Tài liệu Hoá sinh I - Trần Thị Xô, Đại học Đà Nẵng

Trang 1/ 96 Giáo trình Hoá sinh 2007 ðẠI HỌC ðÀ NẴNG TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA HÓA SINH I Bài giảng Biên soạn: PGS.TS Trần Thị Xô ðà Nẵng, 2007 Trang 2/ 96 Giáo trình Hoá sinh 2007 CHƯƠNG 1 PROTEIN Giữa thế kỷ thứ 19, nhà hoá học người ðức Gerardus Mulder ñã chiết ñược một loại hợp chất ñặc biệt, chúng vừa có mặt ở tế bào ñộng vật, vừa có mặt ở tế bào thực vật. Hợp chất này ñóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại của mọi tế bào sinh vật trên trái ñất. Theo ñề nghị của Berzelius - nhà hoá học Thụy ðiễn nổi tiếng, G. Mulder ñặt tên chất ñó là protein - theo tiếng la tinh "proteos" có nghĩa là quan trọng hàng ñầu. Protein có phân tử lượng lớn, ñược cấu thành từ các axit amin. Các axit amin trong phân tử protein liên kết với nhau bằng liên kết peptit. Về mặt cấu trúc và tính chất, protein có những ñặc tính không có ở bất kỳ hợp chất hữu cơ nào và chính những ñặc tính này bảo ñảm chức năng "cơ sở sự sống" của protein. Trình tự sắp xếp của các axit amin trong mạch phân tử protein ñược mã hoá trong bộ máy di truyền của tế bào, protein ñược tổng hợp trong tế bào sống. 1- VAI TRÒ SINH HỌC VÀ DINH DƯỠNG CỦA PROTEIN Protein có tính ñặc thù cao. Protein của mỗi loài có những ñặc tính riêng biệt, chúng ta có thể nhận thấy sự khác biệt này thông qua một số tính chất cảm quan như màu sắc, ñộ cứng, ñộ ñàn hồi của khối thịt. Protein là hợp chất quan trọng nhất ñối với sự sống. Trong cơ thể, protein ñóng vai trò là chất tạo hình chính, tạo nên cấu trúc của tế bào. Ngoài chức năng tạo hình, protein còn ñảm nhận nhiều chức năng quan trọng khác như: 1,- Xúc tác Các protein làm nhiệm vụ xúc tác trong cơ thể ñược gọi là enzym. Enzym thực hiện xúc tác hầu hết các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống. Sự thiếu hụt enzym hay sự hoạt ñộng không ñồng bộ của enzym trong cơ thể dẫn ñến sự rối loạn trao ñổi chất, làm cho cơ thể sống không thể sinh sản và phát triển bình thường ñược. Hiện nay, người ta ñã xác ñịnh ñược nhiều loại enzym (trên 3500), nhiều enzym ñã ñược chiết tách ra khỏi tế bào sống và ñược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghệ, ñặc biệt là trong sản xuất thuốc chữa bệnh và trong công nghệ thực phẩm. 2,- Vận tải Một số protein làm nhiệm vụ vận chuyển các chất trong cơ thể sống từ vị trí này sang vị trí khác hay từ cơ quan này ñến cơ quan khác trong cùng Giáo trình Hoá sinh 2007 Trang 3/ 96 một cơ thể. Ví dụ: Hemoglobin ở ñộng vật, chúng kết hợp với O2 ở phổi và vận chuyển ñến các cơ quan trong cơ thể và vận chuyển CO2 từ các mô trong cơ thể ñể thải ra ngoài qua phổi. Protein ñóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển các chất dinh dưỡng qua thành ruột vào máu và từ máu ñi ñên các tế bào trong cơ thể. Protein vận chuyển nhiều thành phần khác nhau trong cơ thể, ví dụ lipoprotein là chất mang của các phân tử lipit, protein-metalothionin là chất vận chuyển ion ñồng hoặc kẽm. 3,- Chuyển ñộng Các cơ thể sống có thể vận ñộng ñược là nhờ các protein làm chức năng chuyển ñộng. Hình thức vận ñộng như sự di ñộng của tinh trùng, di ñộng của ñộng vật ñơn bào (trùng roi), sự co cơ giúp chúng ta ñi lại, nói cười, … ñều do các protein ñảm nhận. Ví dụ sự co cơ ñược thực hiện nhờ chuyển ñộng trượt lên nhau của hai loại sợi protein là miozin (sợi to) và actin (sợi mảnh). 4,- Bảo vệ Trong cơ thể ñộng vật có những protein ñặc hiệu làm nhiệm vụ bảo vệ. Hệ thống miễn dịch của cơ thể sản xuất ra các protein bảo vệ ñược gọi là kháng thể. Hiện nay, người ta ñã biết ñược nhiều loại kháng thể có mặt trong máu người và ñộng vật, chuyên làm nhiệm vụ bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của những protein lạ, vi khuẩn, virus. Protein làm nhiệm vụ ñông máu, bịt vết thương chống sự mất máu cũng là những nhân tố bảo vệ. Hệ thống enzym giải ñộc của gan làm nhiệm vụ bảo vệ chống các chất ñộc hại cho cơ thể. Trong thực vật và cả vi sinh vật cũng có những protein làm nhiệm vụ bảo vệ, thường gặp là những protein ñộc có mặt trong tế bào cơ thể của chúng ñể chống lại sự phá hoại của các loài khác. 5,- ðiều hoà Sự hoạt ñộng thống nhất và ñồng bộ của một cơ thể là do các protein ñiều hoà ñảm nhận. Protein ñiều hoà có thể là một enzym, một hormon, chất dẫn truyền các xung ñộng thần kinh, … Ví dụ như vai trò của protein trong việc giữ sự cân bằng nước trong tế bào, nếu lượng nước trong tế bào quá nhiều sẽ dẫn ñến phù nề còn nếu tế bào bị mất nước sẽ dẫn ñến kìm hãm hoặc chấm dứt hoạt ñộng của tế bào - vì mọi phản ứng ñều xảy ra trong môi trường nước. Sự hoạt ñộng ñồng bộ, thống nhất của các protein ñiều hoà ñảm bảo cho sự sinh trướng và phát triển bình thường của một cơ thể sống. Giáo trình Hoá sinh 2007 Trang 4/ 96 6,- Kiến tạo và chống ñỡ cơ học Những protein làm nhiệm vụ chống ñỡ và kiến tạo cơ học như colagen, elastin có mặt trong gân, sụn ñảm bảo ñộ mềm dẻo, bền vững của các mô liên kết. Ở con tằm và một số loài sâu có lớp vỏ bọc ngoài cho con của chúng có bản chất protein ñể bảo vệ và chống sự tác ñộng ở bên ngoài. 7,- Truyền xung ñộng thần kinh Sự dẫn truyền các xung ñộng thần kinh là một quá trình xảy ra với một tốc ñộ nhanh, phức tạp, có sự tham gia của các protein, enzym. Trong nhiều trường hợp, protein ñóng vai trò trung gian quyết ñịnh, ví dụ như các protein là sắc tố thị giác. 8- Dự trữ dinh dưỡng Protein là chất dự trữ năng lượng, ví dụ như các protein trong lòng trắng trứng, protein trong các loại hạt như ñậu nành, lúa mì, bắp, … Sự phân biệt các chức năng như trên chỉ là tương ñối vì không phải lúc nào cũng rõ ràng, có những trường hợp, một protein có thể ñảm nhận một số chức năng khác nhau, hoặc có thể trong từng ñiều kiện cụ thể chức năng của một protein không giống nhau. Protein là một thành phần dinh dưỡng quan trọng cho người và ñộng vật. Trong thành phần dinh dưỡng phải cung cấp ñủ lượng protein, ñồng thời các protein phải có ñầy ñủ các axit amin cần thiết cho nhu cầu của cơ thể. Thiếu protein sẽ dẫn ñến sự suy nhược cơ thể, ñặc biệt ñối với trẻ em sẽ bị suy dinh dưỡng. Thiếu protein là nguyên nhân chủ yếu của tình trạng sức khoẻ kém. Thiếu protein thường ñi kèm theo tình trạng thiếu năng lượng và thiếu các yếu tố dinh dưỡng khác dẫn ñến khả năng ñề kháng của cơ thể kém và dễ bị nhiễm bệnh. Nếu protein trong khẩu phần thức ăn thấp tới 3%, chiều cao ngừng phát triển, giảm cân. Khi thiếu protein, thành phần hoá học và cấu trúc của xương thay ñổi. Khi lượng protein trong khẩu phần thấp tới 5,5÷1,7%, xương ngừng phát triển. Những rối loạn xảy ra trong cơ thể do thiếu protein rất ña dạng và xảy ra ở nhiều bộ phận của cơ thể. 2- CẤU TẠO HOÁ HỌC CỦA PROTEIN 2.1- Thành phần nguyên tố Bốn loại nguyên tố chính xây dựng nên phân tử protein là: C, H, O, N. Ngoài ra, trong protein còn chứa một lượng nhỏ lưu huỳnh. Tỉ lệ phân trăm khối lượng trung bình của các nguyên tố này trong protein thường nằm trong khoảng: C: 50÷55% - H: 6,5÷7,3% - O: 21÷24% Trang 5/ 96 Giáo trình Hoá sinh 2007 N: 15÷18% - S: 0÷0,24% Trong một số protein còn có một lượng rất nhỏ các loại nguyên tố khác như: P, Fe, Zn, Mn, Cu, Ca, ... 2.2- Thành phần axit amin Có thể nói các axit amin là những "viên gạch" xây nên phân tử protein. Các phân tử protein ñược hình thành từ 20 loại axit amin. Các axit amin trong thành phần protein ñều là các axit α-amin, có công thức cấu tạo chung như sau: R - gốc hydrocarbon (mạch thẳng, mạch vòng), gốc R có thể chứa các nhóm chức năng như: −COOH, −NH2 , −OH, −SH, ... Công thức cấu tạo của 20 axit amin trong thành phần protein ñược giới thiệu trong Bảng 1. Riêng Prolin nhóm −NH2 gắn với carbon α một liên kết N−H ñược thay thế bằng liên kết N−C tạo thành dạng mạch vòng, do vậy, sự có mặt của prolin trong mạch phân tử thường có xu hướng làm gập mạch. Có nhiều cách phân loại axit amin trong protein, một trong các cách ñó là dựa vào tính chất của mạch bên (−R) không tham gia tạo liên kết peptit. Theo cách này thì 20 axit amin ñược chia thành 3 nhóm như ở Bảng 2-1. Bảng 1: Công thức cấu tạo của các axit amin trong thành phần protein 1,- Axit amin với mạch bên ion hóa Tên gọi Công thức cấu tạo pK1 α-COOH pK2 pK3 p/I Axit Aspartic (Asp , D) 1,88 3,65 9,60 β- COOH α- NH3+ 2,77 Axit Glutamic (Glu, E) 2,19 4,25 9,67 γ-COOH α-NH3 3,22 + Lysine (Lys, K) 2,18 8,95 α-NH3+ 10,53 ε-NH3+ 9,74 Trang 6/ 96 Giáo trình Hoá sinh 2007 Arginine (Arg, R) 2,17 9,04 α-NH3 12,48 guanidinium + 10,76 Histidine (His, H) 1,82 6,00 imidazolium 9,17 α-NH3+ 7,59 Tyrosine (Tyr, Y) 2,20 9,11 α-NH3+ 10,07 phenolic – OH 5,66 Cisteine (Cys, C) 1,96 8,18 thiol 10,28 5,07 α-NH3+ 2,- Axit amin với mạch bên phân cực, không ion hóa TÊN GỌI CÔNG THỨC CẤU TẠO pK1 α-COOH pK2 α-NH3 p/I Asparagine (Asn, N) 2,02 8,80 5,41 Glutamine (Gln, Q) 2,17 9,13 5,65 Serine (Ser, S) 2,21 9,15 5,68 Threonine (Thr, T) 2,09 9,10 5,60 Trang 7/ 96 Giáo trình Hoá sinh 2007 3,- Aminoaxit với mạch bên không phân cực TÊN GỌI CÔNG THỨC CẤU TẠO pK1 α-COOH pK2 α-NH3 p/I Glycine (Gly, G) 2,34 9,60 5,97 Alanine (Ala, A) 2,34 9,69 6,00 Valine (Val, V) 2,32 9,62 5,96 Leucine (Leu, L) 2,36 9,60 5,98 Ngoài 20 axit amin ñã nêu trong Bảng 1, trong một số protein có thể còn chứa một số loại axit amin ít gặp khác như hydroxyprolin trong colagen, cacboxylglutamic trong protrombin, ... Người ta thấy rằng, có một số axit amin có thể không hiện diện trong thành phần cấu tạo của protein nhưng có mặt trong cơ thể sống và ñóng vai trò quan trọng trong sự chuyển hoá các chất, vai trò của nhiều axit amin loại này ñược tìm thấy ở các loài ñộng vật có vú như Ornithin, Citrullin, Taurin, β-Alanin, ... 2.3- Tính chất của axit amin 2.3.1- Tính tan Do sự có mặt của các nhóm mang ñiện tích nên các axit amin dễ tan trong các dung môi phân cực như nước, rượu. Khả năng tan của mỗi loại axit amin là khác nhau. Axit amin không tan trong các dung môi không phân cực như benzen, ether, ... NH3 lỏng là dung môi tốt nhất cho các axit amin. Các axit amin có mặt trong thành phần cấu tạo protein ñều có khả năng kết tinh, tinh thể bền ở nhiệt ñộ 20÷25°C. Trang 8/ 96 Giáo trình Hoá sinh 2007 2.3.2- Tính hoạt quang Trừ glyxin, còn tất cả các axit amin ñều có chứa nguyên tử carbon bất ñối nên chúng ñều là những chất hoạt quang. Chúng có thể tồn tại dưới 2 dạng ñồng phân quang học là D và L. Phần lớn axit amin trong cơ thể sống ñều nằm ở dạng L, nên dạng L là dạng mà cơ thể dễ dàng hấp thụ, cơ thể không hấp thụ nhiều axit amin dạng D, riêng D-methionine và D-phenylalanine thì cơ thể người có thể hấp thụ ñược. Dạng D Dạng L Sự ñịnh vị của các nhóm chức liên kết với carbon thứ 2 (carbon α) trong phân tử axit amin ñóng vai trò quan trọng trong việc hình thành mạch polypeptit. Lấy ví dụ trong trường hợp của proline và hydroxyproline, sự ñịnh vị của các nhóm chức liên kết với carbon α trong phân tử axit amin dẫn ñến hình thành dạng gấp khúc mạch khác nhau. Sự có mặt của L-Proline thường làm gãy cuộn mạch polypeptit. - Proline có hai dạng ñồng phân tương ứng với hai dạng gấp khúc trong mạch polypeptit: L-Proline: D-Proline: - Hydroxyproline cũng tương tự như vậy. 2.3.3- Tính ñiện ly Axit amin chứa hai nhóm chức là −COOH và −NH2 nên chúng có tính ñiện ly lưỡng tính. Tùy thuộc vào sự thay ñổi của pH môi trường mà chúng có Trang 9/ 96 Giáo trình Hoá sinh 2007 thể tồn tại ở 3 trạng thái ion khác nhau. Ví dụ: trong phân tử của một axit amin có chứa một nhóm −COOH và một nhóm −NH2 thì quá trình ñiện ly có thể biểu diễn như sau: ion dương ion lưỡng cực ion âm k1 và k2 là hằng số phân ly (theo lý thuyết của Bronsted): - pk của sự ñiện ly tương ứng với giá trị pH mà ở ñó, sự ñiện ly ñạt trạng thái cân bằng về nồng ñộ ion: pk1 = – log k1 ; pk2 = – log k2 Tuỳ theo pH của môi trường hoà tan mà các axit amin có thể mang ñiện tích âm hoặc dương. Trong môi trường axit mạnh, axit amin tồn tại ở dạng ion dương; ngược lại, trong môi trường kiềm mạnh, tồn tại ở dạng ion âm. Trong dung dịch nước, axit amin bao giờ cũng có 3 dạng ion: cation, ion lưỡng cực và anion, như vậy khi thay ñổi pH môi trường sẽ dẫn ñến sự thay ñổi nồng ñộ của các dạng ion. Tại giá trị pH mà ở ñó, dung dịch axit amin trung hòa về ñiện - nghĩa là tại ñó, dạng ion lưỡng cực chiếm nhiều nhất, còn các dạng anion và cation chiếm ít nhất và bằng nhau về số lượng, axit amin không di chuyển trong ñiện trường, pH của môi trường ñó ñược gọi là pH ñẳng ñiện (pHi hay pI): pI = (pk1 + pk2)/ 2 Ví dụ glycine: - ðể tính giá trị của pI, người ta có thể sử dụng phương trình tổng quát: Trang 10/ 96 Giáo trình Hoá sinh 2007 - n là số lượng ion dương cao nhất trong một phân tử axit amin. Ví dụ: với axit aspartic thì n=1; với lysine thì n=2; hay ñối với các mono-amino, monocarboxylic thì n=1. Hình 1: Giá trị pI cũng có thể thiết lập bằng phương pháp titration, ñồ thị titration của glycine có dạng như hình bên: 2.3.4- Một số tính chất hoá học Các axit amin có chứa hai nhóm chức −NH2 và −COOH nên chúng có một số tính chất ñặc trưng của các nhóm này, ñồng thời cũng có những tính chất riêng do gốc −R của một số axit amin có những nhóm chức chuyên biệt riêng tạo nên. - Phản ứng khử nhóm carboxyl: Khi tác dụng với Ba(OH)2 với sự có mặt của enzyme decarboxylase thu ñược amin tương ứng: 2 2 2 2 3 2 NH Phản ứng có thể viết dưới dạng tổng quát: R CH COOH R CH2 NH2 + Co2 NH2 Các amin tạo thành sau phản ứng có số nguyên tử carbon nhỏ hơn số nguyên tử carbon của axit amin ban ñầu là 1. Một số amin như cardaverin ñược tạo thành từ lysine, histamin ñược tạo thành từ histidine là những chất ñộc. - Tạo phức với các ion kim loại: Muối của axit amin với Pb, Hg, Ag là những chất không tan trong nước. ðây là một tính chất mà người ta sử dụng ñể tách axit amin ra khỏi hỗn hợp. Giáo trình Hoá sinh 2007 Trang 11/ 96 - Phản ứng khử amin, khử carboxyl: - Tác dụng với HNO3 Phản ứng này ñược dùng ñể ñịnh lượng axit amin dựa vào sự xác ñịnh lượng nitơ tạo thành. Phương pháp này ñược Van Slyke sử dụng lần ñầu tiên nên còn gọi là phương pháp Van Slyke. - Tác dụng với aldehyt formic Khi tác dụng với aldehyt formic, nhóm amin ở vị trí α bị bao vây: Có thể dựa vào phản ứng này ñể ñịnh lượng nitơ amin bằng cách chuẩn ñộ nhóm –COOH bằng NaOH-0,1N. ðây là cơ sở của phương pháp ñịnh lượng của Sorensen cho các axit αamin. Phương pháp này hiện nay thường sử dụng ñể ñịnh lượng ñạm tan, còn gọi là phương pháp chuẩn ñộ formon. - Tác dụng với ninhydrin Khi một phân tử axit amin tác dụng với hai phân tử ninhydrin trong ñiều kiện ñun nóng, sẽ tạo thành CO2, NH3 , aldehyt và sản phẩm có màu xanh tím - sản phẩm có màu này hấp thụ bước sóng cực ñại ở 570 nm, ñây là cơ sở của phương pháp xác ñịnh axit amin bằng so màu. Phản ứng này cũng ñược áp dụng nhiều trong các phương pháp sắc ký, ñiện di ñể xác ñịnh các Giáo trình Hoá sinh 2007 Trang 12/ 96 axit amin. Riêng prolin và hydroxyprolin sẽ cho sản phẩm có màu vàng. Phản ứng này rất nhạy, có thể phát hiện ñến microgram axit amin nên ñược dùng nhiều trong phân tích ñịnh tính và ñịnh lượng. Cần lưu ý rằng, chỉ có các αamin mới giải phóng CO2 khi tác dụng với ninhydrin - còn các amin khác cho sản phẩm có màu xanh khi tác dụng với ninhydrin và không có CO2 thoát ra. - Tác dụng với 1-fluoro-2,4-dinitrobenzen (Phản ứng Sanger) Trong môi trường kiềm yếu 1-fluoro-2,4-dinitrobenzen (FDNB) tác dụng với nhóm −NH2 tự do của axit amin, tạo dẫn xuất có màu vàng. Frederick Sanger ñã sử dụng phản ứng này ñể xác ñịnh axit amin có chứa nhóm −NH2 tự do trong chuỗi polypeptit, thông qua ñó, có thể xác ñịnh trình tự sắp xếp các axit amin trong chuỗi polypeptit ñó. - Tác dụng với phenyl isothiocyanat (Phản ứng Edman) Phenyl isothiocyanat (PITC) khi tác dụng với các α-amin sẽ tạo thành axit phenylthiohydantoin, chất này trong môi trường axit với dung môi là nitro-methan sẽ ñóng vòng tạo phenylthiohydantoin. Phản ứng này cũng ñược sử dụng ñể xác ñịnh các axit amin nằm ở ñầu tận cùng của chuỗi polypeptit có chứa nhóm −NH2 tự do. Trang 13/ 96 Giáo trình Hoá sinh 2007 - Sự tạo thành liên kết peptit Liên kết peptit ñược tạo thành do sự kết hợp giữa nhóm α-carboxyl của axit amin này với nhóm α-amin của axit amin kia và ñồng thời, một phân tử nước bị loại ra. Khi hai axit amin kết hợp với nhau sẽ tạo thành một di-peptit. Nếu di-peptit này kết hợp thêm với một axit amin nữa sẽ tạo thành tri-peptit. Quá trình phản ứng tiếp tục tiếp diễn sẽ tạo thành tetra-peptide, ..., polypeptit. Như vậy nếu có n phân tử axit amin kết hợp với nhau thì sẽ tạo thành ñược (n1) liên kết peptit và (n-1) phân tử nước. Từ 2 axit amin có thể tạo thành 2 loại dipeptit, từ 3 axit amin có thể tạo thành 6 loại tripeptit và từ n axit amin có thể tạo thành n ! peptit (Pn = n ! = 1.2.3…..n) Sự hình thành mạch polypeptit diễn ra trong cơ thể sống là một quá trình phức tạp có sự tham gia của nhiều enzyme - ñó là quá trình tổng hợp protein. Di-peptit ðể gọi tên các peptit nhỏ theo các gốc axit amin, người ta thường bắt ñầu bằng tên của axit amin có nhóm −NH2 tự do và kết thúc bằng tên của axit amin có chứa nhóm −COOH tự do. Các axit amin có nhóm −COOH tham gia tạo thành liên kết peptit thì tên gọi sẽ có tận cùng bằng -YL. Ví dụ: Alanine-Serine-Valine-Glycine → gọi là: Alanyl- Seryl-Valyl-Glycine Qua cách gọi tên, ta nhận biết ngay trong chuỗi peptit trên ñầu Alanylcó nhóm −NH2 tự do và ñầu Glycine có nhóm −COOH tự do. ðể biểu thị thành phần và trình tự sắp xếp của các axit amin trong chuỗi polypeptit người ta còn dùng ký hiệu 3 chữ cái hoặc ký hiệu 1 chữ cái của các axit amin viết Trang 14/ 96 Giáo trình Hoá sinh 2007 liền nhau theo qui luật ñược xác ñịnh, bắt ñầu từ ñầu có nhóm −NH2 ñến ñầu có nhóm −COOH. Ngoài ra, còn tồn tại một số tên riêng như: Glutathion là Tripeptit Glutamyl-Cysteinyl-Glycine hay Glucagon là một polypeptit gồm 29 axit amin. 2.3.5- Tính cảm quan Axit amin là nhân tố tạo vị chính cho các sản phẩm giàu protein, ñặc biệt là các sản phẩm ñã thuỷ phân (có thể hoàn toàn hoặc một phần). Vị của một số axit amin ñược trình bày ở Bảng 1.2 Bảng 2: Vị của một số a xit amin trong dung dịch nước ở pH 6-7 TT TÊN VỊ CỦA DẠNG L VỊ CỦA DẠNG D 1 Alanine ngọt ngọt 2 Arginine ñắng - 3 Asparagine - ngọt 4 Axit Aspartic - - 5 Cysteine - - 6 Glutamine - - 7 Axit Glutamic vị nước thịt - 8 Glycine ngọt - 9 Histidine ñắng ngọt 10 Leucine ñắng ngọt 11 Isoleucine ñắng ngọt 12 Lysine ngọt ñắng ngọt 13 Methionine vị lưu huỳnh vị lưu huỳnh 14 Phenylalanine ñắng ngọt 15 Proline ngọt (ñắng ở nồng ñộ thấp) - 16 Serine ngọt ngọt 17 Threonine ngọt ngọt 18 Tryptophan ñắng ngọt 19 Tyrosine ñắng - 20 Cystine - - Vị của axit amin phụ thuộc vào bản chất cấu tạo và dạng cấu hình không gian tồn tại như dạng D, dạng L. Giáo trình Hoá sinh 2007 Trang 15/ 96 2.4- Axit amin không thay thế Trong số 20 axit amin thường gặp trong thành phần protein, có một số axit amin mà cơ thể người và ñộng vật không thể tự tổng hợp ñược mà phải lấy từ bên ngoài vào qua nguồn thức ăn gọi là axit amin không thay thế. Trong trường hợp ở nguồn dinh dưỡng bị thiếu hụt các axit amin này thì cơ thể không thể tự tổng hợp ñược ñể bù ñắp cho sự thiếu hụt ñó ñược. Chính vì vậy mà nó sẽ ảnh hưởng trực tiếp ñến các hoạt ñộng sống của cơ thể và quá trình tổng hợp protein trong cơ thể. Ở người có 10 axit amin không thay thế, trong ñó: Người lớn có 8 axit amin không thay thế là: valine, leucine, isoleucine, methionine, threonine, phenylalanine, trytophan, lysine - Trẻ em còn có thêm 2 axit amin nữa là arginine và histidine. Một trong những tiêu chuẩn ñánh giá chất lượng protein thực phẩm là ñảm bảo ñầy ñủ hàm lượng axit amin không thay thế và tỷ lệ cân ñối giữa chúng trong protein. 3- CẤU TRÚC CỦA PROTEIN Về mặt cấu tạo hóa học, có thể nói protein là một polymer mà monomer của nó là các axit amin. Các axit amin này liên kết với nhau bằng liên kết peptit. Về mặt cấu trúc và các dạng tồn tại trong không gian của các protein có khác nhau, hiện người ta phân biệt 4 loại cấu trúc của protein: 3.1- Cấu trúc bậc 1 và ñặc ñiểm của liên kết peptit Cấu trúc bậc 1 của protein ñược mô tả chi tiết qua công trình nghiên cứu về cấu tạo phân tử insulin của F. Sanger và các cộng sự của ông năm 1955. Công trình này ñược giải thưởng Nobel về hóa học năm 1957. Cấu trúc bậc 1 của protein là thành phần và trình tự sắp xếp của các gốc axit amin trong mạch polypeptide. Trình tự sắp xếp nghiêm ngặt của các gốc axit amin trong một protein ñược mã hóa trong ADN. Hiện nay, cấu trúc bậc 1 của nhiều protein ñã ñược thiết lập. ða số các protein có số gốc axit amin giữa 100 và 500, nhưng cũng có nhiều protein có số lượng gốc axit amin lớn hơn nhiều. Cấu hình không gian và ñộ dài các liên kết peptide và chuỗi polypeptide ñược biểu diễn ở Hình 1-3. - Bốn nguyên tử của liên kết peptide và hai nguyên tử carbon α nằm trong cùng một mặt phẳng. - ðộ dài của liên kết giữa C–N là 1,325Å, nhỏ hơn ñộ dài của liên kết ñơn C–N bình thường là 1,47Å. Ngược lại, ñộ dài của liên kết giữa C–O là Giáo trình Hoá sinh 2007 Trang 16/ 96 1,24Å lại lớn hơn ñộ dài của liên kết C–O bình thường (1,21Å). Do ñó có thể hình thành dạng enol (khoảng 40%) của liên kết peptide. - Liên kết peptit khá bền (400J/mol), ñể phân cắt liên kết này cần năng lượng cao. Liên kết peptit có thể thuỷ phân trong axit, kiềm. Trong tế bào sống, liên kết peptit bị thuỷ phân khi có mặt của các enzym ñặc hiệu. Nghiên cứu cấu trúc tinh thể của các peptide cho thấy, kích thước của các nhóm peptide chứa một số gốc axit amin như nhau thì bằng nhau, không kể là nó ñược tạo thành bởi các axit amin nào. 3.2- Cấu trúc bậc 2 Cấu trúc bậc 2 của protein ñược thể hiện ở sự sắp xếp thích hợp của các nguyên tố trong không gian của chuỗi polypeptide. Do các nguyên tố carbon α có thể quay tự do xung quanh trục tạo thành bởi các liên kết ñồng hóa trị ñơn làm cho chuỗi polypeptide có nhiều hình thể. Có hai dạng hình thể cấu trúc bậc 2 thường gặp là cấu trúc xoắn và cấu trúc gấp nếp. Khi nghiên cứu về cấu hình không gian của protein, Linus Pauling và Robert Corry ñã chứng minh rằng, chuỗi polypeptide có cấu tạo xoắn ốc. Mô hình cấu tạo xoắn α như sau: Mỗi vòng xoắn gồm 3,6 gốc axit amin (18 gốc axit amin sẽ tạo ñược 5 vòng xoắn) - Khoảng cách giữa các vòng xoắn là 5,4Å (1,5Å cho mỗi axit amin) - Các gốc bên của các axit amin không tham gia trực tiếp vào việc tạo thành mạch polypeptide ñều hướng ra ngoài. Góc xoắn là 26°. Có thể có xoắn α-phải và xoắn α-trái (ngược chiều kim ñồng hồ). Cấu tạo xoắn ñược giữ bền vững nhờ các liên kết hydro. các liên kết hydro ñược hình thành tối ña giữa nhóm –CO của liên kết polypeptide này với nhóm –NH của liên kết nhóm peptide thứ 3 kề nó (4 axit amin trong 1 khoảng liên kết). Cấu trúc xoắn α của protein có ñộ bền rất cao và rất phổ biến trong các protein, tuy nhiên số lượng vòng xoắn α trong mỗi protein phụ thuộc vào số lượng và trình tự sắp xếp các axit amin trong protein ñó. Một số axit amin không có khuynh hướng tham gia hình thành cấu tạo xoắn, ngược lại, một số khác lại ñóng vai trò chủ ñạo trong việc hình thành cấu tạo xoắn. Một số kiểu cấu tạo xoắn khác cũng ñược xác ñịnh như cấu tạo xoắn 310. Theo kiểu cấu tạo này, trong mỗi vòng xoắn có 3 gốc axit amin. Cấu tạo Giáo trình Hoá sinh 2007 Trang 17/ 96 xoắn αx và xoắn αy thì có 4,4 và 5,2 gốc axit amin trong 1 vòng xoắn. Các dạng cấu tạo xoắn này ít gặp hơn cấu tạo xoắn α. Hình 2: ðặc ñiểm của liên kết peptit Trang 18/ 96 Giáo trình Hoá sinh 2007 Hình 3: Cấu tạo xoắn α-phải của chuỗi polypeptide (I, III, V) - Cấu trúc gấp nếp β: Là cấu trúc hình chữ chi, tương tự như tờ giấy gấp nếp. Mặt liên kết peptide nằm trên mặt phẳng gấp nếp (mặt phẳng tờ giấy), các gốc bên R của các axit amin có thể ở trên hoặc ở dưới mặt phẳng gấp nếp. Ba thành phần cơ bản –CH, –NH và –CO– sắp xếp thành một góc 120° , mạch polypeptid bị gập lại ở –CH, tạo thành cấu trúc gấp nếp. Các mạch polypeptit nằm kề nhau liên kết với nhau bằng liên kết hydro giữa nhóm – CO– của mạch này với nhóm –NH– của mạch kia. Khoảng cách trên trục giữa hai gốc axit amin kề nhau là 3,5Å (ở xoắn α là 1,5Å). Có hai kiểu gấp nếp β: song song và ñối song song. - Gấp nếp kiểu song song ñược hình thành khi các ñoạn poly-peptide nằm kề nhau có trình tự sắp xếp các nhóm −NH và −CO theo cùng một hướng. Ví dụ các ñoạn ñi theo cùng chiều từ ñầu −NH2 ñến ñầu −COOH của chuỗi polypeptide hay ngược lại, Cấu trúc gấp nếp kiểu song song là cấu trúc của fibroin của tơ tằm. - Gấp nếp β kiếu ñối song song có trình tự sắp xếp ngược lại. Các ñoạn peptide nằm kề nhau có hướng sắp xếp ngược nhau. ðoạn này có chuỗi polypeptide ñi theo chiều từ ñầu −NH2 ñến ñầu −COOH, còn ñoạn nằm kề nó thì ñi theo chiều từ ñầu −COOH ñến ñầu −NH2 của chuỗi polypeptide. CO Nh Oc Hn Nh CO Giáo trình Hoá sinh 2007 Trang 19/ 96 Kiểu ñối song song có thể tìm thấy ở một số protein hình cầu khi mạch polypeptit bị ñảo hướng (một chuỗi polypeptide khi nó tự cuộn gập lại). - Cấu trúc mặt cong β: Là cấu trúc mà chuỗi polypeptide có thể tự gấp lại thành một cấu hình có góc và ñược ổn ñịnh nhờ liên kết hydro. Mỗi một mặt cong chứa 4 gốc axit amin: Hình 4: Mô hình cấu trúc của một mặt cong β 3.3- Cấu trúc bậc 3 Cấu trúc bậc 3 là cấu trúc không gian ba chiều của mạch polypeptit trong ñó có ñoạn có cấu trúc bậc 2 hoàn chỉnh cũng có ñoạn có cấu trúc vô ñịnh hình ñặc trưng cho từng loại protein riêng biệt. Trong thực tế, nhiều protein có cấu trúc bậc 3 tồn tại dưới dạng hình cầu. Nguyên nhân làm cho các phân tử protein có thể cuộn lại thành hình cầu là vì sự tương tác giữa các nhóm bên (gốc R) của axit amin. Do sự tương tác này mà cấu trúc bậc 2 ñều ñặn bị biến dạng, dẫn ñến hình thành cấu trúc bậc 3. Như vậy, ở cấu trúc bậc 3, chuỗi polypeptide có những vùng có cấu trúc bậc 2 xác ñịnh, có những vùng có cấu trúc gấp nêp β và những vùng xoắn ngẫu nhiên làm cho phân tử cuộn lại có dạng hình cầu. Myoglobin là một protein có cấu trúc bậc 3 ñược Kendrew xác ñịnh bằng phương pháp chụp nhiễu xạ tia X. ðặc ñiểm quan trọng trong cấu trúc bậc 3 là sự hình thành những vùng kỵ nước do các gốc bên không phân cực của các axit amin hợp thành. Nhiều nghiên cứu ñã chứng minh rằng, cấu trúc bậc 3 ñược giữ vũng và ổn ñịnh chủ yếu do sự tương tác kỵ nước và liên kết hydro. Ngoài ra, người ta cũng tìm thấy liên kết disulfur (–S–S–) ở một số protein có cấu trúc bậc 3, song sự hình thành cầu disulfur không phải là lực chủ ñạo làm cho mạch polypeptide cuộn lại, mà nó ñược hình thành ngẫu nhiên khi các nhóm –SH của các gốc axit amin trong chuỗi polypeptide ñã cuộn lại nằm kề nhau. Trang 20/ 96 Giáo trình Hoá sinh 2007 Cầu disulfur ñóng vai trò giữ vững và ổn ñịnh cấu trúc bậc 3. Phần lớn các protein hình cầu có cấu trúc bậc 3, có các gốc axit amin kỵ nước quay vào trong - còn các gốc axit amin ưa nước phân bố trên bề mặt. 3.4- Cấu trúc bậc 4 Khi trong một protein có các "phần dưới ñơn vị" thì sự sắp xếp của các gốc axit amin của các "phần dưới ñơn vị" trong phân tử protein phải ñược xác ñịnh chặt chẽ, tạo ra dạng cấu trúc gọi là cấu trúc bậc 4. Các cấu trúc bậc 4 thường có dạng hình cầu vì các phần "phần dưới ñơn vị" thường có cấu trúc bậc 3. Các phần "phần dưới ñơn vị" liên hiệp lại với nhau nhờ các tương tác phi ñồng hóa trị như: tương tác tĩnh ñiện, tương tác kỵ nước, liên kết hydro, ... Ví dụ: Phân tử hemoglobin có 4 "phần dưới ñơn vị", gồm 2 chuỗi α và 2 chuỗi β. Hoạt tính sinh học của protein liên quan mật thiết ñến cấu trúc bậc cao của chúng. Một khi cấu trúc bậc cao của một protein bị thay ñổi, thì chắc chắn nó sẽ bị mất hoạt tính sinh học ban ñầu của nó. ðồng thời, số lượng và trình tự sắp xếp ñặc trưng riêng của các gốc axit amin trong chuỗi poly-peptide quyết ñịnh cho việc hình thành cấu trúc bậc cao của phân tử protein. 4- MỘT SỐ TÍNH CHẤT QUAN TRỌNG CỦA PROTEIN 4.1- Khối lượng và hình dạng phân tử protein Protein có khối lượng phân tử lớn và rất khác nhau: có những protein có khối lượng phân tử khoảng 10.000 Dalton, nhưng cũng có những protein mà khối lượng phân tử lên ñến hàng triệu Dalton. Bảng 5-2 giới thiệu khối lượng phân tử của một số protein. Có nhiều phương pháp ñể xác ñịnh khối lượng protein như: ño tốc ñộ lắng với ly tâm siêu tốc, sắc ký cột rây phân tử, ñiện di, ... Mỗi phương pháp có những ñặc ñiểm ưu việt riêng. Tốt nhất, ñể có một giá trị chính xác, cần kết hợp nhiều phương pháp. Bảng 2: Khối lượng phân tử và ñiểm ñẳng ñiện của một số protein PROTEIN KHỐI LƯỢNG (MW) [Dalton] PI Cytochrome C 13.000 10,6 Ribonuclease 14.000 7,8 Myoglobin của ngựa 17.000 7,0 Carboxypeptidase 34.000 6,0