Tài liệu Bước đầu khảo sát một số gen có tiềm năng ứng dụng trong hỗ trợ điều trị ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----------------*----------------- Nguyễn Tuấn Anh BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ GEN CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----------------*----------------- Nguyễn Tuấn Anh BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ GEN CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Nguyễn Lai Thành TS. Phạm Cẩm Phương Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Lai Thành, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện luận văn cao học. Thầy đã rất tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm làm việc giúp tôi hoàn thành nghiên cứu này. Trong quá trình nghiên cứu và học tập, tôi luôn nhận được những lời nhận xét, góp ý quý báu từ thầy để có thể thực hiện tốt nghiên cứu của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Cẩm Phương, người hướng dẫn và cũng là người quản lý trực tiếp trong quá trình nghiên cứu và làm việc tại Đơn vị Gen trị liệu. Chị đã luôn hỗ trợ, truyền đạt kiến thức và cho những đóng góp đáng giá để tôi có thể hoàn thành tốt được nghiên cứu này. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, đặc biệt là GS.TS. Mai Trọng Khoa và PGS.TS. Trần Đình Hà, các thầy đã tạo điều kiện hết mức cho tôi được tiến hành nghiên cứu tại Đơn vị Gen trị liệu - bệnh viện Bạch Mai. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Đơn vị Gen trị liệu, đặc biệt là TS. Nguyễn Thuận Lợi, ThS. Nguyễn Tiến Lung, những người đã chỉ dẫn, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô công tác tại bộ môn Sinh học Tế bào cũng như các thầy cô trong Khoa Sinh học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí giá để có thể thực hiện được luận văn cũng như vận dụng trong công việc. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã quan tâm, động viên tinh thần trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Hà Nội, ngày 13 tháng 12 năm 2016 Nguyễn Tuấn Anh MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chương 1 - TỔNG QUAN ..........................................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ..................................3 1.1.1. Giới thiệu chung .................................................................................3 1.1.2. Chẩn đoán giai đoạn ung thư đại trực tràng .......................................6 1.1.3. Chẩn đoán mô bệnh học ung thư đại trực tràng .................................8 1.1.4. Các chất chỉ điểm khối u thường dùng ...............................................9 1.2. MỘT SỐ CƠ CHẾ PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ...............................................................10 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ..............................17 1.3.1. Đích VEGF - chống tăng sinh mạch trên bệnh nhân UTĐTT ..........18 1.3.2. Đích EGFR trong UTĐTT ................................................................20 1.3.3. Các tín hiệu hạ nguồn khác của EGFR .............................................24 1.3.4. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ..................................................25 Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................27 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU....................................................................27 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn..........................................................................27 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ............................................................................27 2.1.3. Phương pháp chọn mẫu ....................................................................27 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................................28 2.3. THIẾT BỊ, VẬT TƯ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU ............................28 2.3.1. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ..............................................28 2.3.2. Các vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu ..................................29 2.3.3. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu............................................29 2.4. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN .........................................................................30 2.4.1. Sàng lọc bệnh nhân ...........................................................................30 2.4.2. Thu thập thông tin bệnh nhân ...........................................................31 2.4.3. Xác định trạng thái đột biến các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA ............................................................................................31 2.4.4. Phân tích kết quả bằng SPSS 23.0 ....................................................35 i Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................36 3.1. ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC CỦA NHÓM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...39 3.2. BIẾN ĐỔI CỦA CÁC GEN KRAS, NRAS, BRAF VÀ PIK3CA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ......................................41 3.2.1. Biến đổi của gen KRAS .....................................................................41 3.2.2. Biến đổi của gen NRAS .....................................................................43 3.2.3. Biến đổi của gen BRAF ....................................................................44 3.2.4. Biến đổi của gen PIK3CA .................................................................45 3.2.5. Nhận xét chung .................................................................................47 3.3. TƯƠNG QUAN GIỮA TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN GEN VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH NHÂN ..............................................................49 3.4. BÀN LUẬN ...............................................................................................53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................60 KẾT LUẬN ........................................................................................................60 KIẾN NGHỊ .......................................................................................................60 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................61 Tiếng Việt ...........................................................................................................61 Tiếng Anh ...........................................................................................................61 PHỤ LỤC ............................................................................................................... - 1 Phụ lục 1: Mẫu bệnh án nghiên cứu ................................................................ - 1 Phụ lục 2: Qui trình tách DNA từ mô cố định formalin – vùi paraffin........... - 3 Phụ lục 3: Qui trình định lượng DNA theo nguyên tắc huỳnh quang ............ - 5 Phụ lục 4: Quy trình phát hiện đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF ................. - 6 Phụ lục 5: Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR ................................................ - 9 Phụ lục 6: Qui trình giải trình tự tự động trên máy 3500 Dx Genetic Analyzer (Applied Biosystems) bằng bộ sản phẩm BigDye® Terminator v3.1 Cycle........................................................................... - 10 Phụ lục 7: Trình tự gen PIK3CA (NM_006218.3) ........................................ - 12 - ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 – Con đường tín hiệu MAPK và cơ chế tác động của thuốc kháng EGFR .......................................................................................................12 Hình 1.2 – Con đường tín hiệu PI3K-AKT ...............................................................15 Hình 2.1 – Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ........................................................................30 Hình 3.1 – Một số kết quả phát hiện đột biến gen KRAS bằng phương pháp PCR kết hợp lai đầu dò đặc hiệu (KRAS XL StrippAssay®) .................42 Hình 3.2 – Một số kết quả phát hiện đột biến gen NRAS bằng phương pháp PCR kết hợp lai đầu dò đặc hiệu (NRAS XL StripAssay®) ...................43 Hình 3.3 – Một số kết quả phát hiện đột biến gen BRAF bằng phương pháp PCR kết hợp lai đầu dò đặc hiệu (BRAF 600/601 StripAssay®)............44 Hình 3.4 - Một số kết quả giải trình tự gen PIK3CA trên exon 9 .............................45 Hình 3.5 – Một số kết quả trình tự gen PIK3CA trên exon 20. ................................46 Hình 3.6 – Sơ đồ chi tiết về tỷ lệ từng loại đột biến phát hiện được trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu ..............................................................................48 Hình 3.7 – Các phác đồ điều trị ung thư đại trực tràng di căn .................................56 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 - Các thuốc được cấp phép trong điều trị UTĐTT di căn ............................4 Bảng 1.2 - Giai đoạn theo hệ thống phân loại TNM cho UTĐTT và tỷ lệ sống của bệnh nhân sau 5 năm ...........................................................................8 Bảng 1.3 - Tần suất xuất hiện đột biến RAS trong UTĐTT .....................................14 Bảng 1.4 - So sánh một số phương pháp phát hiện đột biến gen phổ biến ...............17 Bảng 2.1 - Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ....................................................28 Bảng 2.2 - Các vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu .........................................29 Bảng 2.3 - Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ..................................................29 Bảng 2.4 - Các loại đột biến có thể phát hiện được bằng kit StripAssay® (ViennaLab) .............................................................................................33 Bảng 2.5 - Trình tự mồi dùng để khuếch đại exon 9 và exon 20 của gen PIKCA3 ...................................................................................................34 Bảng 3.1 - Thông tin các đối tượng tham gia nghiên cứu .........................................38 Bảng 3.2 - Tổng hợp các đặc điểm của 44 bệnh nhân UTĐTT trong nghiên cứu ...........................................................................................................40 Bảng 3.3 - Tổng hợp các loại đột biến theo vị trí phát hiện trong nghiên cứu .........47 Bảng 3.4 - Mối tương quan giữa trình trạng đột biến gen và các đặc điểm của bệnh nhân .................................................................................................50 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ AKT/PKB Protein Kinase B BSC Best Supportive Care (chăm sóc hỗ trợ tốt nhất) CA 19-9 Cancer Antigen 19-9 CEA Carcinoembryonic Antigen DNA Deoxyribonucleic Acid EGF Epidermal Growth Factor (yếu tố tăng trưởng biểu bì) EGFR Epidermal Growth Factor Receptor (thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì) FDA US Food And Drug Administration (Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ) FFPE Formalin-Fixed Paraffin-Embedded formalin vùi parafin) JAK Janus Kinase MAPK/ERK Mitogen-Activated Protein Kinase/Extracellular SignalRegulated Kinases (Mô cố định MEK/MAPKK/MAP2K Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase mTOR Mammalian Target of Rapamycin PDGF Platelet-Derived Growth Factor (yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu) PDGFR Platelet-Derived Growth Factor Receptor Factor (thụ thể yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu) PDK1 Phosphoinositide-Dependent Kinase-1 PI3K Phosphotidylinositol–3 Kinase v PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate PIP3 Phosphatidylinositol 3,4,5-Trisphosphate PTEN Phosphatase And Tensin Homolog STAT Signal Transducer and Activator of Transcription TNM Tumor - Nodule - Metastase (Khối u - Hạch vùng - Di căn xa) UTĐTT Ung thư đại trực tràng VEGF VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor (yếu tố tăng trưởng mạch máu nội mô) Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (thụ thể yếu tố tăng trưởng mạch máu nội mô) vi MỞ ĐẦU Điều trị ung thư đại trực tràng (UTĐTT) đã có những bước tiến lớn trong hơn 10 năm qua, thời gian sống trung bình hiện nay đã vượt qua con số 30 tháng. Đây là kết quả của sự ra đời những thuốc điều trị mới bao gồm cả những thuốc gây độc tế bào (irinotecan, oxaliplatin) và các thuốc điều trị đích (bevacizumab, aflibercept, cetuximab, panitunumab, regorafenib) đã và đang được tích hợp vào thành các phác đồ điều trị tiêu chuẩn trong thực hành lâm sàng. Chẩn đoán sớm bệnh và điều trị đúng phác đồ đóng vai trò quan trọng để kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân. Tuy nhiên không phải tất cả các bệnh nhân đều đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích, hiệu quả của thuốc còn phụ thuộc vào các gen nằm trong con đường tín hiệu phụ thuộc EGFR như KRAS, NRAS, BRAF và PIK3CA. Việc xác định trạng thái đột biến của những gen này là rất cần thiết trong việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp nhất cho bệnh nhân, tiên lượng được tiến triển bệnh và hạn chế các tác dụng phụ của thuốc. Điều này sẽ góp phần giúp nâng cao hiệu quả điều trị, tăng thời gian sống thêm và giúp cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng có chất lượng sống tốt hơn. Xét về khía cạnh kinh tế, vấn đề này cũng góp phần tránh lãng phí khi chỉ định điều trị bằng thuốc điều trị đích (trong trường hợp thuốc không đem lại hiệu quả). Trong tương lai gần, việc xét nghiệm những bộ gen này sẽ là một trong những điều kiện cần thiết làm tiền đề triển khai việc điều trị cá thể hóa các bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Trên thế giới, việc xác định trạng thái đột biến các gen KRAS, NRAS, BRAF và PIK3CA là những xét nghiệm cần thiết và đã được thực hiện thường qui ở các nước phát triển. Ở Việt Nam, gen KRAS và BRAF đã được triển khai thực hiện thường qui ở một số bệnh viện lớn, NRAS bước đầu được triển khai nhưng chưa có số liệu báo cáo, PIK3CA hiện tại cũng chưa có báo cáo nào trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Qua tìm hiểu và phân tích tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam, chúng tôi xét thấy các gen KRAS, NRAS, BRAF và PIK3CA là những dấu ấn sinh 1 học rất có ý nghĩa trong điều trị ung thư đại trực tràng. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Bước đầu khảo khát một số gen mang tính định hướng trong điều trị ung thư đại trực tràng” nhằm mục tiêu:  Khảo sát trạng thái đột biến các gen KRAS, NRAS, BRAF, và PIK3CA trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng.  Đánh giá sơ bộ về mối tương quan giữa trạng thái đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF và PIK3CA với một số đặc điểm ((tuổi, giới tính, vị trí u nguyên phát, CEA, CA 19-9, giai đoạn bệnh...) của bệnh nhân trong ung thư đại trực tràng. 2 Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1. Giới thiệu chung Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những loại ung thư có tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong cao nhất, đứng thứ ba ở nam và thứ hai ở nữ trên thế giới. Theo GLOBOCAN 2012 thì ung thư đại trực tràng tại Việt Nam có tỷ lệ mắc đứng thứ tư ở nam, đứng thứ 6 ở nữ và tỷ lệ tử vong đứng thứ năm trong các bệnh ung thư. Các yếu tố nguy cơ của bệnh chủ yếu liên quan đến dinh dưỡng và các bệnh lý đường tiêu hóa như: chế độ ăn ít rau, nhiều chất béo; viêm loét mạn tính; polyp; bệnh Crohn; bệnh đa polyp đại trực tràng... Ung thư đại trực tràng là một trong số ít bệnh lý ác tính có tiên lượng khá tốt nếu được phát hiện và điều trị sớm. Ở giai đoạn sớm khoảng 50% bệnh nhân bị mắc ung thư này có thể điều trị triệt căn bằng phẫu thuật. Phương pháp điều trị chủ yếu là phẫu thuật cắt bỏ, kết hợp với xạ trị, hóa trị và gần đây có thêm điều trị đích. Tuy nhiên, ở giai đoạn sớm bệnh nhân không có các triệu chứng điển hình và thường khó phát hiện, khi đã có biểu hiện các triệu chứng lâm sàng thường được phát hiện là đã ở giai đoạn muộn. Ở giai đoạn ung thư đã di căn thì việc điều trị thường đem lại hiệu quả thấp, tỷ lệ bệnh nhân sống sót trên 5 năm chỉ khoảng 10% [22]. Đối với UTĐTT di căn, các phương pháp điều trị hiện tại thường sử dụng hai nhóm thuốc là thuốc gây độc tế bào và thuốc điều trị đích. Phác đồ điều trị chuẩn cho UTĐTT di căn hiện nay thường là kết hợp giữa các hóa chất gây độc tế bào với các thuốc điều trị đích. Hiện có 6 nhóm thuốc đang được áp dụng trong thực hành lâm sàng điều trị UTĐTT di căn bao gồm: 3 nhóm thuốc gây độc tế bào và 3 nhóm thuốc đích sinh học. Các thuốc đã hiện nay được phê chuẩn trong điều trị UTĐT di căn bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) được trình bày trong Bảng 1.1. Các thuốc gây độc tế bào gồm 3 nhóm: fluoropyrimidines (fluorouracil [5FU] và capecitabine), thuốc ức chế topoisomerase I (irinotecan) và các hợp chất có 3 chứa platin (oxaliplatin). Phác đồ cơ bản là 5-FU kết hợp với leucovorin và oxaliplatin (FOLFOX) hoặc với leucovorin và irinotecan (FOLFIRI), đây là những phác đồ thường dùng để kết hợp với các thuốc điều trị đích[72]. Ngoài ra, có thể thay thế fluoropyrimidine bằng capecitabine kết hợp với oxaliplatin (CAPOX/XELOX) [13]. Phương pháp điều trị nhắm vào các đích sinh học trong UTĐTT hiện có ba nhóm: (1) thuốc kháng yếu tố tăng trưởng mạch máu nội mô (anti VEGF) (bao gồm bevacizumab - một kháng thể đơn dòng kháng VEGF-A và aflibercept - một protein dung hợp có nguồn gốc từ các thành phần thụ thể ngoại bào của hệ thống VEGF); (2) các kháng thể đơn dòng kháng thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) trên bề mặt tế bào ung thư (cetuximab và panitumumab); và (3) regorafenib là một thuốc uống dạng phân tử nhỏ có tác dụng ức chế nhiều phân tử kinase nội bào khác nhau. Bảng 1.1 - Các thuốc được cấp phép trong điều trị UTĐTT di căn [69] FDA PHÊ DUYỆT PHÂN LOẠI DƯỢC CHẤT Bước điều trị Bước 1 Cứu vớt Fluorouracil + + Capecitabine + + Bevacizumab + + + + + + Irinotecan Kết hợp + Oxaliplatin Hóa chất gây độc tế bào Bước 2 Đơn độc +* + + + + Anti VEGF Aflibercept Kháng thể kháng EGFR Cetuximab + + + + + Ức chế đa Kinase Regorafenib + + Panitunumab + + * bao gồm cả những trường hợp đã được điều trị bước 1 bằng bevacizumab 4 + Trong các liệu pháp trên, điều trị đích UTĐTT bằng các kháng thể đơn dòng kháng thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (thuốc kháng EGFR: cetuximab, panitumumab) hay kháng thụ thể yếu tố tăng trưởng mạch máu nội mô (thuốc kháng VEGF: bevacizumab, aflibercept) là những liệu pháp điều trị đích đem lại nhiều kết quả tốt cho bệnh nhân: kích thước khối u giảm đáng kể, thời gian sống thêm toàn bộ và thời gian sống thêm không bệnh tiến triển được cải thiện dài hơn, chất lượng sống cũng tốt hơn. Tuy nhiên, tính đáp ứng với các thuốc điều trị đích này trên mỗi bệnh nhân lại có sự khác nhau. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy những bệnh nhân UTĐTT có khối u mang đột biến một trong số các gen KRAS, NRAS, BRAF và PIK3CA đáp ứng kém với các thuốc kháng EGFR (cetuximab, panitumumab), trong khi những bệnh nhân không mang đột biến có thời gian sống thêm toàn bộ và thời gian sống thêm không bệnh cao hơn rõ rệt. Những bệnh nhân không mang đột biến những gen này khi được điều trị bằng các thuốc kháng EGFR cho kết quả tốt hơn so với dùng các thuốc kháng VEGF. Các thuốc kháng VEGF cho đến nay mặc dù đã có khá nhiều nghiên cứu tuy nhiên vẫn chưa thu được bằng chứng rõ rệt về các dấu ấn sinh học có liên quan đến đáp ứng của thuốc [69]. Thực tế lâm sàng cho thấy khi thiếu thông tin về trạng thái đột biến gen, bệnh nhân sẽ ít có khả năng được áp dụng những phác đồ điều trị phù hợp ngay từ đầu, điều này dẫn đến tình trạng thuốc điều trị thiếu hiệu quả hoặc thậm chí làm bệnh tiến triển xấu đi. Sử dụng phác đồ điều trị không hiệu quả như vậy sẽ gây ra những lãng phí rất lớn về tài chính, về thời gian và ảnh hưởng lớn đến tinh thần, sức khỏe của người bệnh. Hiện nay, vai trò của các xét nghiệm phân tích các dấu ấn sinh học liên quan tới đích điều trị có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với thực hành điều trị lâm sàng. Dựa trên những bằng chứng cụ thể thu được từ các xét nghiệm này, các bác sỹ lâm sàng có thể đưa ra những quyết định điều trị phù hợp, đúng đắn nhất cho bệnh nhân. 5 1.1.2. Chẩn đoán giai đoạn ung thư đại trực tràng Giai đoạn bệnh là được coi là yếu tố tiên lượng có giá trị nhất trong UTĐTT và nó là cơ sở cho việc lựa chọn phương pháp điều trị. Trong đó, các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh, các chất chỉ thị sinh học và lâm sàng là cơ sở cho việc xác định giai đoạn bệnh. Các thăm dò hình ảnh như nội soi đại trực tràng kết hợp sinh thiết, chụp CT Scanner ngực-bụng, chụp cộng hưởng từ hạt nhân vùng tiểu khung... là những xét nghiệm có vai trò quan trọng trong đánh giá giai đoạn bệnh. Năm 1932, Cuthbert Dukes đã đưa ra hệ thống phân loại giai đoạn đầu tiên cho UTĐTT. Trong đó, Dukes phân loại làm 4 giai đoạn:  Giai đoạn A: khối u giới hạn ở thành trực tràng.  Giai đoạn B: khối u vượt qua thành trực tràng.  Giai đoạn C: khối u di căn đến hạch lympho.  Giai đoạn D: chỉ bệnh di căn xa. Hệ thống phân loại Dukes đã được sửa đổi nhiều lần, theo một số tác giả khác như phân loại Astler-Coller và Dukes-Turnbull. Cho đến nay, hệ thống phân loại TNM trở thành tiêu chuẩn quốc tế cho giai đoạn UTĐTT. Hệ thống phân loại TNM bởi Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ năm 2010 được đánh giá dựa trên kích thước và mức độ xâm lấn của khối u (T - tumour), tình trạng di căn hạch bạch huyết (Nnodule) và di căn xa (M - metastase) [20]. Hệ thống phân loại TNM của UTĐTT theo Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ năm 2010 (The American Joint Committee on Cancer - AJCC) T - Khối u nguyên phát  Tx: Không đánh giá được u.  T0: Không có bằng chứng của khối u.  Tis: Ung thư tại chỗ. Tế bào ung thư chỉ được tìm thấy trong lớp niêm mạc và lớp hạ niêm mạc. 6  T1: Khối u xâm nhập vào lớp dưới niêm mạc.  T2: Khối u đã phát triển đến lớp cơ nằm phía dưới của lớp dưới niêm mạc.  T3: Khối u đã phát triển xuyên qua lớp cơ vào trong lớp thanh mạc.  T4a: Khối u đã phát triển vào trong bề mặt của phúc mạc tạng.  T4b: Khối u đã xâm lấn trực tiếp hoặc dính trực tiếp vào cơ quan cận kề. N - Hạch vùng  Nx: Không đánh giá được hạch di căn.  N0: Không có hạch di căn  N1a: Di căn 1 hạch vùng.  N1b: Di căn 2-3 hạch vùng.  N1c: Khối u đi vào lớp dưới thanh mạc, mạc treo ruột, hoặc mô quanh trực tràng mà không có di căn hạch vùng.  N2a: Di căn được tìm thấy trong 4-6 hạch vùng.  N2b: Di căn được tìm thấy ≥ 7 hạch vùng. M - Di căn xa  M0: Không có di căn xa  M1a: di căn đến 1 cơ quan hay 1 vùng  M1b: di căn đến nhiều hơn 1 cơ quan hay 1 vùng Kết hợp các thông số T, N và M, chúng ta có thể đưa ra kết luận về giai đoạn bệnh từ giai đoạn I (sớm, tiên lượng tốt nhất) đến giai đoạn IV (ung thư đã tiến triển muộn) để tiên lượng khả năng sống sau 5 năm của bệnh nhân như trình bày trong Bảng 1.2. 7 Bảng 1.2 – Giai đoạn theo hệ thống phân loại TNM cho UTĐTT và tỷ lệ sống của bệnh nhân sau 5 năm [22] Giai đoạn T N M Dukes* 0 Tis N0 M0 -- T1 N0 M0 A T2 N0 M0 A IIA T3 N0 M0 B 84 IIB T4a N0 M0 B 76 IIC T4b N0 M0 B 59 T1-T2 N1/N1c M0 C T1 N2a M0 C T3-T4a N1/N1c M0 C T2-T3 N2a M0 C T1-T2 N2b M0 C T4a N2a M0 C T3-T4a N2b M0 C T4b N1-N2 M0 C IVA T bất kỳ N bất kỳ M1a D IVB T bất kỳ N bất kỳ M1b D I Tỉ lệ sống 5 năm (%) 92 IIIA IIIB IIIC 83 64 32 10 * Phân loại theo Cuthbert Dukes 1.1.3. Chẩn đoán mô bệnh học ung thư đại trực tràng Phân loại mô bệnh học ung thư đại trực tràng của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2000 gồm các loại sau: Ung thư biểu mô - Ung thư biểu mô tuyến: tuỳ thuộc mức độ biến đổi các cấu trúc ống, tuyến, ung thư biểu mô tuyến được chia ra các loại sau: 8  Ung thư biểu mô tuyến biệt hoá cao: tổn thương có sự hình thành các tuyến lớn và rõ ràng với các tế bào biểu mô hình trụ.  Ung thư biểu mô tuyến biệt hoá vừa: tổn thương chiếm ưu thế trong khối u là trung gian giữa ung thư biểu mô tuyến biệt hoá cao và ung thư biểu mô tuyến biệt hoá thấp.  Ung thư biểu mô tuyến biệt hoá thấp: tổn thương là các tuyến không rõ ràng với các tế bào biểu mô kém biệt hoá. - Ung thư biểu mô tuyến nhày: các tế bào u sản xuất nhiều chất nhầy ra ngoài tế bào tạo thành các nốt hay các hồ chứa đầy chất nhầy. - Ung thư biểu mô tế bào nhẫn: các tế bào có dạng hình vòng nhẫn chứa nhiều chất nhầy, ít có khuynh hướng tạo thành tuyến hay ống. - Các loại khác (ít gặp): ung thư biểu mô tế bào nhỏ, ung thư biểu mô tế bào vảy, ung thư biểu mô tuyến vảy, ung thư biểu mô tuỷ, ung thư biểu mô không biệt hoá. Các loại u khác: carcinoide, ung thư biểu mô tuyến hỗn hợp, ung thư cơ trơn, ung thư hạch, u lympho ác tính. 1.1.4. Các chất chỉ điểm khối u thường dùng Hiện nay, những chất chỉ điểm khối u được quan tâm và sử dụng thường qui trong thực hành lâm sàng điều trị UTĐTT chủ yếu là CEA và CA19-9. CEA (Carcinoembryogenic Antigen - Kháng nguyên ung thư biểu mô phôi): là một nhóm các glycoprotein có khối lượng phân tử khoảng 200,000 dalton. CEA bình thường được sản xuất bởi tế bào niêm mạc dạ dày ruột của thai nhi và sau khi sinh CEA biến mất và không còn phát hiện trong huyết thanh nữa. Tuy nhiên, CEA có thể tăng ở người hút thuốc lá và trong nhiều bệnh ác tính, đặc biệt là ung thư đại tràng [56]. CEA tăng là một yếu tố tiên lượng xấu và cho thấy bệnh đang tiến triển [29]. Giá trị CEA trên 5 ng/mL được coi là tăng. Tuy nhiên, nồng độ chất này cao trong máu không đặc hiệu đối với UTĐTT vì nó cũng tăng trong một số 9 bệnh lý khác khác như: bệnh lý dạ dày ruột (polyp, viêm ruột, bệnh Crohn), bệnh phổi (khí phế thũng, viêm phế quản mạn), bệnh gan (viêm đường mật, viêm gan mạn tiến triển, xơ gan do rượu), viêm tuyến vú mạn tính, viêm tuỵ mạn và các bệnh ung thư khác. CEA không được sử dụng để sàng lọc và chẩn đoán bệnh vì nó chỉ được phát hiện ở giai đoạn bệnh tiến triển và nó cũng không tăng trong tất cả các ca bệnh UTĐTT. Nồng độ CEA giảm về giá trị bình thường sau phẫu thuật ở những bệnh nhân có tăng CEA trước mổ mang ý nghĩa là khối u đã được cắt bỏ hoàn toàn, trái lại nồng độ CEA vẫn tiếp tục tăng cao sau phẫu thuật chỉ ra khả năng vẫn còn ung thư tồn dư. Tăng nồng độ CEA trước mổ cũng là một yếu tố độc lập tiên lượng xấu đối với bệnh nhân [56]. CA19-9 (Cancer Antigen 19-9 hay Carbohydrate Antigen 19-9): vai trò chủ yếu của CA19-9 là theo dõi hiệu quả điều trị, phát hiện tái phát và tiên lượng trong bệnh ung thư tụy. Giá trị CA 19-9 trên 37 ng/mL được coi là tăng. Trong UTĐTT, độ nhạy lâm sàng của CA 19-9 (18-58%) nói chung thấp hơn so với độ nhạy lâm sàng của CEA (38-58%). Tỷ lệ tăng của CA 19-9 trong UTĐTT phụ thuộc vào giai đoạn ung thư (giai đoạn Duckes A là 0-7%, Duckes B là 17%, Duckes C là 47% và Duckes D là 75%), trong khi đó, tỷ lệ tăng của CEA trong các giai đoạn của UTĐTT cao hơn nhiều (giai đoạn Duckes A là < 20%, Duckes B là 40-60%, Duckes C là 60-80% và Duckes D là 80-85%). 1.2. MỘT SỐ CƠ CHẾ PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Ung thư là kết quả tích tụ từ nhiều quá trình biến đổi ở mức độ phân tử. Trong đó, sự biến đổi liên quan đến các quá trình gây ra sự tăng sinh quá của tế bào hay ức chế sự chết theo chương trình (apoptosis) là những biến đổi quan trọng trong việc hình thành ung thư. Trong đó, sự hoạt hóa của các con đường tín hiệu phụ thuộc EGFR như RAS-RAF-MAPK và PI3K-PTEN-AKT đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình tăng sinh tế bào, tăng sinh mạch và apoptosis. 10 Ở các tế bào UTĐTT, các con đường tín hiệu phụ thuộc EGFR thường được kích hoạt bao gồm: con đường MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) và con đường PI3K (Phophatidyl Inositol Phosphate Kinase). Việc xuất hiện đột biến ở các gen ức chế khối u (tumor suppressor genes) hay các gen tiền ung thư (protooncogene) tham gia vào các đường tín hiệu này như KRAS, NRAS, BRAF PIK3CA, PTEN... có vai trò đáng kể trong quá trình bệnh sinh UTĐTT[69]. 1.2.1. Con đường MAPK (RAF/MEK/ERK) EGFR - thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì là một protein tyrosine kinase xuyên màng truyền tín hiệu qua hai con đường, kết quả là kích hoạt sự tăng sinh và sống sót tế bào. EGF (yếu tố tăng trưởng biểu bì) là phối tử của EGFR, gắn với domain ngoại bào của EGFR làm thụ thể này chuyển thành dạng kết hợp cặp đôi và chuyển sang trạng thái hoạt hóa. Sau đó, vùng domain nội bào của EGFR tự phosphoryl hóa và kích hoạt các protein tiếp theo trong chuỗi phản ứng của con đường tín hiệu RAS/RAF/MAPK và con đường PI3K/AKT. Tín hiệu này cuối cùng gây ra sự tăng sinh tế bào, tăng sinh mạch, biến nạp tế bào và di căn. Cetuximab và panitumumab là những kháng thể đơn dòng kháng EGFR được thiết kế để chặn các con đường truyền tín hiệu EGFR ở domain ngoại bào của EGFR bằng cách cạnh tranh EGFR với EGF, làm cho phối tử này không gắn được vào thụ thể (Hình 1.1)[9]. 11