh phía Nam: dịch rầy nâu xảy ra thường xuyên hơn và gây thiệt hại hơn. Dịch rầy xảy ra vào các năm 1977-1978, 1990-1991, 1996-1997, đặc biệt là năm 1977-1978 có tới 1 triệu hecta lúa bị nhiễm rầy; 1999-2000: 340 nghìn hecta, trong đó có 190 nghìn hecta bị nhiễm nặng. - Đặc biệt ở đồng bằng Sông Cửu Long, vụ hè thu 1998: dịch rầy nâu bùng phát trên diện tích 150 nghìn hecta lúa (Bộ NN và PTNT, 1998) [1]; vụ đông xuân 20052006 hơn 200 nghìn hecta lúa bị nhiễm rầy; vụ hè thu 2006 gần 100 nghìn hecta; vụ thu đông 2006: gần 150 nghìn hecta. b. Mức độ gây hại Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 8 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ * Cháy rầy (hopper burn) - Rầy trưởng thành và rầy non dùng miệng chích vào thân cây lúa để hút dịch cây. Vị trí gây hại và đẻ trứng của rầy nâu còn là cửa ngỏ cho nấm và vi khuẩn xâm nhập. Rầy nâu tiết mật từ việc chích hút nhựa cây còn làm nấm mốc dễ phát triển. - Bị hại nhẹ các lá dưới có thể bị héo. Bị hại nặng chúng gây nên hiện tượng "cháy rầy", cháy rầy xảy ra khi có mật độ rầy cao, rầy hút nhựa làm cây lúa bị héo vàng rồi chết, năng suất có thể giảm 50% thậm chí có thể bị mất trắng. Thông thường khi bị hại nặng chúng tạo nên các vết hại màu nâu đậm. Nếu bị rầy hại nặng thì phần dưới thân cây lúa có màu nâu đen, do tổ chức dẫn nhựa cây bị rầy phá hoại nghiêm trọng làm cho cây lúa bị khô héo và chết. Lúa ở thời kỳ làm đòng và trổ nếu bị rầy hại nặng thì tác hại càng nghiêm trọng hơn. Rầy có thể hút nhựa ở cuống đòng non, đồng thời rầy cái chích rách mô thân cây để đẻ trứng. Các vết thương cơ giới đó tạo điều kiện cho nấm bệnh xâm nhập tạo điều kiện làm cho cây lúa bị thối nhũn, đỗ rạp, gây nên hiện tượng bông lúa bị lép một nữa hoặc toàn bộ. Hiện tượng cháy rầy đầu tiên mang tính cục bộ một vài m2, nhưng nếu gặp điều kiện thuận lợi vết cháy rầy lan toả rất nhanh tới một vài ha hoặc cả cánh đồng trong vòng một đến hai tuần. * Truyền bệnh virus Rầy nâu có thể lấy được cả hai loại virus gây bệnh Vàng lùn và bệnh Lùn xoắn lá vào cơ thể và có thể truyền được đồng thời cả 2 triệu chứng của bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá (Bản Tin Khuyến Nông Hậu Giang, 2006). Theo Lương Minh Châu (2006) [13] bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá truyền bệnh từ rầy nâu, nhưng không phải con rầy nào cũng mang virus này. Theo điều tra chỉ có từ 1 - 1,5 % rầy mang virus. Một con rầy tuổi ba có thể truyền bệnh cho khoảng 200 cây lúa và truyền cùng lúc cả hai loại bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá vào cây lúa. Quan hệ giữa virus gây bệnh và rầy nâu với môi trường truyền bệnh được khẳng định là theo cơ chế bền vững. Khoảng 6-76 % rầy nâu có khả năng truyền virus (trung bình là 40 %). Virus nhân mật số trong rầy. Rầy non có khả năng truyền virus mạnh hơn rầy trưởng thành. Tỷ lệ truyền bệnh của rầy nâu không khác biệt rõ ràng giữa rầy đực và rầy cái hay giữa rầy cánh dài và rầy cánh ngắn. Rầy vẫn tiếp tục truyền virus sau khi lột xác. Sự truyền bệnh của rầy thường không liên tục trong suốt vòng đời mà thường bị gián đoạn. Rầy có thể không truyền được bệnh trong 1 - 4 tuần hoặc cho đến khi chết. Các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 9 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ biotype của rầy nâu đều có khả năng truyền bệnh như nhau. Virus không được truyền qua trứng rầy bị bệnh. 1.2. Đặc tính kháng rầy nâu ở lúa 1.2.1. Cơ chế tính kháng đối với côn trùng Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2007) [5], sự phá hoại của côn trùng đối với mùa màng khác với bệnh cây về mặt cơ chế, bởi vì chúng thuộc sinh vật bậc cao (eukaryote) có đặc điểm thích nghi (fitness) với điều kiện mới khá mạnh mẽ và đa dạng. Cây trồng và côn trùng cùng tiến hành hiện tượng đồng tiến hoá, cùng hiện hữu trong môi trường sinh thái phù hợp với chúng, trong một giai đoạn lịch sử khá dài. Côn trùng (insect) chỉ trở thành sinh vật gây hại (pest) khi con người bắt đầu tiến hành thâm canh trong nông nghiệp. Trong tự nhiên sự cân bằng sinh học vốn có đã bị phá vỡ, đa dạng sinh học ngày càng bị thu hẹp, môi trường sống luôn bị đe dọa, tính hệ thống trong môi trường sinh thái cũng bị phá vỡ nghiêm trọng. Việc phát triển giống kháng sâu hại được quan sát chủ yếu trên nền tảng các giống bản địa và mức độ đa dạng di truyền cao hơn gấp nhiều lần giống cải tiến. Kết quả đánh giá của Heinrich và ctv. (1985) [44] cho thấy có 0,91% giống lúa cổ truyền địa phương kháng rầy nâu trong số 30709 mẫu giống thanh lọc, trong khi đó có 48% quần thể lúa hoang kháng rầy nâu trong số 248 quần thể thanh lọc. Khả năng phát hiện nguồn gen kháng trong loài hoang dại gấp 48 lần trong giống lúa bản địa. Painter (1951) đã phân chia cơ chế tính kháng của giống cây trồng đối với côn trùng gây hại thành 3 mức độ sau: a. Cơ chế không ưa thích (non-preference) Cây có đặc điểm di truyền như thế nào đó làm cho côn trùng không thể ăn, ký sinh, đẻ trứng, cư ngụ. Những đặc điểm này biểu hiện thông qua màu sắc, các dạng lông tơ, độ hở góc lá, mùi hương tiết ra, vị đắng... . Cơ chế này tương đương với tính kháng dọc. b. Cơ chế kháng hoá sinh (antibiotic) Cây chủ có thể sản sinh ra hoá chất gây ảnh hưởng đến tập tính sinh học của côn trùng, làm cho côn trùng giảm kích thước, trọng lượng, chu kỳ sống bị rút ngắn, giảm sinh sản. Kogan và Ortman (1978) đề nghị sử dụng thuật ngữ antixenosis để chỉ hiện tượng cây không thể trở thành cây chủ của côn trùng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ c. Cơ chế chống chịu (tolerance) Cây chủ có đặc điểm làm cho côn trùng đến với qui mô quần thể không lớn, chưa tới ngưỡng gây hại. Đây là hiện tượng có trong tự nhiên hàng trăm triệu năm, khi chưa có sự can thiệp của con người vào làm phá vỡ cân bằng sinh học của môi trường sống. Cây có thể chống chịu được và giảm thiểu tối đa sự tác hại của côn trùng. Nhưng khi mật số côn trùng vượt qua ngưỡng an toàn, cây trở nên nhiễm. Ranh giới giữa chống chịu và nhiễm khá mong manh. Biểu hiện của cây chống chịu là làm cho mức độ gây hại của côn trùng bị hạn chế, làm chậm trễ sự thiệt hại, hoặc vượt qua được thiệt hại, quần thể côn trùng không phát triển đến mức gây hại cây chủ, và nó làm mồi cho thiên địch, duy trì sự sống của thiên địch, giúp cho cân bằng sinh học trong tự nhiên tốt hơn. Người ta nghiên cứu tính chống chịu này theo xu hướng gen kháng thứ yếu (minor genes) hay kháng số lượng như trường hợp bệnh cây. 1.2.2. Các kiểu sinh học rầy nâu Theo Trần Đình Long và ctv (1997) [23], các dạng khác nhau của một loài côn trùng được gọi là các kiểu sinh học (biotype). Mặc dù sự phát sinh các kiểu sinh học mới ở côn trùng có tần số thấp hơn nhiều so với sự xuất hiện các chủng nấm hay vi khuẩn gây bệnh, nhưng qua việc tăng cường thâm canh lúa trong vài chục năm gần đây, các kiểu sinh học rầy nâu mới đã hình thành kèm theo sự thay đổi độc tính của các quần thể rầy nâu đã làm cho nhiều giống lúa kháng rầy trước đây trở nên nhiễm. Đến nay các nhà khoa học đã phân lập được 4 kiểu sinh học rầy nâu phân bố tại các vùng trồng lúa chính trên thế giới. Tại Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế năm 1994, bằng phương pháp nuôi phân lập rầy nâu qua nhiều đời trên các giống lúa TN1, Mudgo và IR36, các nhà khoa học đã phân lập được 3 quần thể rầy nâu mang độc tính khác nhau, gọi là kiểu sinh học 1, kiểu sinh học 2 và kiểu sinh học 3 với đặc tính gây hại như sau: + Kiểu sinh học 1: là loại hình rầy nâu phổ biến trên đồng ruộng tại Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (và ở Việt Nam trong những năm 70), chỉ có thể sống và gây hại trên các giống lúa không mang gen kháng rầy. + Kiểu sinh học 2: có thể sống và gây hại trên những giống lúa mang gen Bph1 hoặc không mang gen kháng, nhưng không gây hại được trên những giống mang gen bph2. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 11 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ + Kiểu sinh học 3: sống và gây hại trên những giống mang gen bph2, nhưng không gây hại được trên những giống mang gen Bph1 hoặc Bph3. Ngoài ra còn thấy ở khu vực Nam Á (Ấn Độ, Srilanka và Bangladesh) có các kiểu sinh học rầy nâu mang độc tính cao hơn so với các kiểu sinh học rầy ở khu vực Đông Nam Á (Nguyễn Công Thuật và ctv, 1996) [16]. Theo tác giả Bùi Chí Bửu (1997)[5] thì quần thể rầy nâu với độc tính mạnh có mặt tại Ấn Độ thuộc kiểu sinh học 4. Nghiên cứu đặc điểm của các kiểu sinh học rầy nâu di chuyển từ vùng này sang vùng khác cho thấy độc tính của chúng không ổn định (Xiao, 1998) [117]. Những nghiên cứu về khả năng gây độc ở rầy hoang dại trên hai giống lúa Thai Col (mang gen kháng rầy bph8) và Pokkali (mang gen kháng rầy Bph9) cho thấy chúng trở lại trạng thái gây độc khi được nuôi liên tục từ 9-15 thế hệ trên chính các cây chủ mang gen kháng đặc hiệu (Ketipearachchi và ctv, 1998) [62]. Biến động độc tính của quần thể rầy nâu ở Việt Nam là đáng lo ngại. Trong những năm 1976-1977, quần thể rầy nâu ở đồng bằng sông Cửu Long đã chuyển từ kiểu sinh học 1 sang kiểu sinh học 2. Còn ở đồng bằng sông Hồng, quần thể rầy nâu cũng đã dịch chuyển từ kiểu sinh học 1 sang kiểu sinh học 2 vào các năm 1987-1988 (Nguyễn Công Thuật và ctv, 1991, 1996) [15], [16]. Do vậy các giống lúa mang gen Bph1 như IR26, IR28, IR30, CR104, NN1A... vốn kháng được rầy kiểu sinh học 1 đã trở nên nhiễm. Gần đây, quần thể rầy nâu ở đồng bằng sông Cửu Long đã chuyển thành một kiểu sinh học mới rất khác biệt, không giống với các kiểu sinh học đã biết ở Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế. Các nhà khoa học của Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long cho rằng quần thể rầy nâu này thực chất là hỗn hợp của kiểu sinh học 2 với kiểu sinh học 3 (Lương Minh Châu và Nguyễn Văn Luật, 1998) [13]. Tuy nhiên, theo một số nghiên cứu khác, quần thể rầy nâu ở đồng bằng sông Cửu Long có độc tính mạnh hơn hỗn hợp của cả 2 kiểu sinh học nói trên. Như vậy rất có thể ở đồng bằng sông Cửu Long đang tồn tại 1 kiểu sinh học rầy mới, như quan điểm của Nguyễn Công Thuật và ctv (1996) [16]. Sự chuyển dịch kiểu sinh học rầy như vậy kèm theo sự thay đổi độc tính (theo hướng tăng lên) đã làm mất tính kháng của các giống lúa mang gen kháng Bph1 và bph2 ở đồng bằng sông Cửu Long, làm cho nhiều giống kháng rầy trước đây trở nên nhiễm, gây thiệt hại rất nhiều cho sản xuất lúa và đặt ra những thách thức to lớn cho các nhà chọn giống. Cho đến nay, các giống kháng rầy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 12 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ điểm 2-3 trước đây như CR203, CR84-1 chỉ còn kháng rầy ở mức điểm 4-5 và đã có lúc nhiễm cấp 8. 1.2.3. Di truyền tính kháng rầy nâu ở lúa Nguồn kháng rầy đã được xác định lần đầu tiên vào năm 1967 do Pathak và ctv. Một chương trình chọn giống và di truyền đã được bắt đầu vào năm 1968. 2 gen kháng rầy Bph1 và bph2 đã được xác định vào năm 1970 Giống kháng rầy đầu tiên mang gen Bph1 là IR26 đã được đưa ra vào năm 1973 và đã được chấp nhận rộng rãi tại Philippine, Indonesia và Việt nam. Nhưng đã trở nên nhiễm vào nawm 1976-1977 bởi ảnh hưởng của biotype 2. Vào thời điểm này, giống IR36 và IR38 và sau đó là IR42 với gen bph2 đã được đưa ra và nhanh chóng thay thế IR26. Tính kháng của nó đã kéo dài được 14 năm đến tận 1991. Sau đó là một sô giống khác như IR60, IR62, IR72 kháng với biotype 3 đã được đưa ra. Bằng các thí nghiệm phân tích di truyền và chỉ thị phân tử, các nhà khoa học đã xác định được 1 số gen kháng rầy chính (Bảng 1). (Bùi Chí Bửu và ctv, 1997; Nguyễn Công Thuật và ctv, 1996; Ikeda, 1985; Ishii và ctv, 1994; Khush và Brar, 2011; (Liu va CS 2009); Murai và ctv, 2001 [6] [16] [52] [53] [63] . Các gen Bph20, Bph21 cũng đã được lập bản đồ trên NST lúa. Bảng 1. Các gen kháng rầy nâu và giống chỉ thị mang gen kháng Dòng chỉ thị Gen kháng Trội/Lặn TN1 Không - Mudgo Bph1 Trội ASD7 bph2 Lặn Rathu Heenati Bph3 Trội Babawee bph4 Lặn ARC10550 bph5 Lặn Swarnalata Bph6 Trội T12 bph7 Lặn Chinsaba bph8 Lặn Pokkali Bph9 Trội O. australiensis Bph10 Trội O. officinalis bph11(t) Lặn O. officinalis bph12(t) Lặn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 13 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Năm 1993, Quader và các cộng sự đã khảo nghiệm di truyền tính kháng rầy nâu của bốn giống lúa Bangladesh. Kết quả chỉ ra rằng có một gen lặn kháng rầy trong giống lúa ARC10550, hai gen trội bổ trợ trong giống ARC6650, một gen trội trong cả hai giống Swarnalata và T27A Bảng 2. Mối liên hệ giữa biotype rầy nâu và gen kháng rầy ở lúa Cấp độ kháng với từng Tên giống Gen biotype 1 2 3 4 Mudgo Bph1 R S R S ASD7 bph2 R R S S Rathu Heenati Bph3 R R R R Babawee bph4 R R R R ARC 10550 bph5 S S S R Swarnalata Bph6 S S S R T12 bph7 S S S R Chin Saba bph8 R R R – Balamawee Bph9 R R R – TN1 None S S S S O. australiensis Bph18 R R R R O. officinalis Bph6, Bph13 R R R R O. minuta Bph20, Bph21 R – – O. latifolia Bph12 – R – – Các tác giả Ấn Độ Tomar J.B và ctv, 1996) cũng đã khảo sát di truyền tính trạng kháng rầy nâu ở 15 dòng, giống lúa dựa trên các thế hệ F1, F2, F3 và lai trở lại. Kết quả cho thấy các dòng BG 379-4, IET 7944, IET 7946 và BG 379-1 mang 1 gen kháng trội (phân ly 3:1), các dòng MTU 5195 và RP2075-5-7-32 mang 1 gen kháng lặn (phân ly 1:3), các dòng MTU 5295 và Rathu Heenati mang 2 gen kháng trội (phân ly 15:1), các dòng Ptb33 và IR 1960-274-3-3-1 mang 3 gen kháng trội (phân ly 63:1), các dòng Babawee và CR 266-407-6-1 mang 1 gen kháng trội và 1 gen kháng lặn (phân ly 13:3), các dòng IR 17488-2-3-2 và CR 57 MR 1523 mang 2 gen kháng bổ trợ (phân ly 9:7), dòng IET 7947 mang 3 gen kháng bổ trợ (phân ly 27:37). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 14 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Ngoài ra, tính kháng rầy do gen tế bào chất kiểm soát cũng đã được phát hiện ở một số giống lúa trong tự nhiên (Rao, 1993). Nghiên cứu cơ chế của tính kháng rầy nâu trên những loài lúa dại Oryza officinalis, O. punctata, O. latifolia và trên 6 giống lúa trồng, trong đó bao gồm 5 giống lúa chỉ thị mang gen kháng rầy: Rathu Heenati (Bph3), Babawee (bph4), ARC10550 (bph5), Swarnalata (Bph6), Ptb33 (bph2+Bph3) cùng với giống TN1 (không mang gen kháng) cho thấy các loài lúa dại duy trì tính kháng cao qua 48 giờ thả rầy, trong khi ở các giống lúa trồng, tốc độ phá hủy cây tăng theo thời gian thả rầy. Nghiên cứu này cũng cho thấy lượng thức ăn rầy ăn vào và lượng thức ăn tiêu hóa được trong ruột rầy ở các giống lúa trồng cao hơn ở lúa dại. Tốc độ sinh trưởng, tuổi thọ, số trứng và tỉ lệ nở của trứng rầy trên lúa dại thấp hơn so với lúa trồng. Rất có thể lúa dại mang nhiều gen kháng rầy hơn so với lúa trồng nên các cây lúa dại mang đặc tính kháng rầy tốt hơn. Theo Jairin và cs 2007, [57] các gen Bph1, bph2, Bph3, bph4 đã được sử dụng rộng rãi trong chương trình chọn giống ở Thái lan, nhưng những giống này đã mất khả năng kháng rầy nâu mặc dù Bph3 đã được xác định là có mức kháng cao, phổ kháng rộng đối với rầy nâu. 2. CHỈ THỊ PHÂN TỬ VÀ NHỮNG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG LÚA 2.1. Chỉ thị phân tử 2.1.1. Khái niệm chung chỉ thị phân tử Chỉ thị phân tử là một công cụ mới trong nghiên cứu di truyền và chọn giống cây trồng. Hiệu quả của phương pháp này trong chọn giống là rất lớn như: nhanh, rẻ, chính xác, nâng cao được năng suất sản lượng. Ứng dụng của DNA-Marker trong chọn giống như: Lập bản đồ QTL/gen kiểm soát những tính trạng quan trọng có ý nghĩa kinh tế. Chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-assisted selection - MAS) cho một tính trạng. Chuyển QTL/gen vào giống mới nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker-assisted backcrossing MABC) vào giống mới. Tạo các dòng đẳng gen cho các tính trạng kháng sâu bệnh phục vụ việc phân lập gen. Chọn tạo giống phân tử của tổ hợp nhiều tính trạng khó mà chọn giống truyền thống không làm được. Đặc điểm của chỉ thị phân tử ADN: - rất nhiều đa hình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 15 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - là đồng trội hoặc trội - nhiều chỉ thị phân tử thuộc loại “đơn locus–nhiều alen” - không bị ảnh hưởng bởi áp lực môi trường Chỉ thị phân tử (CTPT) ADN có nhiều loại, đa dạng và ổn định trong mọi giai đoạn của sinh vật. Cây trồng có khoảng 108 – 1010 nucleotit trong ADN tổng số. Thậm chí, nếu chỉ tính một sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể đã dẫn đến một số lượng khổng lồ các chỉ thị ADN giữa 2 cá thể đó. Chỉ thị phân tử ADN có ưu điểm hơn nhiều so với chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá sinh. CTPT ADN rất phong phú do sự đa dạng của ADN, chúng có tính ổn định và không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường cũng như giai đoạn phát triển của sinh vật. Một chỉ thị ADN lý tưởng phải đạt các yêu cầu sau: Bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, tập tính chọn lọc trung tính (trình tự ADN của cơ thể nào cũng là trung tính với các điều kiện môi trường), dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ dàng. Tuy nhiên, gần như không thể tìm thấy một CTPT nào có thể thỏa mãn tất cả những ðiều kiện trên. Tùy thuộc vào những nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị thỏa mãn được một số điều kiện (Nguyễn Duy Bảy và ctv., 2001)[17]. Chỉ thị phân tử được chia làm 3 loại chính: - Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN - Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR - Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại. Nhóm chỉ thị này thực ra cũng dựa trên cơ sở nhân bội ADN nhưng do chúng có bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp vào một nhóm riêng. 2.1.2. Phân loại các loại chỉ thị phân tử 2.1.2.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: Chỉ thị RFLP (Restriction fragment length polymorphism - Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn ) Mỗi một loài sinh vật có một bộ ADN đặc hiệu trong cấu trúc. Sự thay đổi, mất đi hay thêm vào các nucleotide khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm riêng biệt của mỗi họ, giống, loài, thậm chí mỗi cá thể. Vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, sau đó dùng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò. người ta có thể nhận biết được những đoạn ADN có chiều dài khác nhau. Sự khác nhau về kích thước các đoạn được tạo ra do xử lý enzym giới hạn đối với các phân tử ADN trong nhân hoặc trong các cơ quan tử khác nhau được gọi là Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ tính đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn. Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người. Trong phương pháp RFLP, enzym giới hạn được sử dụng để cắt ADN genome thành nhiều mảnh ADN có độ dài khác nhau. Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen như đảo đoạn, thêm hoặc mất đoạn ADN tùy thuộc vào mỗi giống, mỗi loài thậm chí mỗi cá thể. Mỗi loài sinh vật có một bộ gen đặc hiệu trong cấu trúc. Vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, các đoạn cắt ra của ADN với kích thước hay chiều dài khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền để xem xét các mẫu nhiễm sắc thể. Sự nhận biết các đoạn cắt được thực hiện nhờ kỹ thuật lai với các mẫu ADN (Nguyễn Quang Thạch, và ctv) [21]. Đặc điểm của chỉ thị RFLP: - Là chỉ thị đồng trội, nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một lôcut gen. Do vậy có thể phân biệt được các thể đồng hợp tử (AA hoặc BB) và các cá thể dị hợp tử AB. - Chỉ thị RFLP rất đáng tin cậy, dùng để kiểm tra các chỉ thị phân tử khác - Hạn chế của chỉ thị RFLP: phương pháp phát hiện RFLP tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, lượng công việc cồng kềnh. 2.1.2.2. Các chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR a. Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs – Đa hình các đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên) Chỉ thị RAPD được hình thành dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR được William và cộng sự phát triển vào năm 1990. Phương pháp RAPD không cần dùng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn ADN nhất định mà dùng các mồi đơn ngẫu nhiên để nhân các đoạn ADN một cách ngẫu nhiên. Mồi ngẫu nhiên là đoạn oligonucleotide dài khoảng từ 6– 12 nucleotit, nhiệt độ kết cặp thấp. Do tính ngẫu nhiên nên các đoạn mồi này vừa là mồi xuôi, vừa là mồi ngược. Các đoạn này sẽ bắt cặp với trình tự bổ sung trong hệ gen của sinh vật từ đó nhân bản. Mồi càng ngắn thì khả năng bắt cặp càng cao và phản ứng dễ thực hiện. Mồi càng dài thì khó bắt cặp nhưng kết quả nhân đoạn ADN càng chính xác (Trịnh Đình Đạt, 2006)[24]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 17 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Ưu điểm của loại chỉ thị này là không cần phải biết trình tự các nucleotide trên đoạn ADN cần nhân, tiêu tốn ít ADN mẫu. Bên cạnh đó chỉ cần một bộ mồi ta có thể sử dụng được với các loài khác nhau. Quy trình thực hiện nhanh, dễ dàng và dùng ánh sáng huỳnh quang để phát hiện băng ADN thay cho chất phóng xạ. Bên cạnh đó cũng còn một số hạn chế như: chỉ thị RAPD là chỉ thị trội bởi sự có mặt hay vắng mặt những băng ADN đặc trưng nên không phân biệt được thể dị hợp tử. RAPD có tính chất ngẫu nhiên nên việc lặp lại phân tích, điện di để tìm liên kết gen thường không đồng nhất. Số băng thu được khi sử dụng các mồi ngẫu nhiên còn rất lớn và không chắc chắn khi có băng ADN giống nhau cùng kích thước trên bản gel có thực sự là cùng một vị trí trên hệ genome hay không? Chỉ thị RAPD còn có một hạn chế nữa là sự nhân bội của nhiều locus, độ nhạy của RAPD phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng, đặc biệt là ở những cơ thể có hệ gen lớn như lúa mì. Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại (Naqvi và ctv, 1995) [51], trong phát hiện tính đa dạng của sinh vật, những thay đổi trong gen, đột biến NST đều làm thay đổi kích thước của đoạn cần nhân vì khi có sự thay đổi một bazơ nitơ nào đó thì sẽ ngăn cản việc tiếp hợp của mồi với ADN khuôn. b. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài các đoạn ADN nhân bản chọn lọc) Chỉ thị AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng enzym giới hạn cắt ADN hệ gen và nhân bội các đoạn ADN chọn lọc bằng kỹ thuật PCR, được phát triển bởi Vos và cộng sự năm 1995. Để thiết kế được các mồi đặc trưng trước hết ta cắt các mẫu nghiên cứu bằng enzym giới hạn. Khi xử lý enzym giới hạn ADN sẽ bị cắt thành vô số mảnh có kích thước khác nhau. Mỗi mảnh cắt, đều biết trước trình tự nucleotide của chúng ở hai đầu cắt. Dựa vào trình tự ở hai đầu cắt thiết kế các đoạn gắn (adaptor). Sau đó dùng enzym ligase để nối các đoạn ADN thích ứng vào hai đầu ADN đã cắt. Dựa vào trình tự adaptor ta thiết kế mồi PCR. Mồi PCR gồm hai phần: Một phần có trình tự bổ sung với adaptor và phần kia là những nucleotide được thêm vào tùy ý, thường từ 1 – 3 nucleotide. Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 18 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chỉ thị AFLP rất chính xác, có thể sử dụng cho tất cả các thực vật, động vật. Loại chỉ thị này vô cùng hữu hiệu trong việc “DNA fingerprinting” “lấy vân tay ADN” của bất kỳ cá thể sinh vật nào. Nhược điểm: kỹ thuật cầu kỳ, tốn kém. c. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu) Chỉ thị STS do M.Olson và cộng sự đề xuất năm 1989. STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide đã biết trước của ADN trong genome. STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locut đã biết bằng việc sử dụng cặp mồi PCR được thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locut đặc trưng này (Trịnh Đình Đạt, 2006)[8]. Các đoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR. Phương pháp này dựa trên nguyên lý PCR nên dễ thực hiện, không tốn kém, hơn nữa lại sử dụng mồi đặc hiệu nên kết quả ổn định. Nhược điểm của chỉ thị này là cần biết trình tự hai đầu của các đoạn mẫu dò mới có thể tiến hành được nghiên cứu, không có tính chất đa hình như những ADN marker khác, tần suất đa hình thấp, thay đổi ở mỗi locus và ở mỗi cặp lai cụ thể (Nguyễn Thị Lang, 2002)[18]. d. Chỉ thị CAPs (Cleaved Amplification Polymorphisms - Đa hình độ dài mảnh cắt giới hạn). CAP là chỉ thị dựa trên đa hình độ dài mảnh cắt giới hạn của các sản phẩm PCR (Jarvis và ctv, 1994)[56]. Những sản phẩm PCR và STS, RAPD nhiều khi không thể hiện đa hình độ dài giữa hai mẫu thí nghiệm được cắt thêm bởi các enzym giới hạn. Các enzym sử dụng trong việc tìm loại chỉ thị này thường là enzym cắt 4. Sản phẩm cắt được phân giải trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide tuỳ thuộc vào kích thước của các mảnh cắt. e. Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng) Khi so sánh trình tự ADN của những gen kháng đã phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau, các nhà khoa học đã thấy rằng những gen này có chung những vùng lặp lại, như vùng lặp lại giàu leucin (Leucine Rich Repeat: LRR), vùng vị trí liên kết nucleotit (Nucleotit Binding Site: NBS) và vùng protein Kinaza (PK) (Grant và ctv., 1995)[34]. Những vùng này đã được sử dụng trong việc xây dựng một kỹ thuật dựa trên PCR, đó là kỹ thuật RGA. Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN được xây dựng dựa vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng. Bởi vậy, sản phẩm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 19 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ “nhận dạng” ADN có thể là một vùng hoặc toàn bộ gen kháng. Kỹ thuật RGA đã được dùng để tách, lập bản đồ gen kháng và mô tả đa dạng di truyền. (Chen và ctv., 1999)[28]. f. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeates - Chỉ thị vi vệ tinh) - Chỉ thị SSR: Chỉ thị này được phát triển bởi Litt và Luty năm 1989, là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2- 6 nucleotide, theo kiểu lặp lại ngắn và vài chục lần. Ví dụ: NNNNNNN(GA)20-40NNNNNNNNN NNNNNNN(CAT)16-26NNNNNNNNN NNNNNNN(TTGG)12-18NNNNNNNNN Chỉ thị SSR được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada và ctv, 1982)[35], sau đó chỉ thị này đựơc dùng trong nghiên cứu di truyền ở lúa (Caldo và ctv, 1998)[27]. Bộ gen Eukaryote có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp ADN có kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ từng loài. Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật Eukaryote là khá phổ biến, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn lần hoặc nhiều hơn. Các „vi vệ tinh” rất phổ biến trong hệ gen của tất cả các sinh vật. Vùng có ADN lặp lại thường kém ổn định hơn so với các vùng khác, do đó ở các cá thể khác nhau, trình tự đó được lặp lại với số lần khác nhau. Như vậy vùng “vi vệ tinh” thường có độ đa hình cao hơn so với các vùng khác. Chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội dựa trên các trình tự lặp lại ngắn. Đây là loại chỉ thị đang được sử dụng nhiều trong lập bản đồ gen, trong nghiên cứucứu đa dạng di truyền và chọn giống MAS. Ưu điểm của chỉ thị SSR là tương đối đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém. SSR là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao, nhưng quá trình thiết kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài. Tuy nhiên, SSR là một loại marker chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống vật nuôi cây trồng khác nhau trong cùng một loài động vật hay thực vật. Người ta sử dụng chỉ thị SSR để phân tích hệ gen trong chọn giống, xây dựng bản đồ liên kết gen, trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây trồng, các bệnh hại và sử dụng trong việc phân định sự sai khác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 20 http://www.lrc-tnu.edu.vn/