Tài liệu ứng dụng kỹ thuật nat (nucleic acid) để phát hiện sớm sự có mặt của vi rút hiv, hbv, hcv ở người cho máu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------- Trần Vân Chi ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NAT (NUCLEIC ACID) ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM SỰ CÓ MẶT CỦA VI RÚT HIV, HBV, HCV Ở NGƢỜI CHO MÁU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 TrÇn V©n Chi 1 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------- Trần Vân Chi ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NAT (NUCLEIC ACID) ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM SỰ CÓ MẶT CỦA VI RÚT HIV, HBV, HCV Ở NGƢỜI CHO MÁU Chuyên ngành: Mã số: Vi sinh vật học 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Bạch Khánh Hòa TS. Trần Văn Tuấn XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Giáo viên hƣớng dẫn Chủ tịch hội đồng chấm luận văn thạc sĩ khoa học TS. Trần Văn Tuấn PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2015 TrÇn V©n Chi 2 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Bạch Khánh Hòa; ngƣời thày đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi làm luận văn. Ngƣời thày đƣa tôi đến với Huyết học Truyền máu, ngƣời thày đã truyền cho tôi niềm đam mê với Huyết học Truyền máu. Ngƣời thày đã bồi dƣỡng cho tôi những đức tính trung thực, cần mẫn của một ngƣời làm công tác nghiên cứu từ những ngày đầu tiên bƣớc vào nghề. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến BSCKII. Phạm Tuấn Dƣơng ngƣời đã động viên cho tôi đi học cao học và trong suốt quá trình học. Ngƣời đã tận tình giúp đỡ, dìu dắt tôi trong công tác. Tôi bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến TS. Trần Văn Tuấn ngƣời đã hƣớng dẫn chỉ dẫn, giúp đỡ tôi làm luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ đoàn kết của anh chị em đồng nghiệp trong Khoa Xét nghiệm sàng lọc máu đã giúp tôi hoàn thiện số liệu, mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học và làm luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới: Ban lãnh đạo Viện HHTMTW đã cấp kinh phí cho tôi đi học, các khoa phòng hành chính đã giúp tôi hoàn thành thủ tục học tập, Khoa Di truyền và sinh học phân tử, Khoa Thalassemia, Khoa Hemophilia, khoa HIV viện vệ sinh dịch tễ đã cho phép và giúp đỡ tôi xét nghiệm định lƣợng virus, toàn thể Khối truyền máu đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Phòng sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh học của trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã giúp tôi hoàn thành các thủ tục luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các bậc bố mẹ đẻ, bố mẹ chồng, chồng con đã giúp đỡ động viên, dành tình cảm và điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến ngƣời hiến máu đã cho tôi những số liệu quý báu. Học viên. Trần Vân Chi TrÇn V©n Chi 3 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ i MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................................. iv DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................ v DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ .......................................................................... vi MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3 1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC HIV, HBV, HCV ........................................................... 3 1.1.1. Bệnh viêm gan B, tình hình nhiễm, cơ chế gây bệnh ......................................... 3 1.1.2. Bệnh viêm gan C, tình hình nhiễm, cơ chế gây bệnh ......................................... 9 1.1.3. Bệnh HIV/AIDS, tình hình nhiễm, cơ chế gây bệnh ........................................ 15 1.2. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC HBV, HCV, HIV ...... 22 1.2.1. Xét nghiệm Miễn dịch HBV, HCV, HIV.......................................................... 24 1.2.2. Xét nghiệm sinh học phân tử NAT ................................................................... 25 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 27 2.1. NGUYÊN LIỆU ................................................................................................... 27 2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ ................................................................... 27 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................ 28 2.3.1. Xét nghiệm sàng lọc miễn dịch HBV, HCV, HIV ............................................ 30 2.3.2. Xét nghiệm sinh học phân tử NAT HBV, HCV, HIV ...................................... 33 2.3.3. Quản lý và xử lý số liệu .................................................................................... 41 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 42 3.1. KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM MIỄN DỊCH KHÁNG NGUYÊN KHÁNG THỂ ... 42 3.1.1. Tỷ lệ HBsAg phản ứng ở đơn vị máu hiến ...................................................... 42 3.1.2. Tỷ lệ anti HCV phản ứng ở đơn vị máu hiến ................................................... 44 3.1.3. Tỷ lệ HIV AgAb phản ứng ở đơn vị máu hiến ................................................. 47 3.1.4. Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, HIV ở bệnh nhân nhận máu nhiều lần ..................... 49 TrÇn V©n Chi 4 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc 3.2. KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM NAT HBV, HCV, HIV ............................................ 51 3.2.1. Kết quả xét nghiệm MP NAT ........................................................................... 51 3.2.2. Kết quả xét nghiệm ID NAT ............................................................................. 52 3.2.3. Kết quả xét nghiệm NAT (MP NAT, ID NAT) ................................................ 53 3.2.4. KQXN tƣ vấn ngƣời cho máu NAT phát hiện ở giai đoạn cửa sổ HBV .......... 55 3.2.5. KQXN tƣ vấn ngƣời cho máu NAT phát hiện ở giai đoạn cửa sổ HCV .......... 59 3.2.6. KQXN tƣ vấn ngƣời cho máu NAT phát hiện giai đoạn cửa sổ HIV ............... 62 KẾT LUẬN ................................................................................................................ 67 KIẾN NGHỊ ................................................................................................................ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 69 PHỤ LỤC TrÇn V©n Chi 5 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT NAT: Nucleic acid testing. ADN: Axit deoxiribo nucleic. ARN: Axit ribonucleic. PCR: Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymer chain reaction). IC: Chứng nội (internal control) TMA: Phản ứng khuếch đại qua trung gian (Transcription-Mediated Amplification) CMIA: Hóa phát quang (Chemiluminescent Microparticle Immunoassay) ECLIA: Điện hóa phát quang (Electronic Chemiluminescent Immunoassay). ELISA: Xét nghiệm miễn dịch gắn men (Enzyme – Linked Immunosorbent Assay). EIA: Xét nghiệm miễn dịch men (Enzyme Immunosorbent assay) HBV: Vi rút viêm gan B (Hepatitis B Virus) HCV: Vi rút viêm gan C (Hepatitis C Virus) HIV: Vi rút suy giảm miễn dịch ngƣời (Human immunodeficiency Virus) AIDS: Bệnh suy giảm miễn dịch mắc phải AE: Acridinium Ester Viện HHTMTW: Viện Huyết học - Truyền máu Trung ƣơng. XN: Xét nghiệm. KQXN: Kết quả xét nghiệm MD: Miễn dịch KT: Kháng thể RIAs: Miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassays) TrÇn V©n Chi 6 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Xét nghiệm viêm gan B NAT sàng lọc đơn vị máu [21]........................ 23 Bảng 3.1: Tỷ lệ HBsAg phản ứng bằng xét nghiệm miễn dịch .............................. 42 Bảng 3.2: Tỷ lệ HBsAg ngƣời hiến máu trong nghiên cứu so với các tác giả ...... 43 Bảng 3.3: Tỷ lệ anti HCV phản ứng bằng xét nghiệm miễn dịch ........................... 44 Bảng 3.4: Tỷ lệ anti HCV phản ứng ở ngƣời hiến máu so với các tác giả ............. 45 Bảng 3.5: Tỷ lệ HIV AgAb phản ứng bằng xét nghiệm miễn dịch ........................ 47 Bảng 3.6: Tỷ lệ HIV AgAb phản ứng ở ngƣời hiến máu so với các tác giả ........... 48 Bảng 3.7: Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, HIV ở bệnh nhân nhận máu nhiều lần tại Viện HHTMTW ................................................................................................. 49 Bảng 3.8: Kết quả xét nghiệm MP NAT ................................................................. 52 Bảng 3.9: Kết quả các mẫu xét nghiệm ID NAT .................................................... 52 Bảng 3.10: Tỷ lệ HBV, HCV, HIV phản ứng bằng kỹ thuật MP NAT và ID NAT ................................................................................................................... 53 Bảng 3.11: Tỷ lệ HBV, HCV, HIV phản ứng xét nghiệm ID NAT và MP NAT ở ngƣời hiến máu so với các tác giả ........................................................................ 54 Bảng 3.12: KQXN tƣ vấn ngƣời hiến máu giai đoạn cửa sổ HBV mã số BM2.11573 ................................................................................................... 55 Bảng 3.13: KQXN ngƣời hiến máu giai đoạn cửa sổ HCV mã số ACA.67515 ..... 59 Bảng 3.14: KQXN ngƣời hiến máu giai đoạn cửa sổ HIV mã số ACA.78780 ...... 62 Bảng 3.15: Xét nghiệm ngƣời hiến máu giai đoạn cửa sổ HIV mã số AM9.97435 ................................................................................................... 64 TrÇn V©n Chi 7 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 1.1: Cấu tạo của HBV[63].............................................................................. 6 Hình 1.2: Chu trình sống của HBV [62] ................................................................. 7 Hình 1.3: Sơ đồ chuyển đổi huyết thanh HBV (theo Michael P 2001) .................. 9 Hình 1.4: Mô hình cấu trúc của HCV [66] ............................................................. 11 Hình 1.5: Chu trình sống của HCV [67] ................................................................. 14 Hình 1.6: Sơ đồ chuyển đổi huyết thanh HCV (Michael P 2001) .......................... 15 Hình 1.7: Cấu trúc HIV (Hoffmann, 2007) ............................................................. 17 Hình 1.8: Chu kỳ sống của HIV [65] ...................................................................... 20 Hình 1.9: Sơ đồ chuyển đổi huyết thanh HIV (Michael P 2001) ............................ 22 Hình 1.10: Kỹ thuật Homogeneous áp dụng trong xét nghiệm miễn dịch ............. 25 Hình 2.1: Mô hình nghiên cứu ................................................................................ 29 Hình 2.2: Phản ứng hóa phát quang CMIA (hãng Abbott) ..................................... 31 Hình 2.3: Phản ứng điện hóa phát quang ECLIA (hãng Roche)............................. 33 Hình 2.4: Nguyên tắc bắt giữ trình tự đích (hãng Grifol) ....................................... 35 Hình 2.5: Nguyên lý khuếch đại TMA ................................................................... 36 Hình 2.6: Phản ứng động học DKA qua tín hiện AE .............................................. 37 Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, HIV ở bệnh nhân nhận máu nhiều lần ...... 50 Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ HBsAg, anti HCV, HIV phản ứng ở đơn vị máu các năm 2013, 2014, 2015 ..................................................................................................... 50 Hình 3.1: Kết quả xét nghiệm ID-Cobas® TaqScreen MPX PCR BM2.11573 ...... 58 Hình 3.2: Kết quả xét nghiệm ID-Cobas® TaqScreen MPX PCR mẫu ACA.67515 ..................................................................................................... 61 Hình 3.3: Kết quả xét nghiệm ID-Cobas® TaqScreen MPX PCR mẫu ACA.78780 ..................................................................................................... 63 Hình 3.4: Kết quả xét nghiệm ID-Cobas® TaqScreen MPX PCR mẫu AM9.97435 ..................................................................................................... 65 TrÇn V©n Chi 8 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc MỞ ĐẦU Vi rút là một trong những nguyên nhân gây ra một số bệnh nghiêm trọng ở ngƣời nói chung. Riêng vi rút viêm gan B gọi tắt là HBV (Hepatitis B virus ), vi rút viêm gan C gọi tắt là HCV (Hepatitis C virus), vi rút gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời HIV (Human immunodeficiency virus) là vi rút gây bệnh thông qua đƣờng máu. Các vi rút này biến đổi liên tục về cấu trúc và hệ gen để trốn thoát các loại sinh phẩm xét nghiệm hậu quả là tăng tỷ lệ lây nhiễm trong cộng đồng. Phƣơng pháp xét nghiệm dùng cho sàng lọc HIV, HBV và HCV lây qua đƣờng truyền máu là xác định tác nhân gây bệnh gián tiếp dựa trên kết quả của phản ứng miễn dịch “kháng nguyên-kháng thể”. Ƣu điểm của xét nghiệm là đơn giản, tốn ít thời gian, giá thành hợp lý, song phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là trong giai đoạn “cửa sổ” khi đó kháng thể hoặc kháng nguyên chƣa đạt ngƣỡng phát hiện, do vậy xét nghiệm sẽ cho ra kết quả âm tính. Bên cạnh đó, tƣơng tác không đặc hiệu của kháng thể hoặc kháng nguyên với những bất thƣờng protein khác trong máu có cấu trúc gần giống với kháng nguyên hoặc kháng thể có thể dẫn đến kết quả dƣơng tính giả. Cùng với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật NAT đã đƣợc đƣa vào sử dụng, kỹ thuật này có độ nhạy cao cho phép phát hiện và nhân bản đặc hiệu theo hàm mũ các trình tự đích của tác nhân gây bệnh từ một lƣợng nhỏ vi rút, do đó, cho phép phát hiện sớm và chính xác các tác nhân gây bệnh. Hơn thế nữa, NAT có thể đƣợc sử dụng để phát hiện đồng thời HIV, HBV và HCV thông qua một xét nghiệm trong thời gian là 4-5 giờ, đảm bảo an toàn cho đơn vị máu truyền. Trên Thế giới, ở các nƣớc phát triển, để đảm bảo sàng lọc máu Anh, Pháp, Mỹ, Úc thực hiện xét nghiệm song song giữa phƣơng pháp gián tiếp kháng nguyên – kháng thể và xét nghiệm NAT cho đơn vị máu từ cuối những năm 1990 đầu những năm 2000. Năm 1997, Hội chữ thập đỏ Đức đã sử dụng PCR cho mục đích sàng lọc HCV RNA cho ngƣời hiến máu, tiếp theo là Nhật Bản và Scotland. Sau đó vào tháng 3/1998 ngƣời ta đã giới thiệu NAT cho xét nghiệm HCV RNA[50]. TrÇn V©n Chi 9 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc Ở Việt Nam, hầu hết các phòng xét nghiệm sàng lọc HIV, HBV và HCV đều sử dụng phƣơng pháp xét nghiệm miễn dịch kháng nguyên kháng thể hay còn gọi là xét nghiệm huyết thanh học, xét nghiệm NAT chƣa đƣợc sử dụng. Năm 2008 đề tài cấp Bộ về ứng dụng NAT cho xét nghiệm sàng lọc máu đạt kết quả tốt [3]. Đến năm 2015, Viện HHTMTW thực hiện theo Thông tƣ 26 TT-BYT ngày 16/9/2014 Hƣớng dẫn hoạt động truyền máu, triển khai xét nghiệm NAT đảm bảo an toàn truyền máu. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Ứng dụng kỹ thuật NAT (nucleic acid) phát hiện sớm sự có mặt vi rút HIV, HBV, HCV ở ngƣời cho máu” nhằm hƣớng tới công tác xét nghiệm sàng lọc sớm các tác nhân lây qua đƣờng truyền máu này một cách chính xác, đảm bảo an toàn, chất lƣợng cho máu và chế phẩm sử dụng trong điều trị. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Khảo sát tỷ lệ HBsAg, anti HCV, HIVAgAb phản ứng trên đơn vị máu hiến đƣợc xét nghiệm miễn dịch bằng kỹ thuật CMIA, ECLIA. Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, HIV ở bệnh nhân truyền máu nhiều lần. - Tỷ lệ HBV, HCV, HIV phản ứng phát hiện bằng kỹ thuật NAT (nucleic acid) trên đơn vị máu hiến mà xét nghiệm miễn dịch không phát hiện đƣợc, theo dõi ngƣời hiến máu có phản ứng kỹ thuật NAT, phát hiện sớm hệ gen vi rút nhằm bổ trợ cho xét nghiệm miễn dịch kháng nguyên- kháng thể. TrÇn V©n Chi 10 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong xét nghiệm sàng lọc máu nói riêng và trong chẩn đoán bệnh nói chung, xét nghiệm vi rút luôn là 1 trong những xét nghiệm liên tục đƣợc nâng cấp nhờ có sự biểu biết ngày càng sâu về sinh học phân tử của vi rút. 1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC HBV, HCV, HIV 1.1.1. Đặc điểm sinh học của HBV. 1.1.1.1. Bệnh viêm gan B. Vi rút viêm gan B (HBV) đƣợc phát hiện đầu tiên bởi Blumberg vào năm 1976. Cho đến nay khoa học đã có đƣợc những hiểu biết sâu sắc về dịch tễ học, cách thức truyền nhiễm, cơ chế sao chép phân tử, miễn dịch, các phƣơng thức ngăn chặn hữu hiệu và các phƣơng pháp điều trị đối với HBV. Cho đến nay đã phát hiện đƣợc 5 loại vi rút chính gây nên bệnh viêm gan đó là vi rút viêm gan A,B,C,D,E. Trong đó vi rút viêm gan B là nguy hiểm nhất với tỷ lệ tử vong cao nhất, trung bình hàng năm trên thế giới có 1-2 triệu ngƣời tử vong do vi rút này gây ra[61]. Viêm gan do vi rút hiện nay vẫn là một bệnh rất phổ biến trên toàn Thế giới và luôn là mối quan tâm lớn đối với công tác y tế của toàn cầu. Bệnh có tỉ lệ ngƣời mắc cao và thƣờng gây nên những hậu quả nặng nề nhƣ viêm gan mạn, xơ gan và ung thƣ gan nguyên phát. Viêm gan là tổn thƣơng tại gan với sự có mặt của các tế bào bị viêm trong mô gan. Tình trạng bệnh có thể là tự khỏi hoặc có thể phát triển tới việc gây sẹo tại gan. Viêm gan cấp tính là khi bệnh chỉ kéo dài dƣới 6 tháng, còn viêm gan mãn tính là khi bệnh kéo dài hơn. Theo đánh giá của các nhà nghiên cứu thì không có sự giống nhau về triệu chứng và sự đáp ứng lại liệu pháp kháng vi rút của bệnh nhân mắc bệnh viêm gan mạn tính ở các vùng khác nhau trên Thế giới do có sự khác nhau giữa các kiểu gen của HBV [31,33]. TrÇn V©n Chi 11 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc 1.1.1.2. Tình hình nhiễm HBV Theo Tổ chức Y tế Thế giới thì gần 30% dân số Thế giới, tƣơng đƣơng khoảng 2 tỷ ngƣời có bằng chứng huyết thanh nhiễm HBV. Ƣớc tính khoảng 350-400 triệu ngƣời trong tổng số những ngƣời này mắc viêm gan B mạn tính, và mỗi năm có khoảng 1-2 triệu trƣờng hợp tử vong vì bệnh gan mạn tính, gồm bệnh xơ gan và ung thƣ gan. Châu Á và Tây Thái Bình Dƣơng là vùng lƣu hành cao của HBV, chiếm khoảng 3/4 số nhiễm HBV mạn tính trên Thế giới [38,58,59]. Việt Nam là nƣớc có tỷ lệ hiện mắc viêm gan B cao; ƣớc tính có khoảng 8,6 triệu ngƣời nhiễm vi rút viêm gan B. Tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính đƣợc ƣớc tính khoảng 8,8% ở phụ nữ và 12,3% ở nam giới. Nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính là nguyên nhân chính gây bệnh gan ở Việt Nam nhƣ xơ gan và ung thƣ gan.Tiêm chủng vắc xin viêm gan B cho tất cả trẻ sơ sinh đã đƣợc triển khai từ năm 2003. Tỷ lệ bao phủ của vắc xin viêm gan B năm 2012 là 97% và tỷ lệ bao phủ liều sau sinh tăng lên 75% trong năm 2012 so với 65% của năm 2006. Theo một cuộc khảo sát năm 2011, chỉ còn 2% trẻ dƣới 5 tuổi bị nhiễm vi rút viêm gan B. Việt Nam đang hƣớng tới mục tiêu giảm tỷ lệ hiện mắc viêm gan B xuống dƣới 1% ở trẻ dƣới 5 tuổi vào năm 2017 [12]. 1.1.1.3. Cấu trúc và đặc điểm nhân lên của HBV 1.1.1.3.1. Cấu trúc hình thể HBV HBV thuộc họ Hepadnaviridae, vi rút mang vật chất di truyền là ADN, gây viêm gan. HBV có bộ gen là phân tử ADN chuỗi kép, chiều dài khoảng 3,2 kp. HBV có dạng hình cầu, hình sợi, đƣờng kính trung bình từ 42-45 nm. Vi rút tồn tại dƣới 3 kích thƣớc 20-22 nm, 42-45 nm và 20-200 nm. Vi rút có sức đề kháng tốt với nhiệt độ, ở 1000C trong 30 phút vi rút mới bị chết, ở nhiệt độ thƣờng chúng có thể sống trong thời gian dài từ 5-6 tháng, ở nhiệt độ lạnh thì rất bền vững, chúng có thể sống tới 20 năm ở -200C [8]. TrÇn V©n Chi 12 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc Trƣớc đây, HBV đƣợc phân ra làm 4 kiểu huyết thanh: adr, adw, ayr và ayw dựa trên việc xác định các kiểu kháng nguyên bề mặt vi rút B, tuy nhiên cho đến nay có rất ít dữ liệu về vai trò của các kiểu huyết thanh này. Ngày nay, những tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp khám phá ra sự đa dạng trong trình tự chuỗi ADN của HBV, từ đó đã phân loại HBV thành 8 kiểu gen khác nhau (A-H) dựa vào sự khác nhau trên 8% toàn bộ trình tự chuỗi của hệ gen. Sự phân bố các kiểu gen là khác nhau ở các châu lục và các nƣớc khác nhau. Kiểu A thấy nhiều nhất ở châu Âu, Bắc Mỹ và châu Phi trong khi đó kiểu B và C phổ biến ở Đông Nam Á, kiểu D là dạng chiếm ƣu thế nhất ở Nam Âu cũng nhƣ ở vùng Trung Đông, kiểu E phân bố khắp châu Phi trong khi kiểu F đƣợc tìm thấy ở ngƣời Ấn Độ gốc Nam Mỹ. Kiểu G mới đƣợc tìm thấy gần đây và thấy ở châu Âu và Bắc Mỹ [6,12]. HBV có 3 loại kháng nguyên là HBsAg, HBcAg và HBeAg. HBsAg là kháng nguyên bề mặt của lớp vỏ ngoài lipoprotein của vi rút với các polypeptide có khối lƣợng phân tử khác nhau. Kháng nguyên này thƣờng thấy xuất hiện trong tế bào chất của các tế bào gan của bệnh nhân viêm gan B. Kháng nguyên bề mặt có ở 3 loại vi rút HBV và có sự khác nhau giữa chúng. Có loại HBV mang cả 3 loại kháng nguyên HBsAg đó là HBsAg kích thƣớc lớn, vừa và nhỏ. Có loại HBV chỉ có HBsAg kích thƣớc lớn và vừa, loại HBV hình cầu nhỏ kích thƣớc 20-200 nm chỉ có HBsAg loại nhỏ. Lõi bên trong của vi rút có protein HBcAg, HBeAg, một sợi ADN đơn (-) và enzyme ADN polymerase. Trong tất cả các vi rút đã biết thì HBV là nhỏ nhất. HBcAg là kháng nguyên của capsid, thƣờng thấy trong nhân tế bào gan của bệnh nhân mắc bệnh và chỉ có ở HBV kích thƣớc 42-45nm. HBeAg là protein chƣa biết rõ nguồn gốc nhƣng ngƣời ta cho rằng nó có thể là một phần của HBcAg đã bị biến đổi. Nếu có mặt HBeAg thì chứng tỏ vi rút viêm gan B đang nhân lên mạnh mẽ và bệnh nhân đang ở trạng thái viêm gan nặng rất dễ dẫn đến viêm gan mạn tính và ung thƣ gan [12]. TrÇn V©n Chi 13 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc Hình 1.1: Cấu tạo của HBV[63] 1.1.1.3.2. Hệ gen HBV, chu trình nhân lên của HBV Hệ gen ADN của HBV chỉ đƣợc thấy ở dạng vòng kép. Chuỗi dài hay chuỗi (-) phần lớn là dạng vòng phức và liên kết cộng hóa trị với enzyme reverse transcriptase ở đầu 5’[14,37]. Chuỗi ngắn hay chuỗi (+) có chiều dài chiếm khoảng 50-80% so với chuỗi (-) với đầu 5' cố định và đầu 3' tự do. Gắn với đầu 5' của chuỗi (+) là oligoribonucleotide đƣợc chụp mũ. Hệ gen của vi rút có 4 hệ thống đọc mở đƣợc xê dịch bộ mã hóa cho 4 bản sao mARN. Bản sao dài nhất (3,5 kb) làm khuôn cho quá trình sao chép hệ gen và sự biểu hiện của phần tiền lõi hay lõi và polymerase (pol proteins). Pol có 3 vùng chính là vùng amin đầu cùng, reverse transcriptase và RNase H. Vùng tận cùng của protein cũng đóng vai trò then chốt trong việc đóng gói ARN. Bản sao mã kích thƣớc 2,4 kb mã hóa cho các protein pre S1, pre S2 và HBsAg, trong khi bản sao kích thƣớc 2,1 kb chỉ mã hóa cho các protein pre S2 và HBsAg. Bản sao nhỏ nhất mã hóa cho protein X. Protein X là protein không cấu trúc, nó đóng vai trò nhƣ các protein điều hòa của vi rút và ảnh hƣởng tới số lƣợng protein của nhân trong sự điều khiển chu trình tế bào, sao chép và sửa chữa ADN [14,24,37]. Chu trình sống của HBV bắt đầu khi vi rút gắn vào tế bào vật chủ (tế bào gan). Sự tấn công vào tế bào có sự tham gia trung gian của vùng pre-S1của HBsAg lớn. Sau khi liên kết với thụ thể và virion cởi bỏ lớp vỏ, các nhân của vi rút trong tế bào chất TrÇn V©n Chi 14 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc đƣợc vận chuyển tới nhân bên trong - nơi hệ gen vòng lỏng lẻo và kép đƣợc chuyển thành ADN vòng đóng (cccADN) và tồn tại nhƣ vi thể nhiễm sắc của vi rút. Sự chuyển đổi đƣợc thực hiện bởi các enzyme của tế bào vật chủ. Các vi thể nhiễm sắc của vi rút làm khuôn cho quá trình sao mã 4 loại mARN của vi rút bởi ARN polymerase II của tế bào vật chủ. Các ARN này đƣợc đóng gói và sau đó diễn ra quá trình tổng hợp chuỗi âm và chuỗi dƣơng. Trong các mảnh nhân của tế bào chất, sự sao chép của hệ gen HBV diễn ra nhờ cơ chế tổng hợp không liên tục của chuỗi (-). Cuối cùng, sự hình thành virion theo phƣơng thức nảy chồi trong mạng lƣới nội chất là nơi tất cả các protein bề mặt vi rút viêm gan đƣợc tổng hợp. Sau khi nảy chồi, các virion đƣợc đƣa ra ngoài chủ yếu theo cách vận chuyển của bọng và tiếp tục lây nhiễm sang các tế bào khác. Trong khi tấn công các tế bào gan, HBV không trực tiếp giết các tế bào vật chủ do nó đƣợc giải phóng khỏi tế bào mà không cần dung giải chúng. Vì thế, sự tổn thƣơng của gan là do sự ảnh hƣởng lẫn nhau một cách trực tiếp giữa hệ thống miễn dịch của vật chủ với các tế bào gan bị nhiễm HBV[37]. Hình 1.2: Chu trình sống của HBV [62] TrÇn V©n Chi 15 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc 1.1.1.3.3. Giai đoạn gây bệnh a, Viêm gan cấp tính Thời gian ủ bệnh từ 1 - 6 tháng. Một số bệnh nhân có cảm giác nhƣ bị cảm nhẹ, đôi khi không biết mình bị HBV. Một số khác bị vàng da, mệt mỏi, đau nhức, buồn ói, chán ăn, sốt nhẹ, biến đổi cảm giác (hiện tƣợng đặc biệt là ngƣời nghiền thuốc lá tự nhiên không thích mùi thuốc lá), đau bụng (dƣới sƣờn bên phải). Những trƣờng hợp bị viêm nặng sẽ đƣa đến gan to, khó ngủ, mê muội, lãng trí hoặc bất tỉnh. Biểu hiện lâm sàng: Tăng nhiệt độ, vàng da (1 tuần sau khi bị nhiễm và có thể kéo dài đến 1-3 tháng), gan to, lách to. Hiếm khi thấy bàn tay ửng đỏ[12,16]. b, Viêm gan mạn tính Phần lớn khi bị viêm mạn tính cảm thấy bệnh nhân hoàn toàn bình thƣờng. Một số bị viêm mạn tính nặng thì tiếp tục bị các triệu chứng viêm cấp nhƣ mệt mỏi, chán ăn, đau bụng, và suy gan. Biểu hiện lâm sàng: Gan to, bàn tay ửng đỏ. Khi bị biến chứng xơ gan có thể bị ứ nƣớc trong bụng, vàng da, loãng máu, chảy máu trong dạ dày, tĩnh mạch toả lớn từ rốn (do tăng áp làm giãn tĩnh mạch cửa gan), nam vú lớn nhƣ vú nữ, tinh hoàn teo nhỏ (vì gan yếu làm thay đổi cân bằng của các hormone giới tính) 1.1.1.3.4. Đáp ứng miễn dịch: Khi các vi rút đi vào cơ thể, nó gây ra sự đáp ứng của các hệ thống miễn dịch bao gồm cơ chế phòng thủ bẩm sinh và sự đáp ứng miễn dịch thích ứng với tế bào và các sự đáp ứng miễn dịch của ngƣời đối với các vi rút. Phụ thuộc vào khả năng của các hệ miễn dịch chống lại các vi rút mà bệnh sẽ diễn tiến khác nhau; hoặc khỏi bệnh hoặc bị ung thƣ mạn tính và dẫn đến tử vong [37]. TrÇn V©n Chi 16 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc Hình 1.3: Sơ đồ chuyển đổi huyết thanh HBV (theo Michael P 2001) 1.1.2. Đặc diểm sinh học của HCV 1.1.2.1. Bệnh viêm gan C Trƣớc đây, vi rút viêm gan B đƣợc xem là nguyên nhân chính dẫn đến viêm gan do truyền máu nhƣng sau khi các phƣơng pháp chẩn đoán và phòng ngừa vi rút này đƣợc công bố thì tình trạng viêm gan do truyền máu vẫn tiếp tục xảy ra. Các trƣờng hợp này đƣợc gọi là viêm gan không A, không B và lây sau truyền máu. Tác nhân gây bệnh là một loại vi rút chƣa biết và rất khó xác định. Mãi đến năm 1989, sau nhiều thử nghiệm, nhóm nghiên cứu của Choo [17] đã thành công trong việc nhân dòng một phần kiểu gen của vi rút này, gọi là vi rút viêm gan C và xây dựng thành công phƣơng pháp phát hiện nhờ kháng thể kháng HCV trong máu. Nghiên cứu này cũng chỉ rõ, HCV là thủ phạm chính gây ra các trƣờng hợp viêm gan không A, không B và lây sau truyền máu. Sự nhiễm HCV trong thời gian dài là nhân tố chính dẫn đến viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thƣ gan [46]. Viêm gan C là bệnh truyền nhiễm, chủ yếu ảnh hƣởng đến gan, do siêu vi viêm gan C (HCV) gây ra. Bệnh thƣờng không có triệu chứng, nhƣng viêm mạn tính có thể dẫn đến mô sẹo ở gan và cuối cùng là xơ gan. Nhìn chung, triệu chứng của xơ gan biểu TrÇn V©n Chi 17 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc hiện rõ sau nhiều năm mắc phải. Trong một số trƣờng hợp, bệnh nhân xơ gan sẽ bị suy gan, ung thƣ gan hoặc thực quản và giãn tĩnh mạch dạ dày có thể gây tử vong. HCV đƣợc xếp vào họ Flaviviridae, đƣợc chia thành 6 kiểu gen (genotype) chính và hơn 50 kiểu phụ (subtype) khác nhau. Giữa các kiểu gen khác nhau, trình tự trong hệ gen HCV sai khác khoảng 1/3 còn giữa các kiểu phụ khác nhau trong cùng một kiểu gen thì sự khác biệt ít hơn nhƣng vẫn ở mức đáng kể. Một số nghiên cứu đã tìm thấy có một vài khác biệt trong cách gây bệnh của các kiểu gen, mặc dù bản chất và quy mô của chúng vẫn đang đƣợc bàn cãi. Do đó, kiểu gen HCV có ảnh hƣởng lớn đến quá trình điều trị. Theo tính toán, mỗi ngày trong cơ thể ngƣời bệnh có khoảng 1012 thể HCV mới đƣợc sản sinh [46,60]. 1.1.2.2. Tình hình nhiễm HCV HCV là nguyên nhân chính dẫn đến bệnh viêm gan cấp và mạn tính, gồm cả xơ gan và ung thƣ gan. Vi rút này đƣợc coi là một "sát thủ thầm lặng" do đa số bệnh nhân không có triệu chứng lâm sàng trong suốt thời gian dài nhiễm HCV nên gan bị hủy hoại nặng nhƣng bệnh nhân không biết. Hiện nay, các số liệu về sự lây truyền HCV trong cộng đồng cho thấy vi rút này là một mối lo ngại nghiêm trọng. Tổng cộng trên thế giới có khoảng 200 triệu ngƣời (khoảng 3% dân số thế giới) đang bị nhiễm HCV và 34 triệu ngƣời mới nhiễm mỗi năm 57. Tỷ lệ nhiễm HCV ở các khu vực trên thế giới là khác nhau, trong đó các nƣớc châu Phi và châu Á có tỷ lệ nhiễm cao nhất, có khu vực lên tới >10% dân số. Ở Việt Nam hiện nay, theo số liệu của WHO có khoảng 510% dân số nhiễm HCV. Tỷ lệ nhiễm HCV tại thành phố Hồ Chí Minh là 2,53%, tại tỉnh An Giang là 4,1% và tại Cà Mau là 2,15%. Trong số các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến gan, khoảng 13% có xét nghiệm dƣơng tính với HCV. Tỷ lệ này thậm chí lên tới 2139% 28. Đối với các bệnh nhân bị viêm gan, tỷ lệ có HCV trong máu là khoảng 11%, còn ở các bệnh nhân xơ gan là 12,5% và ung thƣ gan là 8% 9. TrÇn V©n Chi 18 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc 1.1.2.3. Cấu trúc và sự nhân lên của HCV HCV đƣợc xếp vào họ Flaviviridae, là vi rút ARN sợi đơn dƣơng, có hình cầu với đƣờng kính khoảng 55-56 nm. Sợi ARN vi rút đƣợc đóng gói trong vỏ capsid hình thành từ các protein lõi và bao bọc ngoài cùng là lớp vỏ bọc gồm các glycoprotein (hình 1.4). Hệ gen của HCV có kích thƣớc khoảng 9,6 kb vừa là nơi chứa và bảo quản thông tin di truyền, vừa có chức năng nhƣ mARN làm khuôn tổng hợp protein. HCV phân lập đƣợc từ các bệnh nhân thuộc các khu vực khác nhau trên thế giới có thể khác nhau về kích thƣớc hệ gen [17,32]. Cấu trúc ARN của HCV bao gồm hai đầu tận cùng 5’ và 3’ không mã hóa, ở giữa là vùng mã hóa cho protein cấu trúc (C, E1, E2) và protein không thuộc nhóm cấu trúc (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B). Vùng 5’ không mã hóa (5’-noncoding viết tắt là 5’-NC) có tính bảo thủ rất cao, gồm khoảng 341-344 nucleotide. Giữa các sợi HCV riêng biệt, giữa các kiểu phụ và kiểu gen khác nhau thì độ tƣơng đồng về trình tự 5’-NC tối thiểu là hơn 90%. Đây cũng là phần duy nhất trong hệ gen HCV cho thấy sự tƣơng đồng với hệ gen của các vi rút đã biết khác, chẳng hạn, so với các pesti vi rút thì sự tƣơng đồng là khoảng 50% [35]. Chính vì vậy, đây là vùng trình tự lý tƣởng để thiết kế các cặp mồi cho xét nghiệm RT-PCR phát hiện sự có mặt của HCV [15]. glycoprotein sợi ARN Protein lõi Hình 1.4: Mô hình cấu trúc của HCV [66] TrÇn V©n Chi 19 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc Tƣơng tự nhƣ tất cả vi rút khác, HCV không thể tự tái bản vì nó không có đầy đủ các nguyên liệu cần thiết. Vì vậy, để tái bản, vi rút phải nhiễm vào tế bào vật chủ và chiếm lấy bộ máy sao chép của tế bào, bao gồm các enzyme và protein. Sau khi nhiễm vào tế bào vật chủ, các bƣớc tái bản của HCV sẽ xảy ra trong tế bào chất. Cả hai loại protein của tế bào và vi rút đều giúp cho HCV tái bản một cách dễ dàng. Hệ gen của HCV mã hoá cho tối thiểu 10 protein vi rút khác nhau, bao gồm các protein cấu trúc (protein vỏ và protein lõi) giúp hình thành vỏ capsid và các protein không thuộc nhóm cấu trúc (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B) liên quan đến quá trình tái bản của vi rút [35]. Các nghiên cứu gần đây đã làm sáng tỏ chức năng của nhiều protein trong số này. Tuy nhiên, vai trò của một vài protein cũng nhƣ một số khía cạnh của quá trình tái bản vi rút và mối tƣơng quan giữa protein vi rút và tế bào chủ vẫn chƣa đƣợc hiểu một cách đầy đủ. Chu trình tái bản của HCV gồm các bước sau: (i) Gắn vào tế bào vật chủ: HCV gắn vào tế bào chủ nhờ các tƣơng tác giữa lớp vỏ protein của vi rút (protein E1 và E2) với các phân tử là thụ thể bề mặt khảm trên màng ngoài tế bào đích . (ii) Xâm nhập vào tế bào chủ và cởi lớp vỏ bọc, giải phóng ARN vi rút, HCV đi vào tế bào đích chủ yếu do cơ chế ẩm bào nhờ thụ thể 47]. Sau khi HCV gắn lên bề mặt thụ thể, các tế bào đồng hóa thụ thể sẽ hình thành một túi màng mỏng chứa HCV. Sau khi vào trong tế bào, HCV sẽ giải phóng hệ gen vào tế bào chất của tế bào chủ và bắt đầu quá trình tái bản. (iii) Dịch mã hệ gen HCV thành protein vi rút: Khi đƣợc giải phóng, ARN của HCV đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp các protein của nó. HCV sử dụng các thành phần của tế bào chủ, đặc biệt là ribosome để tiến hành dịch mã. Quá trình này chỉ đòi hỏi một vài thành phần trong bộ máy dịch mã của tế bào chủ chứ không phải là tất cả. TrÇn V©n Chi 20 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc