Tài liệu Nghiên cứu tạo cơ chất peptide đặc hiệu cho protease của hiv 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trầ n Thi Thu Huyề n ̣ NGHIÊN CỨU TẠO CƠ CHẤT PEPTIDE ĐẶC HIỆU CHO PROTEASE CỦA HIV-1 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trầ n Thi Thu Huyề n ̣ NGHIÊN CỨU TẠO CƠ CHẤT PEPTIDE ĐẶC HIỆU CHO PROTEASE CỦA HIV-1 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Thị Hồng Loan GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên , tôi xin đƣợc bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đối với GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa và TS . Nguyễn Thị Hồng Loan đã tận tình hƣớng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhấ t cho tôi trong suốt quá trình học tập , nghiên cứu và thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhấ t đến các thầy giáo , cô giáo của Khoa Sinh học cũng nhƣ các thầy , cô thuộc Bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức nền tảng bổ ích. Lời cảm ơn tiếp theo tôi xin gửi tới các cán bộ, học viên sau đại học và sinh viên Phòng Protein tái tổ hợp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã chia sẻ và tạo những điều kiện tốt nhất để tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đinh và ba ̣n bè đã luôn dành tình cảm ̀ , động viên và khích lệ tôi trong suố t quá trình ho ̣c tâ ̣p và hoàn thành luâ ̣n văn . Luận văn đƣợc thực hiện trong phạm vi nội dung và kinh phí của đề tài KLEPT-14-03. Hà Nội, 15 tháng 12 năm 2016 Học viên, Trầ n Thi Thu Huyề n ̣ MỤC LỤC Trang ̀ ̉ MƠ ĐÂU ............................................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 2 ́ 1.1. GIƠI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦ A HIV-1 ................................ 3 1.1.1. HIV-1 nguyên nhân của bệnh AIDS .................................................................. 3 1.1.2. Cấ u trúc và chƣ́c năng của protease HIV-1 ....................................................... 3 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA PROTEASE HIV ................. 7 -1 1.2.1. Phƣơng pháp quang phổ kế ................................................................................ 7 1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp pha đảo .......................................................... 9 1.2.3. Phƣơng pháp miễn dich ELISA ....................................................................... 10 ̣ 1.2.4. Phƣơng pháp xác đinh hoa ̣t đô ̣ của protease không đánh dấ u theo thời gian ̣ (real time label free) bằ ng phân tich nanopore ........................................................... 10 ́ 1.3. ĐẶC TÍNH CƠ CHẤT PEPTIDE CỦA PROTEASE HIV-1 ................................. 11 1.3.1. Trình tự amino acid trong cơ chất của protease HIV-1.................................... 11 1.3.2. Các nghiên cứu về cơ chất đă ̣c hiê ̣u của protease HIV-1................................. 15 1.4. CÁC CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE HIV -1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ HIV/AIDS .................................................................................................................. 18 1.4.1. Các chấ t ƣ́c chế protease HIV-1....................................................................... 18 1.4.2. Ứng dụng chất ức chế protease HIV-1 trong điề u tri ̣HIV/AIDS .................... 20 ́ ́ Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHAP NGHIÊN CƢU ................................... 23 2.1. NGUYÊN LIỆU ....................................................................................................... 23 2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ........................................................................ 23 ́ ́ 2.3. PHƢƠNG PHAP NGHIÊN CƢU ............................................................................ 23 2.3.1. Xác định hoạt độ của protease HIV -1 sƣ̉ du ̣ng cơ chấ t peptide cải biế n trên máy quang phổ khả kiến ............................................................................................. 23 2.3.2. Xác định hoạt độ của protease HIV -1 bằ ng cơ chấ t huỳnh quang trên máy quang phổ kế huỳnh quang ......................................................................................... 25 2.3.3. Xác định các hằng số động học của protease HIV-1 ........................................ 26 ̉ Chƣơng 3. KẾT QUA VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 28 ́ 3.1. THIẾT KẾ TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA CƠ CHẤT PEPTIDE CHO XAC ĐINH HOA ̣T TÍNH PROTEASE HIV-1 ................................................................... 28 ̣ 3.1.1. Trình tự amino acid của cơ chất protease HIV-1 ............................................. 28 3.1.2. Xác định một số đặc tính của cơ chất Peptide CH ............................................. 29 3.1.3. So sánh ái lƣ̣c của protease với Peptide CH và mô ̣t số cơ chấ t khác ............... 34 ́ ̉ ̉ ́ 3.2. THƢ NGHIỆM DÙ NG CƠ CHÂT PEPTIDE THIẾT KẾ TRONG PHAN ƢNG SÀNG LỌC CHẤT ỨC CHẾ CỦA PROTEASE HIV-1 ........................................... 37 3.2.1. Sàng lọc chất ức chế tiềm năng của protease HIV-1 ........................................ 37 3.2.2. Khả năng ức chế protease HIV-1 của acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanost4(28),7,24-trien-3,26-dioic ......................................................................................... 41 3.2.3. Xác đinh kiểu ức chế protease HIV -1 của acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanosta4(28),7,24-triene-3,26-dioic ....................................................................................... 42 KẾT LUẬN .......................................................................................................................... 45 KIẾN NGHI ......................................................................................................................... 46 ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 47 BẢNG VIẾT TẮT AIDS BSA Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome) Liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus (Antiretroviral Drug Therapy) Albunin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin) DABCYL 4-(4-Dimethylaminophenylazo) Benzoic Acid DMSO Dimethyl sulphoxide DTT Dithiothreitol EDANS 5-[(2-Aminoethyl) amino] naphthalene-1-sulfonic acid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid ELISA Kỹ thuật phân tích hấp thụ miễn dịch gắn enzyme (Enzyme-linked immunosorbant assay) Chuyển năng lƣợng cộng hƣởng huỳnh quang (Fluorescence resonance energy transfer) Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human Immunodeficiency Virus) ART FRET HIV HPLC MES Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid Chromatography) 2-(N-morpholino) ethanesulphonic acid MOPS 3-(N-orpholino) propanesulphonic acid Nle Norleucine Nph Nitrophenylalanine PI Chất ức chế protease (Protease Inhibitor) TCA Trichloroacetic acid CH Chromogenic HF Hilyte fluor IC50 Nồng độ chất ức chế tại đó 50% hoạt tính của enzyme bị ƣ́c chế DANH MỤC HÌ NH Hình 1: Mô hình cấu trúc không gian của protease HIV-1 ......................................... 5 Hình 2: Cấu trúc kẹp trong trung tâm hoạt động của protease HIV-1 ........................ 5 Hình 3: Các vị trí cắt của protease HIV-1 trên polyprotein gag, gag-pol ................... 7 Hình 4: Công thƣ́c cấ u ta ̣o của norleucine (A) và nitrophenylalanine (B) ................... 8 Hình 5: Nguyên tắc xác định hoạt độ của protease HIV-1 sử dụng cơ chất huỳnh quang Peptide HF ...................................................................................................... 25 Hình 6: Ảnh hƣởng nồ ng đô ̣ protease HIV -1 đến tốc độ phản ứng sử dụng cơ chất Peptide CH ................................................................................................................ 30 Hình 7: Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất Peptide CH đến phản ƣ́ng thủy phân bởi protease HIV-1 .......................................................................................................... 31 Hình 8: Ảnh hƣởng của đệm 1 và 2 tới phản ƣ́ng phân cắ t Peptide CH ................... 33 Hình 9: Ảnh hƣởng của pH tới tốc độ phân cắt Peptide CH bởi protease HIV-1..... 34 Hình 10: So sánh tố c đô ̣ thủy phân cơ chấ t Peptide CH (A), L6525 (B) và Peptide HF (C) bởi protease HIV ...................................................................................................... 36 -1 Hình 11: Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của 20 hơ ̣p chấ t thƣ̣c vâ ̣t thƣ́ sinh ......... 41 Hình 12: Khả năng ứ c chế protease HIV -1 của acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanosta4(28),7,24-triene-3,26-dioic (A), acid maslinic (B), acid ursolic (C) ....................... 42 Hình 13: Tố c đô ̣ phản ƣ́ng thủy phân cơ chấ t bởi protease HIV -1 khi có mă ̣t acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanosta-4(28),7,24-triene-3,26-dioic ở các nồ ng đô ̣ khác nhau .. ................................................................................................................................... 43 ̉ DANH MỤC BANG Bảng 1: Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và gag-pol ...... 12 Bảng 2: Tầ n số xuấ t hiê ̣n của các amino acid (P4-P4’) của 11 cơ chấ t hi ệu quả của protease HIV-1.................................................................................................................... 14 Bảng 3: Thành phần của phản ứng đo hoạt đô ̣ protease HIV -1 sƣ̉ du ̣ng cơ chấ t Peptide đặc hiệu cải biế n ........................................................................................... 24 Bảng 4: Thành phần của phản ứng đo hoạt đô ̣ protease HIV -1 sƣ̉ du ̣ng cơ chấ t đặc hiệu huỳnh quang Peptide HF ................................................................................... 26 Bảng 5: Các hằ ng số đô ̣ng ho ̣c của protease HIV -1 đố i với cơ chấ t Peptide CH (A), Cơ chấ t L6525 (B) và cơ chất HF (C) ....................................................................... 36 ̉ MƠ ĐẦU Virus type 1 gây suy giảm viễn dich ở ngƣời (HIV-1) là tác nhân chính gây ̣ nên hô ̣i chƣ́ng suy giảm miễn dich mắ c phải ̣ (AIDS) ở ngƣời . Trong chu trình tái bản của HIV-1, protease có vai trò quan tro ̣ng phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho quá trình trƣởng thành của virus [19]. Vì vậy , protease của HIV -1 (protease HIV-1) đƣợc xem nhƣ một trong các đích quan trọng nhất cho liệu pháp dùng thuốc ức chế protease (PI) chống HIV-1 [18]. Cho đế n hiê ̣n nay , phƣơng thƣ́c điề u tri ̣phổ biế n cho ngƣời nhiễm HIV-1 là sử dụng liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART). Tuy nhiên, kháng thuốc và tác dụng phụ vẫn đang là vấn đề lớn đối với các thuốc PI nói riêng và các thuốc điều trị HIV nói chung. Vì vậy, các nghiên cứu điều tra, phát triển chất ức chế mới của HIV vẫn đang đƣợc tiến hành [72] và các phƣơng pháp phù hợp cho xác định hoạt độ của protease là cần thiế t . Khác với các protease khác , protease HIV -1 có tính đă ̣c hiê ̣u cao trong nhận biết và phân cắt các cơ chất , enzyme chỉ thủy phân các cơ chấ t c ó liên kết đặc hiệu tƣơng tự nhƣ các vị trí cắt của nó trong cấu trúc của protein gag và gag -pol trong HIV-1. Vì vậy, phần lớn cơ chất của protease HIV -1 là các chuỗi peptide gồm tƣ̀ 7 amino acid P4-P3’có trình tự giống với một trong các vị trí cắt đặc hiệu của protease HIV-1 trên các chuỗi polyprotein này [29]. Mặt khác, các nghiên cứu cũng cho thấy kích thƣớc, trình tự và đặc tính của các amino acid đều ảnh hƣởng đến cấu hình của cơ chất với trung tâm hoạt động của protease HIV-1, qua đó ảnh hƣởng đến ái lực của cơ chất với enzyme [66]. Hiện nay, có nhiều loại cơ chất huỳnh quang hoặc cơ chấ t cải biế n tại vi ̣trí phân cắ t khác nhau cho xác định hoat độ của protease HIV-1 đã đƣợc thƣơng mại hóa. Tuy nhiên, trình tự amino acid của các cơ chất này thƣờng không đƣợc công bố . Ngoài ra, giá thành của các cơ chất này khá cao và cần có trang thiế t bi máy móc phù hơ ̣p . ̣ 1 Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên , chúng tôi tiế n hành nghiên cƣ́u thiết kế cơ chất đặc hiệu có ái lực cao với protease HIV-1 sử dụng trong phân tích hoạt độ của enzyme, đồ ng thời sàng lo ̣c và phát hiê ̣n mô ̣t số chấ t ƣ́c chế protease HIV -1, góp phầ n tạo cơ sở cho các nghiên cứu phát triển các thuốc ức chế protease HIV-1 trong nƣớc. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ́ 1.1. GIƠI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦ A HIV-1 1.1.1. HIV-1 nguyên nhân của bệnh AIDS Năm 1983, virus HIV với tên go ̣i ban đầ u là virus liên quan tới viêm ha ̣ch (LAV) lần đầu tiên đƣơ ̣c phân lâ ̣p thành công bởi Montagnier và tập thể ở viện Pasteur. Virus này đƣợc Uỷ ban Quốc tế thống nhất gọi tên là HIV (type 1) vào năm 1986 [27]. Cùng thời điểm này, ngƣời ta đã phân lập đƣợc HIV- type 2 ở Tây Phi, đây là virus gốc của HIV-type 1. HIV-type 2 tƣơng tự nhƣ HIV-type 1 về cách thức truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh cơ hội và phƣơng pháp điều trị nhƣng ít phát sinh bệnh hơn type 1. Vì vậy, HIV-type 1 (HIV-1) đƣợc xem là nguyên nhân chính gây bệnh AIDS. HIV thuộc họ Retroviridae, là họ có các virus gây ung thƣ cho ngƣời và động vật. HIV-1 có 4 nhóm chính là M (main), O (outlier), hai nhóm mới N (non-M/non O) và P, có tới 90% sự lây nhiễm HIV-1 thuộc nhóm M; nhóm này có 9 phân nhóm đƣợc ký hiệu bằng các chữ cái A-D, F-H, J, K và các dạng tái tổ hợp khác đƣợc gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant forms). Chính sự đa dạng hay biến đổi với nhiều phân type khác nhau nhƣ vậy đã làm cho HIV chống lại đƣợc các phƣơng thức bảo vệ của hệ miễn dịch vật chủ và do đó, việc chữa HIV/AIDS bằng thuốc hay can thiệp bằng vaccine đều gặp nhiều khó khăn. 1.1.2. Cấ u trúc và chƣc năng của protease HIV-1 ́ Về cấu trúc , protease của HIV -1 (protease HIV-1) đƣợc mã hóa bởi hệ gen của HIV-1 và là một protease aspartyl (có chứa gốc Asp trong trung tâm hoạt động), họ retropepsin A2, đƣợc tạo ra khi HIV nhiễm vào tế bào chủ, có chức năng quan trọng trong chu trình sống của HIV-1 [66]. Năm 1989, cấu trúc tinh thể của protease HIV -1 đã đƣơ ̣c mô tả bởi Navia và tập thể [43] từ phòng thí nghiệm của Merck. Trong cùng năm đó, một cấu trúc chính xác hơn đã đƣợc báo cáo [8]. Đến năm 2010, với sự đóng góp đáng kể của phƣơng pháp nhiễu xạ tia X, hơn 400 cấu trúc của protease HIV-1 (kiểu dại và dạng đột biến) trong phức hệ với các chất ức chế khác nhau đã đƣợc làm sáng tỏ. Những dẫn liệu này giúp các nhà nghiên cứu có đƣợc hiểu biết sâu sắc về các kiểu liên kết của enzyme với chất ức chế và cơ sở phân tử của kháng thuốc. 3 Protease HIV-1 là một homodimer , mỗi monomer có KLPT 11 kDa gồm 99 amino acid, đƣợc sắp xếp gần nhƣ theo kiểu đối xứng . Mỗi monomer đề u chƣ́a các phiến gấp nếp β với một đoạn xoắn α ngắn gần đầu C [66]. Cấu tạo của protease HIV-1 có thể chia thành ba vùng (domain) chính: vùng dimer hóa, vùng lõi và vùng mũ (Hình 1). Vùng dimer hóa bao gồm 4 phần cuối của phiến β (các gốc amino acid 1-4 và 95-99 của mỗi monomer), vòng quay quanh amino acid 4-9 và chuỗi xoắn (amino acid 86-94 của mỗi monomer). Vùng này có vai trò thiết yếu trong hình thành cấu trúc dimer và ổn định hoạt tính protease HIV1. Cấu trúc dimer sẽ đƣợc hình thành nhờ tƣơng tác không tích điện giữa 4 sợi của phiến β từ các gốc amino acid 1-4 (vùng N đầu cùng), 96-99 (vùng C tận cùng) và các gốc amino acid trong trung tâm hoạt động 24-29. Tƣơng tác giữa các gốc Ile50 và Gly51’; Asp29, Arg87 và Arg88’ cũng ảnh hƣởng đến sự ổn định của cấu trúc dimer. Khi enzyme gắn thêm chất ức chế hoặc cơ chất, sự ổn định của cấu trúc dimer đƣợc tăng cƣờng. Vùng lõi gồm 4 đầu N sợi β (các gố c amino acid 10-32 và 63-85 của mỗi monomer) có vai trò quan trọng trong sự ổn định cấu trúc dimer và hoạt tính xúc tác của enzyme. Bộ ba xúc tác Asp25-Thr26-Gly27 có tính bảo thủ trên mỗi monomer cũng nằm trong cấu trúc của vùng lõi . Vùng mũ bao gồm các amino acid từ 33-43 và 44-63 bao quanh trung tâm hoạt động . Đầu tâ ̣n N của vùng này giàu Gly tạo nên tính mềm dẻo của vùng cần thiết cho việc gắn cơ chất, giải phóng sản phẩm có vai trò quan trọng đối với hoạt tính của enzyme. Nếu đột biến xuất hiện ở vị trí mũ có thể làm giảm mạnh hoạt tính của enzyme [66, 75]. Trung tâm hoạt động của enzyme nằm trong vùng lõi và bao gồm ba gố c amino acid có tính chất bảo thủ: Asp25-Thr26-Gly27 nằm tại mặt phân giới của dimer, đƣợc làm ổn định nhờ mạng lƣới các liên kết hydro khá vững chắc tạo nên sự ổn định của trung tâm hoạt động cũng nhƣ dimer. Mỗi monomer đều có một bộ ba Asp-Thr-Gly với vị trí amino acid tƣơng ứng nhƣ sau: 25 (25’)-26 (26’)-27 (27’) và phân tử Asp cần thiết cho cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease HIV -1 (Hình 2). Vai trò quan trọng của Asp25 đƣợc làm rõ khi thay thế Asp bằng các amino acid khác dẫn đến enzyme bị bất hoạt [21]. 4 A B A B Hình 1: Mô hình cấu trúc không gian của protease HIV-1 A. Cấu trúc không gian của protease HIV-1 B. Cấu trúc không gian của protease HIV-1 khi có chất ức chế [48] Hình 2: Cấu trúc kẹp trong trung tâm hoạt động của protease HIV-1 [66] Bên cạnh đó, bộ ba Gly86-Arg87-Asn88 của protease HIV-1 cũng là một vùng bảo thủ cao khác đóng vai trò trong việc hình thành cấu trúc dimer. Các vị trí liên kết cơ chất gồm S3 đến S4’ chủ yếu hình thành bởi các amino acid 8, 23-30, 32, 45-50, 53, 56, 76, 80-82 và 84. Các vị trí 1-3, 5-9, 23-27, 29, 47-52, 54, 67, 81, 87 và 90-99 góp phần liên hệ giữa bề mặt dimer. Nếu có đột biến ở vị trí hoạt động hoặc ngăn chặn sự hình thành cấu trúc dimer của các đơn phân protease HIV-1 sẽ làm mất hoạt tính xúc tác của protease và do đó ngăn chặn hoạt động của virus [66, 75]. 5 Về chức năng, protease HIV-1 có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của HIV. Sau khi đƣợc giải phóng khỏi màng tế bào vật chủ, HIV-1 tồn tại nhƣ một hạt virus không có khả năng lây nhiễm đƣợc gọi là virion. Để trở thành một hạt virus hoàn chỉnh, virion phải trải qua quá trình sắp xếp lại cấu trúc một cách mạnh mẽ. Sự chuyển đổi trạng thái này là nhờ khả năng phân cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) của protease để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho sự hình thành virus hoàn chỉnh (Hình 3). Cụ thể, protease HIV-1 phân cắt các polyprotein tiền thân: gag (gagPr55) thành các protein cấu trúc: matrix p17 (MA), capsid p24 (CA), nucleocapsid p7 (NC) có vai trò trong quá trình lắp ráp và xác định hình thái của lớp vỏ virus trƣởng thành cùng với 3 protein nhỏ (p6, p2 và p1) chƣa rõ chức năng; thủy phân polypeptide gag-pol để tạo thành 3 enzyme: protease, reverse transcriptase và integrase cần thiết cho quá trình sao chép của HIV [8, 19]. Các thí nghiệm in vitro với protease HIV-1 tinh sạch cũng khẳng định enzyme có khả năng cắt polypeptide gag tiền thân. Mặc dù, các tế bào ở động vật có vú cũng có protease aspartyl nhƣng chúng không có khả năng cắt các polyprotein gag, gag-pol. Cơ chất đặc hiệu của protease HIV-1 là gag, gag-pol và không phải là đích tác động của các protease ở động vật có vú. Ngƣợc lại, protease HIV-1 không những cắt các polyprotein của chính nó mà còn thủy phân rất nhiều protein của vật chủ nhƣ actin, Bcl2 (B-cell lymphoma 2protein điều hòa apoptosis), procaspase 8. Việc xác định cơ chất đặc hiệu của protease HIV-1 cho phép đo hoạt độ của enzyme [53]. Khi ức chế hoạt tính của protease HIV-1 hoặc gây đột biến trên gen mã hóa protease HIV-1, virus không thể đóng gói để tạo thành thể virion hoàn chỉnh; vì vậy, chúng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [19]. Ngoài quá trình lây nhiễm, protease HIV-1 còn đóng vai trò trong quá trình phát sinh bệnh. Khi vào tế bào ngƣời, protease gây độc và cắt nhiều protein của vật chủ. Cụ thể, protease HIV-1 cắt procaspase 8 không hoạt hóa thành caspase 8 hoạt hóa dẫn đến cắt Bid thành tBid làm rối loạn quá trình thủy phân, tạo ra những rối 6 loạn trong ty thể và kích thích khả năng thấm qua màng ty thể phụ thuộc Bax/Bak. Kết quả làm ty thể giải phóng cytochrome c và phân mảnh nhân. Hiện tƣợng này chỉ phát hiện thấy ở các tế bào lympho T CD4 và dẫn đến chết theo chƣơng trình (apoptosis) phụ thuộc vào kích thích của caspase 8. Các nghiên cứu cũng khẳng định rằng sử dụng các chất ức chế protease có thể ngăn chặn hiện tƣợng chết theo chƣơng trình do protease HIV-1 gây nên [53]. Hình 3: Các vị trí cắt của protease HIV-1 trên polyprotein gag, gag-pol [8] 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA PROTEASE HIV -1 Protease HIV-1 không phân cắt các protein thông thƣờng nên việc xác định hoạt độ của enzyme phải dựa trên các cơ chất tổ ng hơ ̣p đặc hiệu đƣơ ̣c thiế t kế với trình tự cắt giố ng trinh tƣ̣ trên protein gag và gag ̀ -pol. Phƣơng pháp đo hoa ̣t đô ̣ protease HIV -1 tùy thuộ c vào đă ̣c trƣng của cơ chấ t sƣ̉ du ̣ng . Dƣới đây là một số phƣơng pháp xác định hoạt độ của protease HIV-1. 1.2.1. Phƣơng pháp quang phổ kế Đây là phƣơng pháp phân tích liên tục , sử dụng cơ chất peptide không hoặc có gắn cặp huỳnh quang có mang t rình tự cắt đặc hiệu của protease HIV -1. Đối với cơ chất không gắ n thêm că ̣p huỳnh quang , liên kết tại P 1-P1' thƣờng đƣợc cải biến để có khả năng hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng nhất định trong vùng tử ngoại 7 . Dƣới tác dụng của protease, liên kết bị phân cắt và làm cho độ hấp thụ ánh sáng giảm dần tại bƣớc sóng đó theo thời gian. Dựa trên nguyên tắc này, Richards và tập thể [60] đã tổng hợp 11 peptide bắt chƣớc trình tự 7 amino acid tƣơng ứng với vị trí phân cắt giữa p17 và p24 trên polyprotein gag để làm cơ chất cho phân tích hoạt độ protease HIV-1. 11 cơ chất này có gốc P 1 là norleucine (Nle- có công thức phân tử giống Leu nhƣng không phân nhánh ) (Hình 4A); Met, Phe, Ala hoặc Tyr ở gốc P1’ đƣợc thay thế bằng nitrophenylalanine (Nph) (Hình 4B) [66]. Liên kết cải biến P1-P1’ hấp thụ cực đại trong dải bƣớc sóng 284 – 324 nm, khi bị phân cắt sẽ mất khả năng hấp thụ ánh sáng, do đó độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng sẽ giảm dần theo thời gian. Phƣơng pháp đƣợc thực hiện nhanh, sử dụng máy quang phổ thông thƣờng, không tốn nhiều thời gian, liên tục và cho số liệu chính xác. B A Hình 4: Công thƣc cấ u ta ̣o của norleucine (A) và nitrophenylalanine (B) ́ Phƣơng pháp quang phổ huỳnh quang sử dụng cho các cơ chất peptide có gắn cặp chất phát và thu tín hiệu huỳnh quang . Trong đó , vùng bƣớc sóng phát huỳnh quang của chất huỳnh quang phải trùng khớp với bƣớc sóng kích thích của chất thu tín hiệu, qua đó đảm bảo sự phát huỳnh quang đƣợc dập tắt thông qua truyền năng lƣợng cộng hƣởng huỳnh quang (Fluorescent resonance energy transfer-FRET). Vị trí các chất phát và thu tín hiệu huỳnh quang trên chuỗi peptide phải nằm cách nhau một khoảng nhất định, thƣờng 10-100 Å. Mức độ phát huỳnh quang tùy thuộc vào khả năng phân giải cơ chấ t của enzyme . Phƣơng pháp này tiến hành nhanh, dễ thao tác và có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn khi sử dụng quang phổ thông thƣờng. Tuy nhiên, yêu cầu bắt buộc là phòng thí nghiệm phải có máy quang 8 phổ kế huỳnh quang với ánh sáng kích thích và thu tín hiê ̣u huỳnh quang phù hợp . Dựa trên nguyên tắc này, nhiều cơ chất huỳnh quang của protease HIV-1 với trình tự amino acid và cặp huỳnh quang khác nhau đã đƣợc phát triển [68]. Ngoài ra, hoạt độ của protease HIV -1 còn có thể đƣợc xác định trên nguyên tắ c truyề n năng lƣơ ̣ng cô ̣ng hƣởng phát quang sinh ho ̣c thế hê ̣ thƣ́ 2 (BRET2- Bioluminescence resonance energy transfer second generation ) xảy ra giữa một đầu phát là hRLc và một đầu thu là phân tử hGFP 2. Că ̣p truyề n năng lƣơ ̣ng cô ̣ng hƣởng này bắt đầu bằng việc bổ sung Deep Blue C Coelenterazine là chất bị oxi hóa bởi hRLuc, kế t quả dẫn đế n phát ra ánh sáng ở bƣớc sóng 395 nm kích thích hGFP 2 làm phát ra ánh sáng ở bƣớc sóng 510 nm. Sƣ̣ phát quang đƣơ ̣c đinh lƣơ ̣ng bởi trinh ̣ ̀ tƣ̣ đo ̣c sƣ̉ du ̣ng luminometer kế t hơ ̣p với đia đo ̣c huỳnh quang và khố i phổ phát ̃ quang đủ khác biê ̣t để phân tich chuyể n tiế p tỷ lê ̣ đầ u ra và đầ ́ u vào của tin hiê ̣u ́ hGFP2 và hRLuc nhằm đánh giá tƣơng tác phân tử giữa hGFP 2 và hRLuc . Nế u hRLuc và hGFP 2 có khoảng cách ngoài khoảng 10-100Å năng lƣơ ̣ng không đƣơ ̣c bƣ́c xa ̣ tƣ̀ hRLuc tới hGFP 2. BRET là công nghê ̣ cao và có thể đo đƣơ ̣c trong tế bào, hiê ̣n đang đƣơ ̣c phát triể n và có thể đƣợc sử dụng thay thế các phƣơng pháp trong ố ng nghiê ̣m [32]. 1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp pha đảo Định lƣợng sản phẩm phân cắt từ cơ chất peptide đă ̣c hiê ̣u : Trong phƣơng pháp này, cơ chấ t là các peptide đƣơ ̣c tổ ng hơ ̣p bằ ng hóa ho ̣c dƣ̣a trên trinh tƣ̣ cắ t đă ̣c ̀ hiê ̣u trên gag và gag -pol của protease HIV-1. Protease HIV-1 đƣơ ̣c bổ sung vào hỗn hơ ̣p cùng đê ̣m và cơ chấ t , phản ứng đƣợc tiến hành ở 37ºC, sau thời gian nhấ t đinh ̣ đƣơ ̣c làm ngừng bằng TCA 0,05%. Sản phẩm cắt đƣợc phân tích bằng HPLC pha đảo trên cột Nova-Pak C18 3,9 × 150 mm, rửa chiết với nồng độ tăng dần của acetonitrile từ 0-100% trong nƣớc. Phƣơng pháp có độ nhạy cao nhƣng nhƣợc điểm là: tiêu tốn nhiều thời gian, không thích hợp làm nhiều mẫu và không liên tục. Những hạn chế này của HPLC đã dần đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC (Ultra performance liquid chromatography) đƣợc cải tiến từ 9 HPLC để tăng độ phân giải, độ nhạy và số lƣợng. So với HPLC, UPLC có quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản, thời gian phân tích ngắn và có tính chọn lọc cao cho phép đánh giá đồng thời nhiều chất ức chế. Phƣơng pháp này có thể hữu ích trong việc xác định nồng độ của các chất ức chế protease trong huyết tƣơng để theo dõi, điều trị thuốc và trong các nghiên cứu lâm sàng [50]. 1.2.3. Phƣơng pháp miễn dich ELISA ̣ Trong phƣơng pháp miễn dich ELISA , cơ chấ t thƣờng là các phân tƣ̉ protein ̣ dung hơ ̣p với gag trong cấ u trúc HIV -1, ví dụ nhƣ protein dung hơ ̣p gp 41-p24 chƣ́a vị trí cắt đặc hiệu p 17/p24 [49]. Cơ chất đƣợc ủ với protease HIV -1 trong vòng từ 30 phút đến 3 giờ ở 37ºC. Sản phẩm cắt sau đó đƣợc phát hiện bằng kháng thể đơn dòng kháng p24 và kháng thể thứ hai gắn với peroxidase củ cải ngƣ̣a (Horseradish peroxidase). Kết quả đƣợc xác định thông qua tín hiệu giảm dần của hỗn hợp phản ứng ở bƣớc sóng 492 nm theo thời gian. Kỹ thuật này khá nhạy và đơn giản, rất thích hợp cho các thí nghiệm sàng lọc số lƣợng lớn các chất ức chế protease HIV-1. Tuy nhiên, phƣơng pháp này lại tiêu tốn khá nhiều thời gian . 1.2.4. Phƣơng pháp xác đinh hoa ̣t đô ̣ của protease không đánh dấ u theo thời ̣ gian (real time label free) bằ ng phân tích nanopore Theo Wang và tâ ̣p thể hoa ̣t đô ̣ của prote ase HIV-1 đƣơ ̣c xác đinh bằ ng cách ̣ theo dõi thời gian thƣ̣c biế n thiên của dòng ion phát sinh tƣ̀ tƣơng tác giƣ̃a cơ chấ t protease. Khi không có mă ̣t protease , cơ chấ t peptide chỉ ta ̣o ra mô ̣t loa ̣i dòng điê ̣n điề u biế n trong lỗ nanopore . Khi có protease , cơ chấ t bi ̣cắ t thành hai đoa ̣n peptide ngắ n, tạo ra hai loại dòng điều biến mới có biên độ và thời gian cƣ trú ngắn hơn so với cơ chấ t . Hơn nƣ̃a với nồ ng đô ̣ cơ chấ t và thời gian ghi là ổ n đinh , tầ n số biế n cố ̣ của sản phẩm cắt cơ chất đƣợc tạo ra hoặc cơ chất còn lại phụ thuộc vào hoạt tính của protease HIV -1. Các yếu tố cảm biến đƣợc sử dụng là một protein αHL đô ̣t biế n, (M113F)7 và cơ chất peptide FFSQNYPIVQ có trình tự gi ống với trình tự cắt MC/CA trên gag nhƣng đƣơ ̣c bổ sung thêm 2 amino acid Phe nhằ m ta ̣o ra các đoa ̣n peptide có chiề u dài khác nhau , hoạt độ của enzyme trong lỗ nanopore cảm ứng 10 đƣơ ̣c đo dƣ̣a vào tín hiê ̣u tăng lên của sản phẩ m cơ ch ất bị phân hủy [73]. Phản ứng thủy phân của enzyme đƣợc thực hiện trong hiệu điện thế -40 mV trong dung dich ̣ điê ̣n phân gồ m NaH2PO4 10 mM, pH 4,7, NaCl 1M và EDTA 1 mM. Phƣơng pháp này có mô ̣t số ƣu điể m nhƣ : tiế t kiê ̣m thời gian so vớ i ELISA, hay có đô ̣ nha ̣y hơn cơ chấ t huỳnh quang hoă ̣c gắ n chấ t phóng xa ̣ do có khả năng phát hiện đƣợc nồng độ protease HIV -1 ở picomolar trong thời gian 10 phút, có khả năng phân biê ̣t dƣơng tính giả do các lỗ nanopore không cho c ác protease có kích thƣớc lớn đi qua. Phƣơng pháp cũng có giá tri ̣lâm sàng đố i với chẩ n đoán , tiên đoán bê ̣nh và có tiề m năng đố i với dƣơ ̣c phẩ m mớ. i 1.3. ĐẶC TÍNH CƠ CHẤT PEPTIDE CỦA PROTEASE HIV-1 1.3.1. Trình tự amino acid trong cơ chất của protease HIV-1 Protease HIV-1 có tính đặc hiệu cao nên không thể dùng các cơ chấ t protein thông thƣờng cho viê ̣c xác đinh hoa ̣t đô ̣ của enzyme ̣ . Nhiều cơ chất peptide của protease HIV-1 đã đƣơ ̣c thiế t kế cho mu ̣c đích phân tích hoa ̣t đô ̣ củ a protease HIV-1 và chúng thƣờng có chứa trình tự giống nhƣ 11 vị trí cắt của enzyme trong 2 chuỗi polyprotein gag và gag-pol của HIV-1. Trình tự amino acid này thƣờng khá đa dạng và đặc hiệu cao gồm tƣ̀ 7 gốc amino acid ký hiệu P4-P3-P2-P1*P1'-P2'-P3', trong đó enzyme sẽ cắ t liên kế t (*) giƣ̃a P1*P1'. Vai trò, đặc tính của từng gốc amino acid cũng nhƣ các trình tự ƣa thích của protease HIV -1 cũng đã đƣợc làm rõ . Về phân loại, có thể chia cơ chất của protease HIV -1 thành hai nhóm; nhóm 1 tại P1 và P1' là các amino acid thơm và Pro (Aro-P), trong khi nhóm 2 là các amino acid kỵ nƣớc (HφHφ) [11, 14, 15]. Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và gagpol đƣợc nêu ở Bảng 1 [66]. 11 Bảng 1: Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và gag-pol [66] Các vị trí cắt P4 P3 P2 P1 P1’ P2’ P3’ MA-CA Ser Gln Asn Tyr Pro CA-p2 Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala p2-NC Ala Thr Ile Met Met Gln Arg NC-p1 Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly p1-p6gag Pro Gln Asn Phe Leu Gln Ser Trên p6gag Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Thr TFP-p6pol Asp Leu Ala Phe Leu Gln Gly p6pol- PR Ser Phe Asn Phe Pro Gln Ile PR-RTp51 Thr Leu Asn Phe Pro Ile Ser RTp51-RTp66 Ala Glu Thr Phe Tyr Val Asp RTp66-INT Arg Lys Ile Leu Phe Leu Asp Trên protein gag Ile Val Trên protein pol Theo đó, yêu cầu cụ thể với từng gốc amino acid tạo nên cơ chất peptide của protease HIV-1 nhƣ sau: P4: cơ chất peptide của protease HIV-1 có P4 là Ser sẽ hiệu quả cắt gấp 2,6 lần so với peptide có chứa bất kỳ các amino acid khác. Ngƣợc lại P4 không phù hợp với Val [69]. 12