Tài liệu THỰC HÀNH KĨ THUẬT DI TRUYỀN

Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành Khoa Công Nghệ Sinh Học THỰC HÀNH KĨ THUẬT DI TRUYỀN Thực hiện: Th.S MAI THỊ PHƯƠNG HOA Tháng 04/2012 Thực hành kĩ thuật di truyền BÀI 1 TRANG THIẾT BỊ TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 1. Mục đích và yêu cầu Bài thực tập này nhằm giúp cho sinh viên có một cái nhìn tổng quan về sự tổ chức và hoạt động của một phòng thí nghiệm sinh học phân tử điển hình. Các thí nghiệm về sinh học phân tử thường phức tạp và đòi hỏi độ chính xác rất cao. Thời gian cho mỗi thí nghiệm cũng tương đối dài từ một vài giờ cho đến vài ngày hoặc dài hơn, trong quá trình này cần phải sử dụng nhiều thiết bị, hóa chất đắt tiền vì vậy để việc thực tập có hiệu quả, sinh viên cần phải biết những máy móc, trang thiết bị thường dùng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử cũng như tính năng, cách vận hành những máy móc này. 2. Hóa chất và thiết bị máy móc 2.1. Hóa chất Nhìn chung, rất khó để có sự phân loại hóa chất một cách rõ ràng bởi vì mỗi hóa chất được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Ngoài những hóa chất thông thường, phòng thí nghiệm sinh học phân tử sử dụng những hóa chất đặc thù bao gồm: - Các hóa chất sử dụng để tách chiết DNA, ARN và protein từ các đối tượng thực vật, động vật và vi sinh vật. - Các enzyme cắt giới hạn để cắt phân tử DNA thành những đoạn xác định, và enzyme nối các đoạn DNA… - Các hóa chất, enzyme cần thiết để tổng hợp DNA ngoài tế bào nhờ kỹ thuật PCR. - Các hóa chất sử dụng trong điện di, nhuộm màu DNA, protein… - Các hoá chất sử dụng nuôi cấy, chọn lọc vi khuẩn, các chất kháng sinh… - Các chủng vi khuẩn, nấm, virus… 2.2. Thiết bị Trong phòng thí nghiệm nói chung, đặc biệt phòng thí nghiệm về sinh học phân tử thường được trang bị rất nhiều thiết bị và máy móc. Mỗi thí nghiệm 1 Thực hành kĩ thuật di truyền thường phức tạp, kéo dài và sử dụng kết hợp nhiều máy móc. Hơn nữa, một số thiết bị được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. 2.2.1. Hệ thống tủ lạnh Đây là nhóm máy không thể thiếu cho mọi phòng thí nghiệm. Tuỳ thuộc vào yêu cầu sử dụng mà người ta sử dụng các máy làm lạnh khác nhau. • Tủ mát: Nhiệt độ từ 1 - 80C • Bảo quản các mẫu, hạt giống mà vẫn giữ nguyên hoạt tính…. • Bảo quản mẫu DNA, protein trong thời gian ngắn • Bảo quản các mẫu vi khuẩn Tủ lạnh thường: Nhiệt độ từ -100C đến 40C: bảo quản vi khuẩn trong thời gian dài, bảo quản các protein, enzyme, bảo quản các hóa chất chạy PCR, các hoá chất khác Tủ lạnh sâu: nhiệt độ từ -850C đến -300C: bảo quản các chủng giống vi khuẩn lâu dài, bảo quản các enzyme, protein và các hóa chất đặc biệt. Ngoài ra trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử còn có các máy làm đá để giữ lạnh các mẫu trong quá trình làm thí nghiệm. 2.2.2. Buồng cấy vô trùng Cho phép người sử dụng thực hiện các thao tác như: phân lập vi khuẩn, nấm, bào tử, nuôi cấy mô tế bào… trong điều kiện vô trùng. Buồng cấy vô trùng được trang bị các màng để hút, lọc không khí với kích thước lỗ khác nhau để lọc vi khuẩn, virus. Ngoài ra buồng cấy vô trùng còn được trang bị các đèn tử ngoại (UV), đèn chiếu sáng và các phụ kiện cho việc sử dụng gas để khử trùng. Tuỳ thuộc vào mức độ vô trùng mà người ta chia thành các buồng cấy vô trùng theo 3 cấp (cấp I, II và III). Ngoài ra còn hệ thống buống cấy đặc biệt sử dụng cho những thao tác lyên quan đến các virus gây bệnh nguy hiểm. 2.2.3. Nồi khử trùng Ngoài các hình thức khử trùng như khử trùng bằng tia cực tím (UV), Pasteur, màng lọc vô khuẩn…2 hình thức khử trùng được sử dụng phổ biến đó là: Khử trùng khô: Đây là hình thức sử dụng nhiệt độ cao để khử trùng. Để khử trùng người ta bọc các vật cần khử trùng bằng giấy nhôm sau đó đưa vào tủ sấy ở 200 - 3000C từ 2 đến 3 giờ. Loại khử trùng này chỉ sử dụng đối với các 2 Thực hành kĩ thuật di truyền dụng cụ thủy tinh, kim loại. Nhược điểm ở chỗ thời gian khử trùng kéo dài, tiêu tốn điện năng, không diệt được một số bào tử và không áp dụng với những đồ bằng nhựa, giấy.. Khử trùng ướt: Là thiết bị được sử dụng để khử trùng môi trường nuôi cấy, các vi khuẩn, nấm, mầm bệnh và các dụng cụ cần vô trùng khi sử dụng. Thiết bị hoạt động dựa trên cơ sở khử trùng bằng hơi nước ở nhiệt độ và áp suất cao. Thông thường ở 120-1300C trong 30 phút ở áp suất 1atm. Loại khử trùng này nhanh, tiết kiệm điện và có thể tiêu diệt được hầu hết các bào tử, chính vì vậy nó được sử dụng nhiều nhất. 2.2.4. Cân phân tích Là thiết bị sử dụng để cân được một khối lượng chính xác mẫu vật hoặc hóa chất. Tuỳ thuộc và khối lượng của mẫu hoặc hóa chất và mức độ sai số cho phép mà người ta chia cân phân tích thành 2 nhóm: Cân phân tích thường và cân phân tích đặc biệt. Cân phân tích thường sử dụng để cân với lượng tương đối lớn (có thể đến 2000 g) và độ chính xác không cao, sai số khoảng 10 – 2 g, trong khi đó cân phân tích đặc biệt thường chỉ cân với lượng nhỏ (<200 g) và cho độ chính xác từ 10 - 3 đến 10 – 6 g. Tuy nhiên trên thực tế khối lượng nhỏ nhất có thể cân được và chính xác thường chỉ dừng lại ở mức 10 – 3 g. Chính vì thế để pha được những dung dịch có nồng độ thấp người ta sẽ pha một dung dịch gốc (dung dịch mẹ) có nồng độ cao sau đó pha loãng theo ý muốn. 2.2.5. Các dụng cụ hút dung dịch Ngoài các thiết bị hút và đo dung dịch thông thường như: ống đong, cốc đong, các loại pipet, ống hút thủy tinh có vạch mức, phòng thí nghiệm sinh học phân tử sử dụng các dụng cụ hút dung dịch đặc biệt với độ chính xác từ 10 – 4 ml đến 1 ml. Các dụng cụ này được gọi là pipet. Có nhiều loại pipet, tùy thuộc vào ngưỡng thể tích mà người ta chia thành các loại sau: Pipet 1000 - 5000 l; 100 - 1000 l; 10 - 100 l; 2-20 l; 0,5-10 l; 0,1 2,5 l. 3 Thực hành kĩ thuật di truyền Lưu ý khi sử dụng pipet • Pipet là dụng cụ hút chính xác và rất đắt. Bất kỳ pipet nào cũng có giới hạn hút chính xác chính vì vậy chỉ sử dụng pipet để hút một thể tích chất lỏng tương ứng với thể tích ghi trên nhãn. Không được điều chỉnh thể tích vượt quá ngưỡng cho phép. • Trong bất kỳ trường hợp nào cũng không được ngửa phần đầu hút của pipet lên trên để tránh các chất lỏng chảy ngược vào trong piston của pipet. 2.2.6. Các loại máy ly tâm Máy ly tâm được sử dụng để phân tách các thành phần trong dung dịch dựa vào sự khác nhau về khối lượng riêng nhờ tác dụng của lực ly tâm. Căn cứ vào tốc độ quay của roto người ta chia máy ly tâm thành: Máy ly tâm thường: Tốc độ rotor từ 10.000 đến 20.000 vòng/phút Máy ly tâm cao tốc: Tốc độ rotor từ 20.000 đến 40.000 vòng/phút Máy ly tâm siêu tốc: Tốc độ rotor từ 40.000 đến 100.000 vòng/phút Ngoài chức năng hẹn giờ, các máy ly tâm hiện đại còn được trang bị hệ thống làm lạnh để giữ cho mẫu khỏi biến tính khi ly tâm. Một số máy ly tâm, đặc biệt là các máy ly tâm siêu tốc thường có hệ thống rotor với góc quay () không cố 4 Thực hành kĩ thuật di truyền định, tức là góc quay sẽ mở dần trong quá trình ly tâm. Chính vì thế nó còn tăng thêm lực ly tâm bởi một lực văng. Một điểm cần lưu ý là ngoài thông số tốc độ quay tính bằng vòng/phút người ta thường quan tâm đến đơn vị hấp dẫn (g) cho thấy lực ly tâm lớn hơn bao lần lực hút của trái đất (g=9,8m/s2). Công thức chuyển đổi từ vòng/phút sang lực ly tâm (g) như sau: Trong đó:  - tốc độ góc tính bằng 2n (n là số vòng/giây) V - tốc độ quay (vòng/phút) r - khoảng cách xuyên tâm từ trục quay đến điểm xa nhất (tính ở đáy ống ly tâm) đo theo đường nằm ngang (cm) 2.2.7. Máy đo quang phổ Là thiết bị thường được sử dụng để xác định hàm lượng một số chất như Protein, DNA, chlorophil, tinh bột… trong dung dịch dựa vào mức độ hấp thụ cực đại ở các bước sóng ánh sáng khác nhau tương ứng với mỗi loại dung dịch. Dựa vào công thức hoặc đồ thị chuẩn có thể xác định được hàm lượng của các chất. Hiện nay, một số máy hiện đại có thể hiển thị ngay các thông số của dung dịch cần đo như hàm lượng protein, DNA, polysacharide… 2.2.8. Máy đo pH Thiết bị được sử dụng để xác định giá trị pH của một dung dịch. Để đo pH của dung dịch người ta có thể dùng các loại điện cực khác nhau: điện cực hydro, điện cực thủy tinh... trong đó điện cực thủy tinh đang được sử dụng phổ biến. Hiện nay người ta tích hợp nhiều chức năng vào cùng một điện cực chẳng hạn đồng thời có thể đo được pH, nhiệt độ và nồng độ của một số ion nhất định. Một điểm lưu ý khi sử dụng máy đo pH là phải điều chỉnh đúng bằng dung dịch chuẩn của nhà cung cấp và sau khi sử dụng xong phải rửa sạch điện cực bằng nước cất và ngâm ngập điện cực trong dung dịch bảo quản tương ứng của nhà cung cấp, thông thường là dung dịch KCl 3M. 2.2.9. Nhóm các máy khuấy, lắc Đây là nhóm máy tạo ra một dao động lắc với tần số được điều chỉnh tùy ý của người sử dụng. Nhóm máy này được dùng để trộn đề các chất, tránh hiện 5 Thực hành kĩ thuật di truyền tượng vón cục của vi khuẩn, tế bào trong quá trình nuôi cấy. Nhóm này bao gồm các máy sau: Máy lắc: Có giá cài gắn với hệ thống lắc với hệ thống điều chỉnh tốc độ. Ngoài ra một số máy lắc còn được đặt trong một hệ thống giữ ổn định nhiệt độ, loại này thường được dùng trong nuôi cấy vi khuẩn, tế bào động, thực vật (protoplast). Máy khuấy từ: Máy sẽ tạo ra lực từ xoay tròn, nhờ đó khi cho một thanh nam châm vào trong dung dịch, dung dịch sẽ được trộn đều. Một số máy khuấy từ còn được trang bị hệ thống gia nhiệt nhờ đó quá trình hòa tan các chất sẽ nhanh hơn. Máy voltex: Máy này sẽ tạo ra một lực rung, lắc nhằm trộn đều các thành phần trong một hỗn hợp, thường được sử dụng để trộn mẫu. 2.2.10. Máy ủ, định ôn, lò lai phân tử, tủ sinh trưởng Nhóm này bao gồm các thiết bị tạo và giữ cho nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng trong buồng máy luôn ổn định ở điều kiện cài đặt. Máy ủ, định ôn, lò lai phân tử: Là máy có khả năng giữ ổn định ở một nhiệt độ nhất định do người sử dụng cài đặt. Có thể giữ ổn định trong nước (water bath) hoặc trong không khí (incubator). Đối với lò lai phân tử, ngoài việc giữ ổn định nhiệt độ một cách chính xác nó còn được trang bị hệ thống lắc, trộn bên trong. Tủ sinh trưởng: Là máy được trang bị hệ thống điều chỉnh nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng. Hệ thống này thường được sử dụng nhằm tạo ra các điều kiện tối ưu khi nuôi cấy mô tế bào thực vật. 2.2.11. Máy lọc, cất nước Đây là một hệ thống bao gồm các cột lọc để làm sạch nguồn nước trước khi vào máy cất nước. Sau khi đi qua hệ thống cột lọc, nước được đun sôi để bay hơi vào ngưng tụ. Thông thường quá trình này được thực hiện 2 lần (máy cất nước 2 lần) và nước sau khi ngưng tụ sẽ được đi qua hệ thống cột loại bỏ ion hòa tan trong nước (cột anion và cation). Vì vậy nước sử dụng sẽ là nước cất 2 lần, khử ion. Một điểm lưu ý là do chất lượng nước đầu vào của hệ thống nước máy thành phố chưa đảm bảo vì vậy cần phải thay cột lọc thường xuyên để tránh hỏng, tắc máy. 6 Thực hành kĩ thuật di truyền 2.2.12. Lò vi sóng Là thiết bị được sử dụng để đun nóng hóa chất, môi trường nuôi cấy. Nguyên tắc hoạt động của lò vi sóng là cung cấp năng lượng dưới dạng bước sóng cho các phân tử bên trong vật cần đung nóng. Khi được cung cấp năng lượng, các phân tử sẽ dao động và va đập lẫn nhau và tạo nhiệt bên chính bên trong vật chất. Lưu ý không sử dụng các vật đựng bằng kim loại khi sử dụng lò vi sóng để tránh hiện tượng phản xạ các bước sóng. 2.2.13. Tủ sấy chân không Thiết bị bao gồm một tủ sấy được gắn với bơm hút chân không. Tủ sấy chân không được sử dụng để làm khô mẫu, dụng cụ trong điều kiện nhiệt độ cao và áp suất thấp. Trong điều kiện áp suất thấp, nước có thể bay hơi ở nhiệt độ không quá cao chính vì vậy người ta có thể sử dụng để làm khô các mẫu sinh học mà vẫn giữ được hoạt tính của nó. 2.2.14. Hệ thống máy điện di Thiết bị bao gồm nguôn cung cấp dòng điện một chiều ổn định và chính xác, hệ thống máy điện di và các phụ kiện đi kèm. Máy điện di sử dụng để phân tách riêng các thành phần hỗn hợp dựa vào sự khác nhau về kích thước, khối lượng, độ tích điện… dưới tác dụng của lực điện trường. Thông thường người ta sử dụng để tách các thành phần DNA, protein. 2.2.15. Máy PCR Thực chất là một máy gia nhiệt có chương trình điều khiển. Người sử dụng có thể cài đặt các chu trình nhiệt có các bước với nhiệt độ và thời gian tùy thích. 7 Thực hành kĩ thuật di truyền Thiết bị này được sử dụng tạo chu trình nhiệt để khuếch đại một số lượng lớn các bản sao của một phân tử DNA in vitro dựa trên nguyên lý của quá trình sao chép DNA. Hiện nay có nhiều loại máy PCR bao gồm: Máy PCR thường : Người sử dụng có thể cài đặt một chương trình duy nhất cho mỗi lần chạy Máy PCR gradient : Người sử dụng có thể cài đặt nhiều chương trình khác nhau cho mỗi hàng giếng trong máy. Loại máy này thường được dùng để tìm điều kiện tối ưu cho một phản ứng PCR đối với một mẫu DNA nhất định. Máy PCR Kit PCR illustra™ 2.2.16. Máy chụp ảnh DNA Là một hệ thống bao gồm : Máy chiếu tia tử ngoại, màn hình hiển thị và máy in ảnh. Máy chụp ảnh dùng để chụp ảnh các bản điện di DNA. 8 Thực hành kĩ thuật di truyền 2.2.17. Máy chuyển DNA, Protein lên màng Máy được dùng để chuyển các phân tử DNA, protein từ bản gel lên màng nitrocellulose. Đây là thiết bị rất quan trọng dùng trong kỹ thuật lai DNA (Southern blot), lai ARN (Norther blot) và lai Protein (Western blot). 2.2.18. Máy rửa dụng cụ thủy tinh tự động Máy dùng để rửa các dụng cụ thủy tinh bằng dung dịch xà phòng với dòng phun rất mạnh. Tùy từng loại bình có thể đặt các chương trình khác nhau. 2.2.19. Tủ hút Đối với những hóa chất dễ bay hơi hoặc độc hại cần phải thao tác trong tủ hút nhằm giữ an toàn cho người sử dụng và người xung quanh. Đây là một hệ thống bao gồm máy bơm hút và tủ kính chắn. Khí độc sau khi hút được hấp phụ bởi một màng lọc chứa các chất khử độc trước khi thải ra ngoài. 9 Thực hành kĩ thuật di truyền BÀI 2 TÁCH CHIẾT PLASMID TỪ VI KHUẨN E.coli 1.Mục đích yêu cầu - Hiểu được nguyên lý của quá trình tách chiết DNA plasmid, nguyên lý của quá trình điện di. - Hiểu vai trò của từng dung dịch trong quá trình tách chiết - Thao tác đúng theo quy trình và thu được một lượng lớn DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli. - Quan sát sản phẩm PCR và ADN plasmid. 2. Lý thuyết Plasmid: Plasmid là những phân tử DNA nhỏ mạch vòng có khả năng tái bản độc lập và có kích thước 0,05- 10% kích thước của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Chúng có ở nhiều loài vi khuẩn và thường không quan trọng đối với sự sinh trưởng của tế bào. Plasmid có vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về công nghệ DNA tái tổ hợp. Chúng được dùng làm vector để chuyển các đoạn gen ngoại lai vào tế bào chủ. Plasmid BR322 10 Thực hành kĩ thuật di truyền Đặc điểm của vector Plasmid - Có trình tự nhận biết duy nhất cho enzyme cắt giới hạn cụ thể - Có các gen chỉ thị chọn lọc cho phép phát hiện ra các vector có mạng đoạn gen mục tiêu trong tế bào chủ. Gen chỉ thị chọn lọc thuờng là các gen kháng kháng sinh hoặc gen mã hoá protein xúc tác phản ứng tạo màu có thể quan sát được trong môi trường nuôi cấy. - Vector phải có khả năng sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ thuộc sự sao chép bộ gen tế bào chủ. - Vector phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận được một lượng DNA tối đa. Hơn nữa, kích thước vector càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và hiệu quả. - Vector phải tồn tại được trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và phải gây ít xáo trộn nhất cho tế bào chủ. 3. Vật liệu và hoá chất a) Vật liệu: Vi khuẩn E. coli mang vector Plasmid b) Hoá chất Dung dịch I: (phá vỡ màng tế bào): GTE solution: 50 mM glucose, 25 mM Tris-base, 10 mM EDTApH 8,0, khử trùng và bảo quản ở 4oC Dung dịch II: (làm biến tính DNA nhiễm sắc thể) : 0.2 N NaOH, 1% SDS. Dung dịch III: (tủa hỗn hợp SDS-protein, RNA và các DNA nhiễm sắc thể) 5M CH3COOK, 3 M CH3COOH Bảo quản ở nhiệt độ phòng Đệm TE: (hoà tan mẫu DNA): 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5 Cồn tủa: Ethanol 100% Cồn rửa: Ethanol 70% Lysozyme 4. Các bước tiến hành - Cấy chuyển 1 khuẩn lạc đơn vi khuẩn vào 5 ml môi trường LB có bổ sung kháng sinh và nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ 37oC - Chuyển dịch nuôi cấy vào các ống effendorf 1.5 ml và ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi. 11 Thực hành kĩ thuật di truyền - Hòa tan tế bào trong 200 l dung dịch I, voltex mạnh để tế bào trộn đều trong dung dịch. Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Bổ sung 200 l dung dịch II, lắc nhanh vài lần, ủ hỗn hợp trong đá 5 phút - Bổ sung 300 l dung dịch III để lạnh, voltex nhẹ, ủ hỗn hợp trong đá 10 phút. - Ly tâm 14000 vòng/phút, 10 phút ở nhiệt độ phòng. -Hút phần dịch sang một ống effendorf mới, bổ sung 0,5 ml isopropanol hoặc ethanol 100% lạnh, voltex. - Ly tâm 15000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch nổi. - Rửa tủa bằng cách thêm từ từ 0.5 ml ethanol 70%, chắt bỏ cẩn thận, ko làm mất tủa. - Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng trong 10 – 15 phút. - Nhẹ nhàng hòa tan tủa trong 100 l đệm TE 1X. Bảo quản ở -20oC. 12 Thực hành kĩ thuật di truyền BÀI 3 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG DNA 1. Mục đích, yêu cầu 1.1 Mục đích - Sinh viên nắm được các phương pháp định tính và định lượng acid nucleic. - Sinh viên biết cách xác định hàm lượng DNA bằng máy quang phổ và đánh giá được độ tinh sạch của DNA. - Xác định được tính biến tính của DNA 1.2 Yêu cầu - Thao tác chính xác và giải thích được cơ sở của các phương pháp 2. Một số tính chất của DNA - Chất màu trắng, cấu tạo sợi khó tan trong nước nhưng dễ tan ở dạng muối kim loại kiềm và dễ tan trong dung dịch muối. - Có tính chất điện ly, có thể thay đổi cấu hình như co lại hay duỗi ra, có tính chất điện từ. - Bị biến tính bởi nhiệt. - Dung dịch acid nucleic có độ nhớt cao, có tính hoạt quang, tích điện âm nên chuyển dịch trong điện trường về cực dương (phương pháp điện di) - Độ hấp thụ quang phổ ánh sáng cực đại ở bước sóng 256 - 265 nm, cực tiểu bước sóng 230 nm và 195 nm (vùng UV). Sự biến tính và hồi biến * Sự biến tính (denaturation) Sự biến tính là hiện tượng hai sợi đơn của phân tử ADN tách rời nhau, điều này xảy ra khi các liên kết hydro giữa các base bổ sung nằm trên hai sợi bị cắt đứt do những tác nhân vật lý (nhiệt độ) hay hóa học (dung dịch kiềm, formanide, ure). “Nhiệt độ nóng chảy” (melting temperature -Tm) là giới hạn nhiệt độ mà khi đun quá nhiệt độ này, 2 mạch đôi của DNA sẽ tách rời nhau. Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang mạch đơn được xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị mật độ quang (OD - Optical Density). hoặc đo độ nhớt giảm ở điểm nóng chảy. Điểm nóng chảy đặc trưng cho mỗi loại DNA, phụ 13 Thực hành kĩ thuật di truyền thuộc vào số lyên kết hydro (hay phụ thuộc vào tỉ lệ G-X trong phân tử, chiều dài của ADN). Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn gọi là “hiệu ứng tăng sắc”(hyperchromic effect). Nguyên nhân của hiện tượng tăng sắc: trong DNA mạch đôi, các base nằm chồng lên nhau trên những mặt phẳng song song, cấu trúc đó che lấp một phần các base khiến chúng không hấp thu ánh sáng như những đơn vị toàn vẹn khác với DNA mạch đơn. * Hồi tính (renaturation): Các phân tử DNA đã biến tính được điều chỉnh nồng độ muối và nhiệt độ thích hợp (hạ nhiệt độ dần dần), các sợi đơn lại có thể bắt cặp trở lại theo nguyên tác bổ sung để hình thành phân tử ADN ban đầu, đó là sự hồi tính. 3. Phương pháp định lượng DNA Sau khi thu nhận acid nucleic, ta có thể xác định hàm lượng của DNA bằng nhiều phương pháp như đo mật độ quang, điện di, siêu ly tâm, sắc ký, trong đó sử dụng máy đo quang phổ là phương pháp đơn giản nhất và được sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm. 3.1. Nguyên lý của phương pháp đo mật độ quang Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sang tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước song 260 nm (OD260 nm – Optical Density260 nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ ADN trong mẫu dựa vào tương quan sau : Một đơn vị OD260 nm tương ứng với một nồng độ là : - 50 μg/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi. - 40 μg/ml cho một dung dịch ADN hay ARN sợi đơn Hàm lượng DNA được xác định bằng công thức: [DNA] = OD260 x 50 x X (μg) Trong đó X là số lần pha loãng từ dung dịch DNA gốc ban đầu. Phương pháp này đơn giản, nhanh, nhưng có hạn chế là giá trị đọc được về độ hấp thụ có thể bị ảnh hưởng khi trong mẫu chứa RNA và protein. Vì vậy, 14 Thực hành kĩ thuật di truyền trong thực tế phương pháp này thường được dùng để định lượng các mẫu DNA tinh khiết. Độ sạch DNA được xác định bằng tỉ số OD260/ OD280. Nếu tỉ số này > 1,8 thì dung dịch DNA đem đo được coi là sạch. Khái niệm sạch ở đây là lượng protein còn lại trong dung dịch DNA tách được. DNA (ng/l) = [(62,9 x OD260 nm) – (36 x OD280 nm)] x Độ pha loãng OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bước sóng 260 nm. OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bước sóng 280 nm. n: Độ pha loãng (thường n = 100). - Thực hiện: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đường chuẩn. Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thường pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: hút 5 l dung dịch DNA hòa tan với 495 µl TE 1X. Cho vào cuvet để tiến hành đo OD. 3.2. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ - Dung dịch DNA - Dung dịch pha loãng DNA (TE) - Nước cất - Pipet - Ống đong - Máy quang phổ phân tích DNA / RNA - Bếp cách thủy 3.3. Tiến hành - Pha loãng dung dịch ADN ra 50, 100 lần từ dung dịch gốc 50 μl ADN. - Cho 2 ml dung dịch ADN pha loãng vào cuvet và tiến hành đo ra giá trị OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm ghi kết quả thu được. - Lấy 2 ml dung dịch ADN vào ống effpendof đun cách thủy ở nhiệt độ 90 – 1000C (đun nước sắp sôi thì cho ống vào, đun khoảng 2 -5 phút) để làm biến tính ADN. 15 Thực hành kĩ thuật di truyền - Cho 2 ml dung dịch ADN vừa đun nóng vào cuvet và tiến hành ghi giá trị OD260 thu được. - Sau đó làm mát và tiếp tục đo giá trị OD260 để xác định sự hồi tính của ADN. - So sánh kết quả của các lần đo OD ở bước sóng 260 nm (trước khi đun nóng, khi đang nóng và sau khi làm nguội) - Tính hàm lượng ADN trong mẫu sau khi pha loãng. - Tính tỷ số OD260/ OD280 4. Phương pháp định tính DNA Sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose 4.1. Nguyên lý Dựa vào cấu trúc của DNA: là các đại phân tử tích điện âm, do đó khi đặt trong 1 điện trường chúng sẽ di chuyển về phía cực dương. Thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5 – 20kb. 4.2. Vật liệu, hoá chất, dụng cụ: a. Vật liệu: DNA đã được tách chiết từ vi khuẩn, nấm enzyme, thực vật, động vật b. Hoá chất - Đệm chạy điện di TAE 1X - Đệm mẫu (gel loading buffer) - Dung dịch Ethilyum Bromide 0,01% c. Dụng cụ - Bể điện di, Pipet, khuôn gel và lược 4.3. Tiến hành a. Đổ gel agarose - Cân 1 gam agarose cho vào lọ thuỷ tinh chịu nhiệt - Thêm 100 ml dung dịch TAE, lắc đều - Cho vào lò vi sóng, đun cho agarose tan hoàn toàn - Chuẩn bị khuôn và lược đặt thăng bằng - Để nguội gel đến 600C, đổ nhẹ nhàng vào khuôn, tránh tạo bọt - Để cho gel đông lại (15 phút), tháo bỏ lược, cho khuôn gel vào bể điện di b. Chạy điện di 16 Thực hành kĩ thuật di truyền - Đổ đầy TAE 1X ngập khay điện di - Cắt 1 mảnh parafin, hút 2 – 3 µl dung dịch đệm mẫu cho mỗi mẫu DNA - Hút 5µl dung dịch DNA và trộn đều, nhỏ vào các lỗ giếng - Cắm điện cực sao cho dòng điện chạy từ (-) sang (+) - Bật nguồn điện di đặt cố định theo cường độ dòng điện hoặc hiệu điện thế (65 – 70 v) c. Nhuộm Ethilyum Bromide 0,01% - Lấy bản gel ra khỏi máy điện di, nhẹ nhàng lấy riêng phần gel agarose co vào hộp chứa dung dịch Ethilyum Bromide - Nhuộm trong 10 phút - Lấy bản gel ra, rửa bằng cách ngâm trong nước 2 – 3 phút - Đem vào máy quan sát dưới đèn tử ngoại (UV) và chụp ảnh. 17 Thực hành kĩ thuật di truyền BÀI 4 PHƯƠNG PHÁP PCR 1. Giới thiệu chung Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới. 2. Nguyên tắc Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn. Tất cả các ADN polymerase đều cần những mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch đơn - Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung - Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi AND mới giống chuỗi AND gốc. 18 Thực hành kĩ thuật di truyền 3. Các thành phần tham gia thử nghiệm PCR Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần phải có đầy đủ các thành phần sau đây : 3.1. DNA hay nuceic acid đích, tức là chuỗi acid nucleic Phản ứng PCR sẽ khuếch đại lên để chúng có thể được phát hiện trong bệnh phẩm. Phản ứng PCR sẽ không xảy ra được nếu bệnh phẩm không có nucleic acid đích. Một trường hợp khác là trong bệnh phẩm có nucleic acid đích, nhưng do bệnh phẩm được sửa soạn không thích hợp hoặc không đúng cách nên 19