Tài liệu Phân lập các chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả năng ức chế tăng trưởng một số dòng tế bào ung thư

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ***** Bùi Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ***** Bùi Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Phạm Thị Lƣơng Hằng PGS. TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung Hà Nội – Năm 2016 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung ̉ ̀ LƠI CAM ƠN Lời đầ u tiên , tôi xin gƣ̉i lời cảm ơn sâu sắ c nhấ t tới TS. Phạm Thị Lƣơng Hằng và PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, ngƣời đã trƣ̣c tiế p hƣớng dẫn , tạo mo ̣i điề u kiê ̣n thuâ ̣n lơ ̣i , giúp đỡ tôi trong suốt quá trình ho ̣c tâ ̣p và hoàn thành luâ ̣n văn. Các cô không chỉ là những ngƣời truyền đạt cho tôi những kiến thức mà còn hỗ trợ tôi rất nhiều về vật chất. Tôi thấy mình thật may mắn khi đƣợc là học trò của các cô. Tôi xin gƣ̉i lời cảm ơn chân thành nhấ t tới ThS. Bùi Thị Vân Khánh, ThS. Nguyễn Đắ c Tú , nhƣ̃ng ngƣời chi ̣ , ngƣời anh tâ ̣n tình hƣớng dẫn tôi nhƣ̃ng ki ̃ thuâ ̣t đầ u tiên khi bƣớc chân vào phòng thí nghiê ̣m . Anh, chị không chỉ truyền đạt cho tôi nhƣ̃ng kinh nghiê ̣m trong công viê ̣c mà cả nhƣ̃ng kinh nghiê ̣m quý báu trong cuô ̣c số ng, đó sẽ là nhƣ̃ng hành trang mà tôi sẽ luôn mang theo sau này . Xin gửi lời cảm ơn đến CN. Nguyễn Thị Thu Hà, CN. Hà Hữu Cƣờng, CN. Nguyễn Thị Loan, CN. Vũ Anh Công đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm. Xin gƣ̉i lời cảm ơn sâu sắ c nhấ t tới các thầ y cô và cán bô ̣ trong Khoa Sinh học, đă ̣c biê ̣t là các thầ y cô trong Bô ̣ môn Sinh ho ̣c tế bào và Bộ môn Sinh lí Thực vật và Hóa sinh đã giúp đỡ , tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành lu ận văn này. Và, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chi ̣ , các bạn và các em trong Phòng thí nghiệm Nuôi cấy Tế bào ngƣời và động vật cũng nhƣ Phòng thí nghiệm Nuôi cấy Mô thực vật và Vi tảo đã luôn đồ ng hành , quan tâm và giúp đỡ tôi trong thời gian tham gia nghiên cƣ́u ta ̣i đây . Sƣ̣ quan tâm , chia sẻ của các bạn và các em là động lực lớn lao với tôi trong những lúc mệt mỏi và khó khăn nhất . Tôi sẽ không bao giờ quên thời gian làm việc đầ y ắ p tiế ng cƣời cùng các ba ̣n trong hai gia đinh lớn ở trƣờng Đại học khoa học tự nhiên Hà Nội. ̀ i Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu này trong đề tài mang mã số 106.16-2012.24 Cuố i cùng, tôi xin gƣ̉i lòng biế t ơn sâu sắ c và lớn lao nhấ t đế n gia đình tôi , nhƣ̃ng ngƣời đã hy sinh cả vâ ̣t chấ t và tinh thầ n , luôn yêu thƣơng , ủng hộ, đô ̣ng viên và tôn tro ̣ng mo ̣i quyế t đinh của tôi . Mỗi khi nghi ̃ về gia đinh tôi nhƣ đƣơ ̣c ̣ ̀ tiế p thêm sƣ́c ma ̣nh để vƣ̃ng tin hoàn thành tố t luận văn này. Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Bùi Thị Thuỳ Dung ii Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Tƣ̀ viế t tắ t Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ED50 Median effective dose Liều có hiệu quả ở 50% số động vật thí nghiệm EtOAc Ethyl acetate Dung môi ethyl acetate HCT116 Human colon carcinoma cell HepG2 Hepatocellular carcinoma G2 Dòng tế bào ung thƣ gan IC50 Half maximal inhibitory concetration Nồng độ ức chế 50% số tế bào LC/MS Liquid chromatography–mass spectrometry Dòng tế bào ung thƣ đại trực tràng Sắc kí lỏng - khối phổ LD50 Median lethal dose 50% Liều gây chết trung bình MCF7 Breast adenocarcinoma cell Dòng tế bào ung thƣ vú MeOH Methanol Dung môi methanol Minimal inhibitory MIC concentration Nồng độ ức chế tối thiểu n-Hex n-Hexan Dung môi n-Hexan OD Optical Density Mật độ quang học SRB Sulforhodamine B Sulforhodamine B TLC Thin-layer chromatography Sắc kí bản mỏng MỤC LỤC iii Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 2 1.1. Vi khuẩn lam ................................................................................................... 2 1.1.1.Đặc điểm hình thái và sinh lí của vi khuẩn lam ................................... 2 1.1.2.Phân loại vi khuẩn lam ......................................................................... 3 1.2. Tiềm năng phát triển dƣợc phẩm điều trị ung thƣ từ vi khuẩn lam ................ 4 1.3. Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam .................... 9 1.4. Phân tách các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam ..................................... 13 Chƣơng 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 15 2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 15 2.1.1. Các chủng vi khuẩn lam .................................................................... 15 2.1.2. Dòng tế bào........................................................................................ 16 2.2. Các nội dung chính trong nghiên cứu ........................................................... 17 2.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 17 2.3.1. Đánh giá khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào .................................. 17 2.3.2. Chuẩn bị dịch chiết từ sinh khối vi khuẩn lam Nostoc sp. APD4 ..... 19 2.3.3. Phƣơng pháp sắc kí cột silica gel ..................................................... 20 2.3.5. Phƣơng pháp LC/MS ......................................................................... 21 Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 22 3.1. Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ...................................... 22 3.1.1.Kết quả hoạt hóa tế bào ...................................................................... 22 3.1.2.Xác định chỉ số IC50 của các dịch chiết từ vi khuẩn lam.................... 22 3.2. Phân lập các chất có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào từ vi khuẩn lam Nostoc sp. APD4 .............................................................................................................. 29 3.2.1.Sự phân tách bằng cột sắc ký silica gel .............................................. 29 3.2.2. Sự phân tách bằng cột sắc kí sillica gel lần 2 .................................... 32 3.2.3. Sự phân tách bằng cột sắc kí silica gel lần 3 ..................................... 35 3.3. Xác định khối lƣợng phân tử của hoạt chất bằng phƣơng pháp LC/MS ...... 37 iv Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung KẾT LUẬN .......................................................................................................... 43 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 45 PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Cryptophycin 1 [36]. ............................................. 5 v Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Borophycin [17]. .................................................. 7 Hình 2.1. Các chủng vi khuẩn lam dùng trong nghiên cứu ................................... 16 Hình 3.1. Các dòng tế bào ung thƣ dùng trong phép thử hoạt tính ........................ 22 Hình 3.2. Tế bào MCF7 ở mẫu đối chứng sau 48h thử nghiệm ............................ 23 Hình 3.3. Tế bào MCF7 dƣới tác dụng của dịch chiết APD4- EtOAc .................. 24 Hình 3.4. Tế bào HCT116 dƣới tác dụng của dịch chiết APD4- EtOAc ............... 24 Hình 3.5. Tế bào HepG2 dƣới tác dụng của dịch chiết APD4- EtOAc ................. 24 Hình 3.6. Đƣờng cong đáp ứng liều của các dịch chiết có hoạt tính trên hai dòng tế bào MCF7 và HCT116. .......................................................................................... 27 Hình 3.7. Đƣờng cong đáp ứng liều của dòng tế bào MCF7 đối với Taxol .......... 28 Hình 3.8. Các phân đoạn rửa giải từ dịch chiết APD4-Met ................................... 30 Hình 3.9. Hình dạng tế bào MCF7 khi đƣợc ủ với phân đoạn DE5 ...................... 32 Hình 3.10. Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn có hoạt tính (DM-E). ................... 33 Hình 3.11. Tế bào MCF7 khi ủ với phân đoạn DP1 và DP5 ở nồng độ 50µg/ml . 34 Hình 3.12. Sắc ký đồ TLC của phân đoạn DP1 và DP5 ....................................... 35 Hình 3.13. Tế bào MCF7 dƣới tác dụng của phân đoạn DF4 ................................ 36 Hình 3.14. Sắc kí đồ của phân đoạn DF2 ở bƣớc sóng 256nm.............................. 37 Hình 3.15. Sắc kí đồ của phân đoạn DF4 ở bƣớc sóng 256nm.............................. 38 Hình 3.16. Phổ khối lƣợng của hợp chất P3 xuất hiện ở phút 23,6 ....................... 39 Hình 3.17. Kết quả tra cứu hợp chất có trọng lƣợng phân tử từ 795-796 dalton tháng 10/2016. ........................................................................................................ 40 Hình 3.18. Công thức cấu tạo của Apratoxin E [26]............................................. 41 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số chất có khả năng kháng ung thƣ đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam [39]. .......................................................................................................................... 8 Bảng 2.1. Các chủng vi khuẩn lam dùng trong thí nghiệm đánh giá hoạt tính ...... 15 vi Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Bảng 3.1. Giá trị tăng sinh A% của các dịch chiết có hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào dòng MCF7 .................................................................................................. 25 Bảng 3.2. Giá trị tăng sinh A% của các dịch chiết có hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào dòng HCT116 .............................................................................................. 26 Bảng 3.3. Giá trị IC50 của một số dịch chiết có hoạt tính ....................................... 27 Bảng 3.4. Giá trị IC50 của Taxol trên ba dòng tế bào MCF7, HCT116 và HepG2 28 Bảng 3.5. Khối lƣợng các phân đoạn từ dịch chiết của chủng APD4.................... 31 Bảng 3..6. Khối lƣợng khô của các phân đoạn thu đƣợc từ cột silica gel lần 2 .... 34 Bảng 3.7. Khối lƣợng các phân đoạn thu đƣợc từ cột sắc ký silica gel lần 3 ........ 36 Bảng 3.8. Tỷ lệ tƣơng đối về hàm lƣợng của các chất trong phân đoạn DF4 ....... 38 vii Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung MỞ ĐẦU Sự xuất hiện của bệnh ung thƣ đã và đang là mối đe dọa tính mạng con ngƣời hàng đầu trên thế giới với tỷ lệ mắc phải ngày càng tăng . Theo số liê ̣u báo cáo của Viện nghiên cứu quốc tế về ung thƣ , trong năm 2012, trên toàn thế giới có hơn 8,2 triệu ngƣời chết vì các loại bệnh ung thƣ khác nhau. Các chuyên gia cảnh báo nếu con ngƣời không sớm tìm đƣợc biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn tốc độ phát triển nhƣ hiện nay của căn bệnh này thì tới năm 2035, ung thƣ sẽ cƣớp đi sƣ̣ số ng của ít nh ất 24 triệu ngƣời [14]. Hóa trị và xạ trị từ lâu là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến trong điều trị ung thƣ, tuy nhiên hai phƣơng pháp này có nhiều tác dụng phụ, ảnh hƣởng xấu tới sức khỏe ngƣời bệnh, hoặc ngƣời bệnh có thể tử vong trƣớc khi tiêu diệt đƣợc tận gốc các tế bào ung thƣ. Bởi vâ ̣y, viê ̣c tim ra mô ̣t loa ̣i thuố c đă ̣c hiê ̣u điề u tri ̣ung thƣ và an toàn v ới ngƣời bệnh là ̀ mô ̣t vấ n đề r ất cấ p bách hiê ̣n nay . Trong công cuộc tìm kiếm đó, các hợp chất từ thiên nhiên đƣợc quan tâm nhiều hơn cả bởi chúng đã có mặt trong các bài thuốc dân gian từ lâu và có độ an toàn cao. Vi khuẩn lam là nguồn giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học với tiềm năng dƣợc phẩm có ý nghĩa quan trọng. Chúng cho thấy khả năng chống lại các khối u, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm. Một số hợp chất đƣợc phân lập và tinh sạch từ vi khuẩn lam đã cho kết quả bƣớc đầu thành công trong các thử nghiệm điều trị ung thƣ lâm sàng. Các hợp chất này đƣợc xem là hợp chất tiên phong cho sự phát triển, tổng hợp các hợp chất dẫn với hoạt tính sinh học tốt hơn. Từ các kiến thức nhƣ trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân lập các chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả năng ức chế tăng trƣởng một số dòng tế bào ung thƣ” với mục đích: 1. Đánh giá được khả năng ức chế tăng trưởng của dịch chiết từ 9 chủng vi khuẩn lam lên 3 dòng tế bào ung thư phổ biến ở Việt Nam. 2. Tìm ra được hợp chất có khả năng kháng ung thư từ dịch chiết vi khuẩn lam 1 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn lam 1.1.1. Đặc điểm hình thái và sinh lí của vi khuẩn lam Vi khuẩn lam là vi khuẩn quang hợp cổ xƣa, xuất hiện trên trái đất từ 3,5 tỉ năm về trƣớc. Bằng việc tạo ra khí oxy nhƣ một sản phẩm phụ của quá trình quang hợp, vi khuẩn lam đƣợc cho là đã chuyển đổi khí quyển ở thời kì sơ khai từ tính khử sang tính ô-xi hóa, từ đó làm thay đổi thành phần sự sống trên Trái Đất. Chính vì vậy, chúng đƣợc xem là nhóm sinh vật tiên phong trong quá trình sản xuất ra khí oxy giúp hình thành sự sống trên Trái Đất ngày nay. Vi khuẩn lam trƣớc đây còn đƣợc biết đến với tên gọi là tảo lam bởi chúng có cơ chế quang hợp giống tảo (nhóm sinh vật nhân chuẩn) với sắc tố quang hợp nằm trên màng thylakoid. Tuy nhiên, cấu tạo tế bào của chúng giống với sinh vật nhân sơ (Prokaryote) hơn là sinh vật nhân chuẩn (Eukaryote) vì chúng không có màng nhân, vật liệu di truyền không liên kết với protein histone, thiếu màng bao quanh các bào quan nhƣ bộ máy Golgi, lục lạp, ty thể, lƣới nội chất. Vi khuẩn lam có ribosome 70S và có cấu trúc thành tế bào gồm các lớp peptidoglycan. Màu xanh của vi khuẩn lam là do sự kết hợp của chlorophyll a (xanh lục) và các sắc tố phụ phycocyanin (xanh lam), allophycocyanin (xanh lam), phycoerythin (màu đỏ). Các sắc tố này kết hợp với nhau theo tỷ lệ và thành phần nhất định để thích ứng với môi trƣờng sống [9]. Vi khuẩn lam có hai hệ thống quang hệ I và II nằm trên màng thylakoid (trừ chi Gleobacter). Trong quang hệ II có phycobiliprotein có chức năng giống các sắc tố “ăng-ten” bắt giữ năng lƣợng sáng cho chlorophyll a. Năng lƣợng ánh sáng sau đó sẽ đƣợc chuyển từ quang hệ II sang quang hệ I - nơi chúng đƣợc chuyển thành năng lƣợng hóa học trong đó có phân tử cao năng lƣợng nhƣ ATP và NADPH+H. Phân tử cao năng này sẽ đƣợc sử dụng để cố định CO2 thành carbohydrate thông qua chu trình Calvin. Vi khuẩn lam thực hiện quang hợp trong điều kiện hiếu khí với H2O là chất cho điện tử và O2 là sản phẩm phụ đƣợc tạo ra. 2 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Tuy nhiên, một số chủng vi khuẩn lam có thể sống trong điều kiện kị khí bằng cách sử dụng quang hệ I và chất cho điện tử H2S, H2 hoặc các hợp chất hữu cơ [9]. Vi khuẩn lam có thể đƣợc tìm thấy gần nhƣ trong mọi môi trƣờng sống trên đất liền nhƣ đất, đá ẩm, đá trong các hoang mạc thậm chí kể cá các loại đá tại châu Nam Cực và trong môi trƣờng nƣớc nhƣ trong các đại dƣơng, môi trƣờng nƣớc ngọt [8]. Vi khuẩn lam đã và đang đƣợc nghiên cứu trong một số lĩnh vực, đem lại giá trị kinh tế vô cùng to lớn nhƣ:  Làm phân bón sinh học cho lúa và các cây trồng khác bởi nhiều chủng vi khuẩn lam có các tế bào dị hình, có khả năng cố định nitơ khí quyển giúp tăng năng suất cây trồng.  Vi khuẩn lam là một nguồn protein đơn bào có ý nghĩa quan trọng. Các chủng không độc nhƣ Spirulina sp. đã đƣợc nuôi trên quy mô lớn để làm thực phẩm bổ sung cho ngƣời và làm thức ăn giàu protein cho gia súc.  Các chất chuyển hóa thứ cấp từ vi khuẩn lam là nguồn dƣợc liệu quan trọng cho việc phát triển thuốc và điều trị bệnh. 1.1.2. Phân loại vi khuẩn lam Phân loại sinh học là một phƣơng pháp theo đó các nhà sinh học lập nhóm và phân loại các loài sinh vật theo những nguyên tắc nhất định. Mỗi nhóm sinh vật có tên gọi riêng và đƣợc phân định dựa trên những đặc điểm xác định về hình thái, trình tự DNA,…Căn cứ vào mối quan hệ giữa các nhóm, ngƣời ta sắp xếp chúng theo thứ tự bằng hoặc phân cấp cao hơn trên cây phân loại. Dựa trên hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey, vi khuẩn lam đƣợc chia thành 5 bộ [41]:  Bộ Chroococcales: Dạng đơn bào, tế bào dạng đơn lẻ hoặc tập trung lại thành đám. Các tế bào phân chia theo 1; 2 hoặc 3 mặt phẳng đối xứng hoặc nảy chồi. Ví dụ các chi: Microcystis, Prochlorococcus, Prochloron, Synechoccus. 3 Luận văn cao học 2016  Bùi Thị Thùy Dung Bộ Pleurocapsales: Dạng đơn bào, tế bào dạng đơn lẻ hoặc tập trung lại thành đám. Ví dụ các chi: Chroococcidiopsos, Myxosarcina, Pleurocapsa.  Bộ Oscillatoriales: Dạng sợi đơn, không có tế bào dị hình. Ví dụ các chi: Oscillatoria, Spirulina, Lyngbya, Trichodesmium, Planktothrix.  Bộ Nostocales: Dạng sợi, không phân nhánh, có tế bào dị hình, có khả năng cố định nitơ. Ví dụ các chi: Nostoc, Calothrix, Nodularia.  Bộ Stigonematales: Dạng sợi, phân nhánh, có tế bào dị hình để cố định nitơ. Ví dụ các chi: Fischerella, Hapalosiphon, Westiellopsis. Sự phân loại vi khuẩn lam truyền thống thƣờng dựa trên hình thái của chúng. Tuy nhiên, chỉ dựa vào tiêu chí hình thái có thể không chính xác vì một số chủng vi khuẩn lam có sự thay đổi về hình thái khi đáp ứng với các điều kiện môi trƣờng khác nhau. Sử dụng các trình tự DNA 16S để làm thƣớc đo phân loại đang là hƣớng đi nhiều tiềm năng vì DNA không bị ảnh hƣởng bởi các điều kiện môi trƣờng. Sự kết hợp giữa phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp hiện đại giúp quá trình phân loại vi khuẩn lam chuẩn xác hơn. 1.2. Tiềm năng phát triển dƣợc phẩm điều trị ung thƣ từ vi khuẩn lam Trong số 974 hợp chất mới đƣợc giới thiệu làm thuốc trên thế giới những năm 1981-2006, 63% có nguồn gốc từ các sản phẩm thiên nhiên. Trong đó, 6% là các sản phẩm thiên nhiên, 33% là các dẫn xuất tổng hợp dựa trên các kiến thức thu đƣợc từ các sản phẩm tự nhiên và 24% là sản phẩm bắt chƣớc sản phẩm tự nhiên. Bên cạnh đó, đối với các dƣợc phẩm điều trị ung thƣ, 78% là sản phẩm tự nhiên hoặc có nguồn gốc từ các sản phẩm tự nhiên [29]. Đại đa số các sản phẩm tự nhiên bắt nguồn từ nấm, vi khuẩn và thực vật. Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu phát triển nguồn dƣợc phẩm từ hợp chất thiên nhiên theo hai hƣớng, đó là: phân tích sâu hơn các hợp chất có mặt trong nguồn tài nguyên cũ đã đƣợc biết đến và hƣớng tới nguồn tài nguyên mới dồi dào, phong phú hơn. Trong đó, vi khuẩn lam đang là đối tƣợng tiềm năng đƣợc chú ý theo hƣớng nghiên cứu thứ hai. 4 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung So sánh với các loại thuốc từ vi khuẩn nói chung, vi khuẩn lam nổi trội hơn hẳn nhờ có mặt những hợp chất tiềm năng kháng ung thƣ. Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra 6% đến 10% dịch chiết từ vi khuẩn lam đang đƣợc nuôi cấy có khả năng tiêu diệt tế bào ung thƣ ở ngƣời, 0,8% trong tổng số 2000 dịch chiết vi khuẩn lam có độc tính đối với các khối u rắn [27]. Theo báo cáo của Patterson, ông và cộng sự đã tiến hành sàng lọc trên quy mô lớn sử dụng 1000 chủng vi khuẩn lam từ các môi trƣờng sống khác nhau. Quá trình sàng lọc đã cho thấy khoảng 7% dịch chiết có khả năng ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung thƣ KB [31]. Các nghiên cứu của Gerwick và cộng sự tập trung vào việc sàng lọc các hợp chất kháng ung thƣ của các chủng vi khuẩn lam sống trong môi trƣờng nƣớc biển. Kết quả nghiên cứu cho thấy có tới 40% các chất từ vi khuẩn lam thu đƣợc có hoạt khả năng chống lại ung thƣ, ngăn ngừa khối u. Chúng cũng là nguồn giàu các hợp chất peptide và polyketide, các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh có thể là nguồn hợp chất tạo dƣợc phẩm kháng ung thƣ mới [16]. Một số lƣợng lớn các hợp chất đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam có hoạt tính ức chế sự trùng hợp tubulin đang là đối tƣợng đƣợc nghiên cứu để phát triển thuốc kháng ung thƣ. Đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Nostoc sp. ATCC 53789, Cryptophycin là một trong những ứng cử viên đƣợc phát hiện sớm và có tiềm năng cao cho loại dƣợc phẩm mới chống ung thƣ. Ở nhóm Cryptophycin có hơn 25 thành viên có hoạt động mạnh gây bất ổn tubulin, trong đó Crytophycin 1 có hoạt tính mạnh nhất [36]. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Cryptophycin 1 [36]. 5 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Curacin A đƣợc phân lập từ chủng vi khuẩn lam Lyngbya majuscule có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào và có độc tính mạnh với các tế bào ung thƣ đại tràng, thận và vú. Chúng hoạt động bằng cách liên kết với vị trí bám trên tubulin ngăn cản sự tổng hợp vi ống, từ đó ức chế sự phân chia và tăng sinh tế bào. Tuy nhiên Curacin A ít tan trong nƣớc vì vậy khi tiến hành thử nghiệm trên mô hình in vivo đã gặp nhiều khó khăn. Để khắc phục hiện tƣợng trên, các nhà khoa học đã tìm cách tổng hợp hợp chất có đặc tính sinh học tƣợng tự Curacin A với tính tan tốt hơn [15, 40]. Dolastatin 10 đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1987 bởi Pettit từ loại sinh vật biển Dolabella auricularia và đƣợc Luesch phân lập từ vi khuẩn lam Symploca sp. năm 2001. Dolastatin 10 ức chế ức tăng sinh tế bào trong các thử nghiệm in vivo ở các bệnh bạch cầu, u lympho [35]. Một thành viên khác trong nhóm Dolastatin là Dolastatin 15 còn đƣợc dùng trong thử nghiệm trên mô hình in vitro với hoạt tính sinh học tƣơng tự là ức chế tăng sinh tế bào và ức chế sự gia tăng kích thƣớc khối u động vật. Tuy nhiên, hợp chất này có hiệu suất tổng hợp rất thấp và khả năng tan trong nƣớc hạn chế. Chính điều này đã thôi thúc các nhà khoa học tổng hợp thành công các chất có hoạt tính sinh học tƣơng tự Dolastatin 15 với hiệu suất tổng hợp cao, tính tan ổn định, đó là: ILX-651 và LU3793. Các chất này đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng tại pha II. Nhìn chung, các hợp chất Dolastatin có cơ chế hoạt động ức chế quá trình lắp ráp vi ống khi bám vào tubulin. Ngoài ra, chúng còn tham gia vào quá trình apoptosis thông qua sự can thiệp vào protein Bcl-2 [35]. Hai chất có khả năng gây độc đến tế bào đƣợc nhiều nghiên cứu đề cập đến đó là: Borophycin và Apratoxin A. Borophycin là phức hợp của boron và polyketide đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Nostoc linckia và Nostoc spongiaeforme. Borophycin có khả năng kháng ung thƣ ở dòng tế bào ung thƣ biểu bì và ung thƣ đại trực tràng ở ngƣời [17]. 6 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Borophycin [17]. Apratoxin A là chất chuyển hóa thứ cấp đƣợc phân lập lần đầu tiên từ vi khuẩn lam Lyngbya majuscule. Apratoxin A có cấu trúc hỗn hợp peptide- polyketide dạng vòng, gồm một vòng thiazoline. Đây là chất có khả năng gây độc mạnh đối với tế bào ung thƣ bởi khả năng kích thích tế bào phân chia bị bắt giữ ở pha G1, gây ra quá trình apoptosis (chết theo chƣơng trình). Mặc dù chất này có khả năng gây độc ở 60 dòng tế bào khối u nhƣng các nhà nghiên cứu vẫn chƣa tìm ra cơ chế hoạt động của chúng [4]. Theo nghiên cứu của Martins và cộng sự khi cho tế bào HL-60 tiếp xúc với dịch chiết của các chủng vi khuẩn lam Synechocytis sp. và Synechococcus sp. đã có hiện tƣợng apoptosis xuất hiện ở tế bào thử nghiệm. Cụ thể, có sự biến đổi ở phần màng tế bào, tế bào bị co rút và bắt đầu xuất hiện hiện tƣợng phân mảnh nhân. Bên cạnh đó, một glycoside đƣợc phân lập từ Lyngbya sp. hay Anabaena sp. cũng tham gia vào quá trình thúc đẩy tế bào ung thƣ tham gia vào chu trình apoptosis với dấu hiệu ban đầu là ngƣng tụ chất nhiễm sắc và phân mảnh nhân. Các sản phẩm từ dịch chiết vi khuẩn lam (Bảng 1.1) còn gây ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của các dòng tế bào ung thƣ, đƣa chúng vào chu trình chết tế bào thông qua các hoạt động nhƣ: bắt giữ tế bào trong chu kì tế bào, làm rối loạn chức năng ty thể, lạp thể, gây ra các hoạt động oxi hóa, thay đổi caspase để ngăn chặn không cho chúng tham gia vào các quá trình cắt nối hay thay đổi họ protein Bcl-2 và thay đổi hoạt động của các kênh vận chuyển trên màng ty thể, đây đều là những con đƣờng trực tiếp dẫn tới apoptosis [7]. 7 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Bảng 1.1. Một số chất có khả năng kháng ung thƣ đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam [37]. STT Tên chất Từ vi khuẩn lam Dòng tế bào tác động 1 Ankaraholide A Geitlerinema sp. Các dòng tế bào ung thƣ: phổi H460, vú MDA-MB 435, đại trƣc tràng LoVo, vòm họng KB 2 Ung thƣ máu U2OS, cổ tử cung HeLa, phổi Lyngbya sordida H460, đại trực tràng Lyngbya bouilloni Belamide A Lyngbya majuscule Lyngbya sp. 3 Apratoxin A-G HCT116. Symploca sp. Ung thƣ đại trực tràng HCT116 4 Calothrixin A Calothrix sp. Ung thƣ cổ tử cung HeLa 5 Caylobolide A Lyngbya majuscula Ung thƣ đại trực tràng HCT116 6 Dolastatin 10 Symploca sp. Ung thƣ phổi các dòng: H69, H82, H446 và H510, ung thƣ máu lympho. 7 Cryptophycin 1 Nostoc sp. Ung thƣ vú ở ngƣời MDA-MB-435, ung thƣ phổi A549. 8 Curacin A Lyngbya majuscula Ung thƣ phổi A549 9 Symplostatin 1 Symploca hydnoides Ung thƣ vú ở ngƣời MDA-MB-435 8 Luận văn cao học 2016 10 Malevamide D Bùi Thị Thùy Dung Symploca hydnoides Ung thƣ phổi A549, HT29, ung thƣ da SKMEL-28. 1.3. Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam Hợp chất tự nhiên (hay hợp chất thiên nhiên) là các chất hóa học có nguồn từ tự nhiên hoặc đƣợc con ngƣời tách ra từ các loài động vật, thực vật có trong tự nhiên có thể có hoạt tính sinh học hoặc tác dụng dƣợc học dùng để làm thuốc [5]. Chúng là nguồn cung cấp các cấu trúc dẫn đƣờng để tổng hợp các chất tƣơng tự nhƣng đạt hiệu quả dƣợc lí và an toàn cao hơn, đƣợc xem là mốc khởi đầu trong quá trình tổng hợp và sản xuất thuốc. Vào năm 1891, Albrecht Kossel đề xuất chia các hợp chất tự nhiên thành hai nhóm chính, đó là: các hợp chất sơ cấp và các hợp chất thứ cấp [22]. Trong đó, các hợp chất thứ cấp không thực sự cần thiết cho sự sống của bản thân sinh vật nhƣng chúng gây tác động đến các sinh vật khác, làm tăng khả năng cạnh tranh của các sinh vật trong môi trƣờng sống. Do có khả năng điều chỉnh con đƣờng truyền và sinh hóa tín hiệu, một vài chất chuyển hóa thứ cấp có tính chất dƣợc liệu hữu ích. Các hợp chất sinh học của vi khuẩn lam cung cấp một nguồn dƣợc liệu mới, nhiều tiềm năng. Sự đa dạng và mới lạ của các chất tìm thấy trong vi khuẩn lam đƣợc so sánh với xạ khuẩn- nhóm vi khuẩn cung cấp nhiều dƣợc phẩm quan trọng [3, 34]. Các chất đƣợc tìm thấy trong vi khuẩn lam gồm nhiều nhóm chất khác nhau bao gồm: alkaloid, terpenoid, polyketide và peptide không phụ thuộc ribosome. Phần lớn các sản phẩm này đƣợc sản xuất thông qua con đƣờng sinh tổng hợp polyketide (PKS) và peptide không phụ thuộc vào ribosome (NRPS) hoặc phối hợp cả hai [24]. Các nhóm chất từ vi khuẩn lam thể hiện nhiều hoạt tính sinh học khác nhau: kháng khuẩn, kháng ung thƣ, kháng virus, ức chế miễn dịch, 9 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung ức chế hoạt động của proteinase, đây đều là những mục tiêu nghiên cứu quan trọng của sinh y học. 1.3.1. Nhóm các chất alkaloid Sự phân lập và định tính alkaloid đƣợc bắt đầu từ rất sớm, vào những năm 1960. Đây là nhóm các chất có độc tính cao, chỉ với liều vài milligram đã có thể gây tử vong cho ngƣời. Các alkaloid có tác dụng sinh học rất đa dạng, chủ yếu làm dƣợc phẩm nhƣ: các thuốc ức chế thần kinh trung ƣơng (morphin, scopolamine, Ltetrahydropalmatin), các thuốc điều trị bệnh tim (ajmalin), các thuốc điều trị bệnh cao huyết áp (reserpine, ajmalixin),…Mỗi alkaloid khác nhau có hoạt tính sinh học khác nhau, trong đó, vài chục alkaloid đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học và trong nông nghiệp [1]. Anatoxin-a là sản phẩm đƣợc phát hiện vào những năm đầu của thập niên 1960 và đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1972 bởi J. P. Devlin từ chủng vi khuẩn lam Anabeana flos aquae. Chúng đƣợc biết đến với cái tên “Yếu tố gây chết nhanh” (Very Fast Death Factor), bởi chúng có khả năng gây độc nhanh và mạnh lên hệ thần kinh làm co giật và tử vong do liệt hô hấp. Bằng cách liên kết với thụ thể nicotinic acetylcholine (nAchR) trên màng tế bào thần kinh, Anatoxin-a thay đổi hoạt động của các kênh vận chuyển ion qua màng làm cho các cation không thể đi qua màng, cuối cùng dẫn đến tắc nghẽn sự truyền tín hiệu xung thần kinh [10]. Cylindrospermopsin là một alkaloid tự nhiên mang độc tính đƣợc phân lập từ các loài vi khuẩn lam: Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans, Aphanizomenon ovalisporum, Anabaena bergii và Raphidiopsis curvata. Cấu trúc hóa học của chất này đƣợc phát hiện vào năm 1992, bao gồm một trycyclic guanidine liên kết với hydroxymethyluracil. Dựa trên cấu trúc nucleotide và khả năng phản ứng của guanine và nhóm sulphate của Cyclindrospermopsin, các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng, chất này có khả năng liên kết với DNA/RNA của đối tƣợng thí nghiệm. Cụ thể, có sự liên kết giữa chúng với DNA ở gan chuột trong 10 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung mô hình nghiên cứu in vivo, Cyclindrospermopsin gây ra sự phá vỡ DNA ở gan đồng thời làm tăng số lƣợng các nucleic nhỏ ở tế bào ung thƣ máu lympho dòng WIL2-NS [38]. 1.3.2. Nhóm các chất terpenoid Các terpenoid có vai trò và chức năng đa dạng trong các hoạt động sinh học. Chúng có thể là các hormones (gibberellins, abscisic acid), các sắc tố quang hợp (phytol, carotenoids), các chất dẫn truyền điện tử (ubiquinone, plastoquinon) hay các chất tham gia cấu trúc màng tế bào (phytosterol). Ngoài các chức năng về sinh lí, trao đổi chất và xây dựng cấu trúc, một số hợp chất terpenoid đặc biệt, chủ yếu thuộc gia đình terpenoid có mạch cacbon C10, C15, C20 còn tham gia vào quá trình “giao tiếp” và “phòng vệ” nhƣ: chất hấp dẫn côn trùng thụ phấn, hỗ trợ quá trình phát tán hạt giống, kháng sinh, tạo chất độc đối với động vật ăn cỏ. Ở vi khuẩn lam, terpenoid đƣợc tổng hợp bằng con đƣờng methylerythritolphosphate (MEP). Nghiên cứu của Kaneko và cộng sự cho thấy, các gen mã hóa cho mỗi enzyme tham gia vào con đƣờng sinh tổng hợp MEP đã đƣợc tìm thấy trong genome của Synechocystis sp. cũng nhƣ trong genome của nhiều loài vi khuẩn lam khác [30]. Đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Tolypothrix nodosa, Tolypodiol là một diterpenoid đã đƣợc nhận diện bằng NMR và phân tích khối phổ. Tolypodiol thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh ở tai chuột với ED50 bằng 30µg/tai [32]. 1.3.3. Nhóm các chất polyketide. Là nhóm các sản phẩm thứ cấp có sự đa dạng về cấu trúc và chức năng đƣợc phân lập từ nguồn sinh vật khác nhau: vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng. Các sản phẩm phân lập có đặc tính dƣợc lí quan trọng nhƣ: kháng khuẩn, kháng nấm, chống kí sinh trùng, chống khối u với phổ hoạt động rộng, có tác dụng trên nhiều đối tƣợng Ở vi khuẩn lam, polyketide đƣợc tổng hợp bởi chuỗi các phản ứng liên tục đƣợc xúc tác bởi các enzyme polyketide synthenase (PKS)- đây là nhóm lớn các 11