Tài liệu Thử nghiệm chuyển gen gfp trên gà (gallus gallus domesticus) sử dụng vector pt2-bh- cvpf-sb11

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm PHẦN MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việc nâng cao năng suất, cải tiến tiềm năng di truyền là vấn đề hàng đầu trong phát triển nông nghiệp nói chung và chăn nuôi nói riêng. Tuy nhiên, trong công tác cải tạo giống cổ truyền chủ yếu sử dụng phương pháp lai tạo và chọn lọc để cải tạo nguồn gen của vật nuôi nên còn tồn tại nhiều hạn chế (con lai thu được qua lai tạo và chọn lọc vẫn còn mang cả các gen không mong muốn…). Vậy, một câu hỏi đặt ra là làm sao để tạo được những giống vật nuụi cú năng suất cao, phẩm chất tốt và những giống vật nuôi mang nhưng gen mong muốn (gen mã hóa những protein dược liệu quý, gen có khả năng chống chịu tốt...) [2],[9]? Gần đây, nhờ những thành tựu trong lĩnh vực ADN tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại nói trên. Nó cho phép chỉ đưa những gen mong muốn vào vi sinh vật, thực vật và động vật để tạo ra những giống sinh vật có đặc tính mới. Việc chuyển gen không chỉ dừng lại ở việc sử dụng nguồn gen cùng loài mà còn có thể đưa gen của loài này vào loài khác. Kể từ những năm 1970, các nhà khoa học đã có thể chuyển một gen lạ vào vi khuẩn và bắt nó biểu hiện. Ở động vật, quá trình chuyển gen tương đối phức tạp nhưng trong những năm gần đây cũng đã thu được nhiều thành tựu đáng kể. Trong hướng này các nhà nghiên cứu tập trung vào những mục tiêu: tạo ra động vật chuyên sản xuất protein quý phục vụ y học; tạo ra động vật có sức chống chịu tốt, có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho năng suất cao và chất lượng sản phẩm tốt... Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu các bệnh ở người để nhanh chóng tìm ra các giải pháp chẩn đoán và điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, AIDS, Nguyễn Thị Hồng Hạnh 1 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm thần kinh, tim mạch... Việc tạo ra các động vật chuyển gen đã trở thành một khía cạnh nghiên cứu trung tâm trong lĩnh vực sinh sản động vật và tạo giống vật nuôi [2],[11]. Với những ưu điểm nổi bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã, đang và sẽ tạo ra các tiềm năng phát triển vô cùng to lớn trong nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội. Trước các ứng dụng đa năng của sinh vật chuyển gen nói chung và động vật chuyển gen nói riêng, nhiều quốc gia trên thế giới đã chú trọng đầu tư nghiên cứu và phát triển sinh vật chuyển gen. Trên cơ sở công nghệ ADN tái tổ hợp, ngành chăn nuôi đang đứng trước những cơ hội thay đổi có tính cách mạng. Ngày nay người ta có thể tạo ra những động vật mang các đặc tính kỳ diệu mà bằng phương pháp lai tạo bình thường không thể thực hiện được. Quá trình chuyển gen ở động vật đã được tiến hành thành công trên nhiều đối tượng khác nhau như chuột, cá, thỏ, lợn, cừu, bò... Đặc biệt, ở gà, do cấu tạo và sinh lý có nhiều ưu thế để tiến hành chuyển gen nờn đó có nhiều thí nghiệm chuyển gen thành công với tỉ lệ cao, rất thuận lợi cho việc cải thiện tính hiệu quả của hệ thống chuyển gen một cách trực tiếp. Đõy chớnh là đối tượng tuyệt vời để sản xuất protein tái tổ hợp trong trứng. éõy là một bước quan trọng để tiến đến mục tiêu nhân giống gà mái có thể đẻ những “quả trứng vàng” mang protein dược phẩm [32]. Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gen và cũng bắt đầu đạt được những thành công đáng khích lệ. Tuy nhiên, ở nước ta, việc tạo động vật chuyển gen vẫn còn là vấn đề chưa được nghiên cứu sâu. Việc nghiên cứu mới được bắt đầu vài năm gần đây và mới thực hiện được ở trên đối tượng là cá. Đó mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu, chúng ta cần có những nghiên cứu với quy mô sâu rộng hơn để có thể Nguyễn Thị Hồng Hạnh 2 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm đưa những động vật chuyển gen vào sản xuất. Hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trình nào công bố về chuyển gen thành công tạo gia cầm chuyển gen. Chớnh vì những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Thử nghiệm chuyển gen GFP trên gà (Gallus Gallus Domesticus) sử dụng vector pT2/BHCVpf-SB11 bằng phương pháp chuyển gen qua tinh trùng và vi tiêm vào phôi gà 0 giờ ấp” làm đề tài nghiên cứu của mình. 2. Mục đích nghiên cứu - Thiết lập quy trình chuyển vector pT2/BH-CVpf-SB11 vào phôi gà 0 giờ ấp. - Đánh giá khả năng phát triển của phôi được tiêm vector pT2/BHCVpf-SB11 - Ấp nở thành công trứng gà đó tiờm vector pT2/BH-CVpf-SB11 - Hoàn thiện phương pháp chuyển gen qua tinh trùng gà - So sánh được hiệu quả chuyển gen của phương pháp vi tiêm vào phôi 0 giờ ấp và phương pháp chuyển gen qua tinh trùng gà. - Đánh giá được sự biểu hiện của gen chuyển ở các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi gà và gà sau khi nở. - Đánh giá được sự biểu hiện của gen chuyển ở cỏc mụ khác nhau của gà con ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Nguyễn Thị Hồng Hạnh 3 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm PHẦN NỘI DUNG Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CHUYỂN GEN Ở ĐỘNG VẬT Sự ra đời của công nghệ sinh học và kỹ thuật chuyển gen đã tạo ra một bước phát triển mới cho nền nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Chuyển gen là việc di chuyển các gen từ cấu trúc di truyền ban đầu gọi là thể cho (donor) tới một cấu trúc di truyền khác có khả năng dung nạp gen gọi là thể nhận (recipient) thông qua một vector [9]. Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong ADN genome của nó. Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm. Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau [2]. Với những ưu điểm nổi bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã, đang và sẽ tạo ra các tiềm năng phát triển vô cùng to lớn trong nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội. Trước các ứng dụng đa năng của sinh vật chuyển gen chung và động vật chuyển gen nói riêng, nhiều quốc gia trên thế giới đã chú trọng đầu tư nghiên cứu và phát triển sinh vật chuyển gen. 1.1.1. Quy trình tạo động vật chuyển gen Ở động vật, những nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc tạo ra các thế hệ động vật mới cho năng suất cao, phẩm chất tốt, tăng khả năng chống chịu bệnh tật, có khả năng sản xuất được các loại protein quý hiếm rất cần trong trị liệu... Quy trình tạo động vật chuyển gen thể hiện qua hình 1.1, gồm các bước sau: Nguyễn Thị Hồng Hạnh 4 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Hình 1.1: Sơ đồ quy trình tạo động vật chuyển gen [2] - Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật - Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân. Ở giai đoạn này, tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của hợp tử và phân chia cho các tế bào con làm tăng khả năng mang gen của tế bào sinh dục. - Chuyển gen vào động vật Hiện nay có nhiều phương pháp khác chuyển gen nhau đang được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen bằng cách sử dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách sử dụng vector virus, xung điện, chuyển gen qua tinh trùng, chuyển gen vào trứng mới thụ tinh... (hình 1.2) - Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm và chuyển vào tử cung cơ thể mẹ (đối với động vật bậc cao) - Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen - Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục [2]. Nguyễn Thị Hồng Hạnh 5 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm A B Hình 1.2: Một số phương pháp chuyển gen ở động vật [2] A: Chuyển gen nhờ retovirus; B: Chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm 1.1.2. Ứng dụng của động vật chuyển gen a. Trong nghiên cứu cơ bản Chuyển gen là một công cụ lý tưởng cho việc nghiên cứu thuộc nhiều lĩnh vực của y - sinh học. Trong sinh học phân tử, động vật chuyển gen được sử dụng để phân tích sự điều hoà biểu hiện của gen để đánh giá một biến đổi di truyền đặc biệt ở mức độ toàn bộ cơ thể động vật. Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng để nghiên cứu trong di truyền học phát triển ở động vật có vú [2]. b. Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm Công nghệ chuyển gen động vật ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại của phương pháp cải tạo giống cổ truyền để tạo ra các động vật biểu hiện các tính trạng mong muốn trong một thời gian ngắn hơn và chính xác Nguyễn Thị Hồng Hạnh 6 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm hơn. Mặt khác, nó cho các nhà chăn nuụi một phương pháp hiệu quả để tăng sản lượng, tăng năng suất và khả năng chống chịu bệnh tật. Các nhà khoa học đã tạo ra các vật nuôi chuyển gen có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho năng suất cao (nhiều thịt, nhiều sữa, nhiều trứng...), chất lượng sản phẩm tốt (nhiều nạc, ít mỡ, sữa chứa ít cholesterol...) và có khả năng kháng bệnh [24],[30]. Năm 1985, giáo sư Zuoyan Zhu và nhóm nghiên cứu của ụng đó chuyển được gen hormone sinh trưởng người vào cá. Theo Zhu thì thế hệ F1 của cỏ đó được chuyển gen này lớn gấp hai lần so với cá đối chứng (hình 1.3) [2]. Hình 1.3: Cá chép (Common carp) chuyển gen hormone sinh trưởng [2]. c. Trong y học Động vật chuyển gen được sử dụng trong công nghệ cấy ghép cơ quan cho các bệnh nhân mắc các bệnh như tim, gan, thận… Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu các bệnh ở người để nhanh chóng tìm ra các giải pháp chẩn đoán và điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, AIDS, thần kinh, tim mạch... [19] Liệu pháp gen người bao gồm cả việc thêm một bản sao gen bình thường (gen chuyển) vào genome của một người mang các bản sao gen có thiếu sót để chữa các bệnh di truyền ở người. Nguyễn Thị Hồng Hạnh 7 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Trong kỹ nghệ dược phẩm, động vật chuyển gen được sử dụng để sản xuất protein dược phẩm, thuốc chữa bệnh (hình 1.4) [2],[24]. Hình 1.4: Sơ đồ quy trình tạo động vật chuyển gen sản xuất protein thông qua tuyến sữa [2]. 1.1.3. Khả năng ứng dụng tại Việt nam Động vật chuyển gen đã và đang trở thành một xu hướng nghiên cứu và phát triển. Việc nghiên cứu và tạo động vật chuyển gen để tạo ra các dược phẩm, sản xuất các protein quý và các sản phẩm của chúng đang thực hiện ở nhiều nước trên thế giới. Việc chuyển gen vào động vật hiện nay đang gặp những rào cản về pháp lý và đạo đức. Nhiều người lo sợ rằng tạo động vật chuyển gen đe dọa phá vỡ sự cân bằng hệ sinh thái hoặc động vật chuyển gen có khả năng sinh sản thấp, nếu lai với động vật tự nhiên có thể làm giảm khả năng sinh sản, giảm số lượng, đe dọa sự tồn tại của loài. Một số trường hợp Nguyễn Thị Hồng Hạnh 8 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm động vật chuyển gen có khả năng kháng bệnh kém hoặc có biểu hiện bệnh lý. Khả năng trôi dạt của những dòng gen có thể gây ra hiểm hoạ đối với môi trường sinh thái. Bên cạnh đó, khi sử dụng retrovirus làm vector có thể sẽ nảy sinh những nguy cơ không thể lường trước được (loại virus thường chứa gen gây ung thư). Thêm vào đó, động vật chuyển gen sử dụng làm thực phẩm cũng không đạt được sự ủng hộ của công chúng [9],[19]. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về áp dụng công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghệ gen được phát triển khá mạnh mẽ trong những năm gần đây. Nghiên cứu chuyển gen đã được tiến hành ở nhiều cơ sở nghiên cứu như Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ sinh học - Đại học quốc gia Hà Nội…. Ở động vật, những nghiên cứu chuyển gen mới được bắt đầu và chủ yếu thực hiện ở cá chạch, cá vàng với tổ hợp gen hormone sinh trưởng bằng vi tiêm. Ở Việt Nam, chưa có công trình nào công bố thực hiện thành công việc chuyển gen vào gia cầm và động vật có vú. Tuy nhiên, các kỹ thuật liên quan đến việc tạo động vật chuyển gen thỡ đó được tiếp cận và thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu. Với điều kiện cơ sở vật chất và con người ở các cơ quan nghiên cứu ở nước ta, việc kết hợp nghiên cứu để tiến hành chuyển gen vào động vật có vú là hoàn toàn có thể thực hiện được [2],[19]. 1.2. CHUYỂN GEN Ở GÀ Công nghệ chuyển gen ở gà mới phát triển trong những năm gần đây, trong khi công nghệ chuyển gen ở động vật có vú đã phát triển từ trước đó một thời gian dài. Chuyển gen ở gia cầm nói chung và gà nói riêng là vô cùng phức tạp và khó khăn. Tuy nhiên, gà lại là đối tượng có nhiều tiềm năng cho công nghệ chuyển gen. Tại sao các nhà khoa học lại chọn gà làm đối tượng chuyển gen? Để hiểu được những lợi thế của mô hình gà chuyển gen, chúng ta sẽ tìm hiểu sự phát triển của phôi gà và sinh lý sinh dục gà. Nguyễn Thị Hồng Hạnh 9 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm 1.2.1. Sự phát triển của phôi gà 1.2.1.1. Sự phát triển phôi trước khi đẻ 1.2.1.1.1. Thụ tinh Quá trình thụ tinh xảy ra ở phần trên của ống dẫn trứng. Khi trứng rụng được hứng vào phễu của ống dẫn trứng. Tại đây, tinh trùng đến và xâm nhập vào tế bào trứng. 1.2.1.1.2. Sự phân cắt Hình 1.5: Quá trình phân cắt trứng và tạo phôi nang ở gà [41] Trứng gà thuộc loại đoạn noãn hoàng (teloleciathal) có nghĩa là noãn hoàng tập trung ở cực thực vật của trứng cũn nhõn và tế bào chất tinh khiết ở cực động vật. Phân cắt ở phôi gà là dạng phân cắt đĩa (phân cắt không hoàn toàn) (hình 1.5). Noãn hoàng không phân cắt và không có cấu tạo tế bào, còn đĩa phôi phân chia tạo thành một cụm hình đĩa các tế bào nhỏ nằm bên trên khối noãn hoàng. Sự phân cắt bắt đầu từ trung tâm của đĩa phôi và cỏc rónh phân cắt dần dần phân chia vùng này ra thành các tế bào [5],[26]. Nguyễn Thị Hồng Hạnh 10 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm 1.2.1.1.3. Giai đoạn tạo phôi nang Vào lúc trứng được đẻ ra, ở đĩa phôi xuất hiện 2 vựng riờng biệt: Vựng sáng (area pellucida) chủ yếu là từ các tế bào trung tâm của đĩa phôi. Vùng mờ (area opaca) tạo nên do các tế bào ở vùng rìa. Ngay sau đó các tế bào vựng rìa phớa đuụi của đĩa phôi di cư về phía đầu nhập với các tế bào di cư từ phía trên tạo thành lá dưới thứ cấp. Xoang giữa lỏ trờn và lá dưới gọi là xoang phôi nang [5]. 1.2.1.2. Sự phát triển phôi gà sau khi đẻ và được ấp 1.2.1.2.1. Giai đoạn tạo phôi vị Tạo phôi vị ở gà là quá trình di chuyển các cụm tế bào hoặc các khu vực lỏ trờn để tạo phôi ba lá. Các tế bào ở nửa sau của đĩa phôi mới đi vào trong và xuống dưới để tạo trung bì và nội bì, nửa trước di chuyển để phủ kín phần các tế bào đã xuống dưới và hình thành ngoại bì (trong đó có cả ngoại bì thần kinh). Các tế bào đi qua rónh nguyờn thuỷ đầu tiên là nguyên liệu nội bì, phần đi xa về phía trước sẽ tạo ra ruột trước, phần nguyên liệu dịch về phía sau sẽ tạo ruột giữa và ruột sau. Tiếp sau nội bì, nguyên liệu trung bì đi qua hố nguyên thuỷ và phần trước của rónh nguyờn thuỷ vào xoang phôi nang, phần đi qua mép phía trước của hố nguyên thuỷ tạo nên trung bì trục, sau này sẽ hình thành đầu và dây sống [4],[5]. 1.2.1.2.2. Giai đoạn hình thành mô – cơ quan Hình 1.6: Phôi gà phát triển qua các giai đoạn [65] Nguyễn Thị Hồng Hạnh 11 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Khi được ấp, phôi gà trải qua 1 loạt các biến đổi bao gồm sự tăng sinh tế bào kết hợp với sự xắp xếp lại cấu trúc phôi sau đó là các quá trình biệt hóa. Bốn ngày ấp đầu tiên của sự phát triển phôi gà là sự hình thành các cấu trúc quan trọng. Quá trình biệt hóa và hình thành cơ quan biểu hiện ở việc sự xuất hiện mầm các cơ quan có nguồn gốc từ nội bì, ngoài ngoại bì và trung bì (hình 1.6 và phụ lục 2) [4],[5]. 1.2.2. Sinh lý sinh sản gà 1.2.2.1. Cơ quan sinh sản của gà mái Sự hình thành buồng trứng và các tuyến sinh dục phụ xảy ra vào thời kỳ đầu của sự phát triển phôi. Quá trình phát triển của tế bào trứng có ba thời kỳ: tăng sinh, sinh trưởng và chín. Mặc dù trong giai đoạn phát triển phụi, phụi cỏi phát triển cả hai buồng trứng nhưng buồng trứng bên phải và ống dẫn trứng thoỏi hoỏ đi, do đó chỉ còn buồng trứng bên trái và ống dẫn trứng bên trái là trưởng thành và thực hiện chức năng. Cơ quan sinh dục gà mái gồm một buồng trứng và một ống dẫn trứng: * Buồng trứng: Hình 1.7: Cấu tạo buồng trứng gà [52] 1: nang trứng chín; 2: nang trứng non - Buồng trứng là một cụm các nang trứng. Khi gà nở buồng trứng chứa vài ngàn trứng nhỏ, mỗi trứng trong nang riêng của mình. - Kích thước và hình dạng buồng trứng phụ thuộc vào tuổi gà, buồng trứng gà giống như một chùm nho với các nang trứng ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Nguyễn Thị Hồng Hạnh 12 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm * Tế bào trứng: Trứng gà là một tế bào khổng lồ chứa rất nhiều noãn hoàng, đú chớnh là khối lòng đỏ. Lòng đỏ có cấu tạo phân lớp, một lớp noãn hoàng nhạt rồi đến một lớp noãn hoàng sẫm đồng tâm kế tiếp nhau. Nhân của trứng nằm ở phần tế bào chất tinh khiết tạo thành một đĩa có tỉ lệ rất nhỏ so với khối noãn hoàng. Bao quanh tế bào trứng có màng noãn hoàng (hình 1.8) [52]. B A Hình 1.8: Trứng gà nhìn dọc (A) [60] và nhìn ngang (B)[52]. * Ống dẫn trứng: Ống dẫn trứng là một ống dài. Khi thành thục sinh dục, ống dẫn trứng trơn, thẳng và có đường kính đồng nhất theo chiều dài ống dẫn (hình 1.9)[52]. Hình 1.9: Cấu tạo của ống dẫn trứng [52]. Nguyễn Thị Hồng Hạnh 13 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mỗi phần của ống dẫn trứng có chiều dài và chức năng khác nhau, thể hiện như sau [51]: Các phần của ống dẫn trứng Phần phễu Đoạn lòng trắng Chiều dài 5 cm Thời gian trứng di chuyển tại đó 15 phút 33 cm 3 giờ Phần eo 10 cm 1,25 giờ Tử cung 10,7 cm 20, 75 giờ Âm đạo 10 cm - Chức năng - Hứng trứng chín và thực hiện quá trình thụ tinh - Hình thành 40 -50 % albumin trong lòng trắng trứng - Hình thành 2 lớp màng vỏ - Hình thành tiếp 10% Albumin - Hình thành 40% albumin, hình thành lớp vỏ đá vôi - Hình thành lớp phấn phủ lên trứng - Trứng đi qua khi gà đẻ. * Sự tạo trứng và tạo vỏ trứng: Sau khi giao phối, tinh trùng di chuyển trong ống dẫn trứng, tập trung tại phần phễu. Khi trứng đi qua, một tinh trung xuyên thủng màng noãn hoàng, gặp tế bào trứng, hoàn thành quá trình thụ tinh. Sau đó màng noãn hoàng dầy lên, ngăn cản sự xâm nhập của các tinh trùng khác. Quỏ trình phân cắt trứng diễn ra khi trứng di chuyển dần xuống phía dưới. Noãn bào ở trong đoạn phễu của ống dẫn trứng khoảng 15 phút, sau đó di chuyển xuống đoạn lòng trắng. Tại đây, hợp tử được phủ bởi 1 lớp albumin. Sau đó hợp tử di chuyển xuống phần eo rồi đến tử cung. Khoảng 23 24h sau khi rụng, trứng được đẻ ra ngoài [52],[60]. 1.2.2.2. Cơ quan sinh sản của gà trống và thành phần tinh dịch gà 1.2.2.2.1. Cơ quan sinh sản của gà trống Cơ quan sinh sản gà trống gồm: tinh hoàn, hệ thống ống dẫn và cơ quan giao phối (hình 1.10): * Tinh hoàn: có kích thước thay đổi tùy thời kỳ hoạt động sinh dục, với gà trống trưởng thành, thời kỳ đang hoạt động sinh dục, tinh hoàn dài khoảng 4,7 cm, rộng khoảng 2,7 cm và khối lượng khoảng 17 - 19 gram; khi thay Nguyễn Thị Hồng Hạnh 14 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm lông, giảm còn 3 - 5 gram. Khác với sự sắp xếp ở loài có vú, các ống sinh tinh trong tinh hoàn gia cầm không tập hợp thành cỏc thùy rõ rệt được vây quanh bởi các mô liên kết, mà các ống sinh tinh nối lại với nhau thành nhánh nằm trong lớp vỏ màng liên kết trắng [1]. Hình 1.10: Cấu trúc hệ sinh dục gà trống [1] 1: Tinh hoàn; 2: ống dẫn tinh; 3: trực tràng; 4: huyệt * Hệ thống ống dẫn: Tinh trùng từ các ống sinh tinh, đi qua mạng lưới tinh hoàn đến các ống dẫn ra. Từ ống dẫn này, tinh trùng đi qua hàng loạt ống kết nối và được chuyển đến ống tinh hoàn phụ. Ống tinh hoàn phụ đổ vào ống dẫn tinh ra. Ống dẫn tinh ra là một ống có độ uốn lượn cao và ở đầu cuối thì duỗi thẳng và to hơn [1]. * Cơ quan giao phối: ở gà không phát triển, chỉ là một gai giao cấu để tiếp xúc với âm đạo và được lộn ra khi giao phối. 1.2.2.2.2. Đặc điểm cấu trúc của tinh trùng gà Quá trình sản sinh tinh trùng ở gia cầm cũng tương tự như ở động vật có vú. Tinh trùng gia cầm có dạng hình sợi, phân biệt rõ 2 phần: đầu, đuôi. Đầu tinh trùng gà dài, hơi cong, acrosome hình nón, được bọc bởi một màng acrosome liên tục, không có đoạn xích đạo hoặc một phiến đặc sau acrosome điển hình như ở tinh trùng động vật có vú mà có một khoảng trống dưới Nguyễn Thị Hồng Hạnh 15 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm acrosome. Đuôi tinh trùng gồm đoạn cổ (tương ứng với đoạn cổ của tinh trùng động vật có vú), đoạn giữa (tương ứng với phần thân) và đoạn chớnh (tương ứng với phần đuôi) [1]. 1.2.2.2.1. Thành phần của tinh dịch gà Tinh thanh gà là một dịch lỏng đặc biệt có chứa khoảng 50 - 60 chất gồm: muối, protein, một số axit amin [1]. Trong TTNT gà cần chú ý đến thành phần chất "dịch thể trong suốt" trong tinh thanh. Chất "dịch thể trong suốt" (do mô cương cứng của lỗ huyệt tiết ra) được tiết vào trong tinh dịch là do khi lấy tinh, động tác ép và nặn lỗ huyệt quá mạnh làm cho một số tiểu thể của máu, bạch huyết, các urate... trong mô cương cứng của lỗ huyệt được giải phóng ra. Chất "dịch thể trong suốt" không gây nguy hại cho tinh trùng khi dẫn tinh bằng tinh dịch tươi, còn khi tinh dịch có lẫn "dịch thể trong suốt" và được bảo tồn 24 giờ rồi mới dẫn tinh thì tỉ lệ phôi sẽ giảm [1]. 1.2.3. Thuận lợi và khó khăn khi sử dụng gà làm đối tượng chuyển gen Từ những đặc điểm trên, ta thấy gà có nhiều thuận lợi cho quá trình chuyển gen, nhưng bên cạnh đó cũng có một số khó khăn: 1.2.3.1. Thuận lợi - Thời gian thế hệ ngắn: Gia cầm nói chung và gà nói riêng có thời gian thế hệ ngắn, tốc độ sinh trưởng cao. Khoảng cách thế hệ ở gà là 20 tuần. Khi đó con khảm ở mức độ cao có thể tạo ra protein trong trứng của chúng. Trái với động vật có vú phải mang thai trước khi cho sữa, gà sẽ đẻ trứng mang protein ngay khi nó thành thục sinh dục [41]. - Năng suất trứng cao: hàng năm mỗi gà mái có thể đẻ xấp xỉ khoảng 330 quả trứng. Trứng thụ tinh rẻ và có thể bảo quản được từ 1- 2 tuần ở 15oC. Tuy nhiên so với động vật có vú, thuận lợi lớn nhất của phôi gà là không cần con mẹ để phát triển [41]. Nguyễn Thị Hồng Hạnh 16 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm - Kích thước thích hợp cho điều khiển và dễ dàng trong quản lý đối với quá trình sản xuất với số lượng lớn, trứng có môi trường vô trùng tự nhiên... nên tỉ lệ chuyển gen thành công tương đối cao [15]. - Quan trọng nhất, với thành phần protein đơn giản của trứng làm cho công việc tách chiết các protein khác nhau từ trứng và tinh chế các nguyên liệu mong muốn một cách dễ dàng [15]. - Hơn nữa, sự di cư của tế bào mầm sinh dục trong mạch máu, điều này chỉ có thể được quan sát ở các loài gia cầm, làm cho các tế bào mầm sinh dục mang gen lạ có thể được cấy ghép vào phôi với mục đích chuyển gen có hiệu quả thông qua quá trình truyền dòng sinh cho thế hệ sau [15]. 1.3.2.2. Khó khăn - Không như các động vật khác, việc nghiên cứu chuyển gen ở gà gặp phải một số hạn chế nhất định. Ở động vật có vú và cá, trứng là một tế bào có tiền nhân có thể được nhìn thấy để vi tiêm ADN ngoại lai vào. Trong khi đó trứng gà ngay khi vừa được đẻ ra, phôi đã bắt đầu phát triển và chứa khoảng 40.000-60.000 tế bào [2],[41]. - Trứng gà sau khi đẻ thì trứng lớn, dễ vỡ và khó thao tác. Vi tiêm vào trứng mới thụ tinh là rất khó bởi vì trứng được bao bọc với màng có nhiều dịch nhày (mucin) trong 15 phút sau khi rụng trứng. Ngay sau đó được bao bọc bởi khối lòng trắng dày và một vỏ trứng. - Việc tạo ra gà chuyển gen còn bị cản trở bởi đặc tính riêng biệt của hệ thống sinh sản gia cầm. Những khó khăn chính gặp phải là khó tiếp cận giai đoạn phôi sớm của chúng. Để lấy được trứng đã thụ tinh (hoặc trứng chưa thụ tinh từ gà mái), gà mái bị giết sau 2 - 2,5h rụng trứng, khi trứng đang ở dạ con. Việc tính toán đúng thời điểm này là rất phức tạp [41]. Nguyễn Thị Hồng Hạnh 17 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Với mục đích vượt qua những giới hạn này, sự chuyển gen qua trung gian các tế bào phụi, cỏc tế bào sinh dục nguyên thủy và các tế bào tinh trùng đã được phát triển. 1.2.4. Lịch sử nghiên cứu gà chuyển gen - Con gà chuyển gen đầu tiên được tạo ra lại theo phương pháp sử dụng vector retrovirus. Thông qua sử dụng vector retrovirus (vi rút phiờn mó ngược), trường đại học North Carolina State đã tạo ra được cỏc dũng gà chuyển gen biểu hiện β - galactosidase. Vector này được thiết kế bởi Takashi Mikawa [42]. - Vào giữa thập niên 1980, một nhà nghiên cứu ở Viện Sinh lý học Ðộng vật và Di truyền ở Edinburgh đã vi tiêm ADN ngoại lai vào các tế bào phôi gà đơn lẻ tạo ra các “gà con ống nghiệm” đầu tiên trên thế giới cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra “gà siêu hạng” bằng cách xen ADN ngoại lai vào phôi [2]. - Harvey và cộng sự (2002) thuộc trường Ðại học Georgia ở Athens đã đưa gen mó hoỏ enzyme beta-lactamase vi khuẩn vào trong phôi của gà Leghorn trắng. Khoảng 2% cỏc phụi này đã sinh trưởng đến thành thục và đã biểu hiện enzyme beta-lactamase trong một số tế bào. Bước tiếp theo, các nhà nghiên cứu đã cho lai các gà bình thường với các gà trống và gà mái đã biểu hiện beta-lactamase trong tinh trùng hay trong trứng của chúng. Thế hệ con sinh ra đã mang các bản sao của gen beta-lactamase ở trong tất cả các tế bào và các gen chuyển ổn định trong gà [27],[28]. - Mo Sun Kwon năm 2004 đã tạo gà chuyển gen biểu hiện protein phát huỳnh quang tăng cường eGFP (Enhanced green fluorescent protein) nhờ sử dụng hệ thống chuyển gen qua vector retrovirut (hình 1.11) [35]. Nguyễn Thị Hồng Hạnh 18 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Hình 1.11: Gà chuyển gen GFP có khả năng phát sáng dưới ánh sáng huỳnh quang (trái) bên cạnh gà bình thường (phải) [35]. - Năm 2005, Zhu và cộng sự công bố sản xuất thành công lượng lớn kháng thể đơn dòng từ trứng của gà khảm bằng cách chuyển nhiễm các tế bào gốc phôi vào đĩa phôi gà giai đoạn X. - Đến năm 2006, Bon Chul Koo và cộng sự đã tạo ra gà khảm dòng sinh biểu hiện protein phát huỳnh quang sử dụng vector MoMLV (moloney murine leukemia virus) được thiết kế dựa trên dựa trên vector retrovirut [47]. Tuy nhiên, cho đến nay gà là đối tượng chuyển gen thu được ít thành tựu nhất. 1.2.5. Các phương pháp chuyển gen ở gà Về nguyên tắc, các phương pháp tạo ra động vật chuyển gen đều có thể áp dụng với gia cầm để tạo ra gia cầm chuyển gen. Như đã mô tả ở trên, quá trình sinh lý sinh sản của gia cầm phức tạp, vì thế đối với gia cầm người ta sử dụng các phương pháp chuyển gen với trứng chủ yếu là giai đoạn sau khi đẻ. Trong nội dung của luận văn này, chúng tôi sử dụng hai phương pháp là vi tiêm và chuyển gen qua tinh trùng, mỗi phương pháp đều có những ưu – nhược điểm nhất định. 1.2.5.1. Phương pháp vi tiêm * Nguyên tắc: một lượng nhỏ ADN được tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi. Tuy nhiên sự xâm nhập của gen chuyển vào ADN tế bào vật chủ là một quá trình Nguyễn Thị Hồng Hạnh 19 Cao học K17 – Sinh học Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm ngẫu nhiên và xác suất để gen chuyển xen vào vị trí ADN vật chủ mà sẽ cho phép nó biểu hiện là thấp. Hiệu quả của vi tiêm là không cao [2]. Hình 1.12: Phương pháp vi tiêm vào trứng gà [41] Vào năm 1994, một phương pháp tạo gà chuyển gen bằng vi tiêm ADN ngoại lai từ hai loại vi khuẩn khác nhau đã được mô tả. Trước tiên gà mái được TTNT với tinh dịch của gà trống khoẻ mạnh. Sau đó giết chết gà mái bằng cách tiêm vào tĩnh mạch của nó chất gây mê với liều cao. Mổ bụng gà mái đã chết và di chuyển bộ phận ống dẫn trứng chứa trứng thụ tinh không vỏ. Sau đó đặt trứng vào các vỏ thay thế và tiêm ADN plasmid vi khuẩn vào đĩa phôi của hợp tử (phôi 1 tế bào). Ðổ đầy vỏ trứng dung dịch nuôi cấy và hàn gắn lại. Với 128 trứng vi tiêm, 7 gà con vi tiêm sống đến thành thục sinh dục. Trong đó 1 gà trống đã truyền ADN plasmid vi khuẩn cho 3,4% con cái của nó. Các gà con chuyển gen này sống đến thành thục sinh dục và được nhân giống để sản xuất gà chuyển gen. Kết quả này chứng tỏ sự di truyền ADN ngoại lai ổn định có thể đạt được bằng phương pháp này [2]. * Ưu điểm: Phương pháp này cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở mỗi tế bào với hiệu quả tương đối cao. Nguyễn Thị Hồng Hạnh 20 Cao học K17 – Sinh học