Tài liệu Phân lập vi khuẩn oxi hóa sắt ưa axit (fob) phục vụ cho công nghệ tuyển khoáng sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------- NGUYỄN VĂN HƢNG PHÂN LẬP VI KHUẨN OXY HÓA SẮT ƢA AXIT (FOB) PHỤC VỤ CHO CÔNG NGHỆ TUYỂN KHOÁNG SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------- NGUYỄN VĂN HƢNG PHÂN LẬP VI KHUẨN OXY HÓA SẮT ƢA AXIT (FOB) PHỤC VỤ CHO CÔNG NGHỆ TUYỂN KHOÁNG SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn Khoa học: TS. Đinh Thúy Hằng PGS. TS. Ngô Tự Thành Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Qua thời gian hai năm nghiên cứu tại phòng Sinh thái Vi sinh vật - Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội, đến nay tôi đã hoàn thành luận án thạc sỹ với tiêu đề ―Phân lập vi khuẩn oxy hóa sắt ưa axit (FOB) để phục vụ cho công nghệ tuyển khoáng sinh học‖. Tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình chu đáo của các thầy cô giáo, các cán bộ khoa học công tác tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học và Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên - ĐHQGHN. Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Đinh Thúy Hằng, trƣởng phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và CNSH – ĐHQGHN và PGS.TS. Ngô Tự Thành, cán bộ công tác tại Bộ môn Vi sinh vật học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN là những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện và các cán bộ công tác tại viện Vi sinh vật và CNSH đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt nghiên cứu của mình. Tôi cũng vô cùng biết ơn các thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học và Khoa Sinh học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp tại Phòng Sinh thái vi sinh vật đã luôn khích lệ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và trong cuộc sống. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Văn Hƣng DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT At. ferridurans Acidithiobacillus ferridurans At. ferrivorans Acidithiobacillus ferrivorans At. ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans BacTech Bacterial Technology BIOX Biological Oxidation CI Chloroform Isoamyl Alcohol DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EDX Energy Dispersive X-Ray Analysis FEMS Federation of European Microbiological Societies FISH Fluorescence in situ hybridization FOB Ferrous Oxidizing Bacteria HIOX High Temperature Bacterial Oxidation IAEA International Atomic Energy Agency MIT Massachusetts Institute of Technology LE Leaching Experiment L. ferriphylum Leptospirillum ferriphylum L. ferrooxidans Leptospirillum ferrooxidans PBS Phosphate-Buffered Saline SEM Scanning Electron Microscope TAE Tris-Acetate-EDTA DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1. 1. Ứng dụng công nghệ bioleaching trên thế giới. 3 Bảng 1. 2. Nồng độ oxy tới hạn cho sự phát triển của At. ferrooxidans 11 ở các nhiệt độ khác nhau. Bảng 1. 3. Nồng độ giới hạn các kim loại nặng cho sự phát triển của 15 At. ferrooxidans Bảng 1. 4. Sản lƣợng đồng của Chile và trên thế giới đƣợc khai thác 22 bằng công nghệ tuyển khoáng sinh học Bảng 1. 5. Ảnh hƣởng của bƣớc tiền xử lý quặng vàng bằng bioleachig 23 tới hiệu suất khai thác tại một số doanh nghiệp khai thác khoáng sản trên thế giới Bảng 2. 1. Mồi PCR khuyếch đại các đoạn 16S rDNA dùng trong 25 nghiên cứu Bảng 2. 2. Thành phần môi trƣờng 9K 26 Bảng 2. 3. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR-DGGE 30 Bảng 2. 4. Phản ứng PCR khuyếch đại 16S rDNA 31 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Số lƣợng vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit đƣợc công bố ...............................2 Hình 1.2. Chi phí đầu tƣ cho hệ thống vận hành và lợi nhuận thu đƣợc từ quá trình khai khoáng theo công nghệ truyền thống và công nghệ bioleaching..................4 Hình 1.3. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự 16S rDNA ..........................6 Hình 1.4. Các mốc thời gian đánh dấu hoạt động về nghiên cứu và ứng dụng của nhóm vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit ƣa nhiệt ......................................................7 Hình 1. 5. Sơ đồ phân bố và hình ảnh SEM của vi khuẩn trên bề mặt quặng pyrite 9 Hình 1. 6. Sơ đồ mô tả cơ chế phản ứng xảy ra trong quá trình bioleaching ...........10 Hình 1. 7. Tốc độ oxy hóa Fe2+ (IOR) tại các giá trị pH khác nhau (1.5 -2.5) ở nhiệt độ 30ºC của vi khuẩn At. ferrooxidans ............................................................12 Hình 1. 8. So sánh lƣợng đồng đƣợc thu hồi từ bioleaching ở điều kiện ƣa ấm (mesophile) và ƣa nhiệt (thermophile) .............................................................13 Hình 1.9. Ảnh hƣởng của kích thƣớc hạt quặng tới quá trình hòa tách kẽm bởi vi khuẩn Sulfobacillus thermosulfidooxidans.......................................................14 Hình 1.10. Ảnh hƣởng của các hợp chất dung môi hữu cơ tới khả năng oxy hóa chalcopyrite của At. ferrooxidans.....................................................................16 Hình 1.11. Sơ đồ quá trình bioleaching sử dụng mô hình đống ủ (heap leaching) và mô hình hòa tách tại chỗ (in situ leaching). .....................................................17 Hình 1. 12. Sơ đồ quy trình công nghệ của phƣơng pháp hòa tách quặng theo mô hình đống ủ .......................................................................................................17 Hình 1.13. Khai thác khoáng sản sử dụng công nghệ hòa tách dạng đống ủ (heap leaching) trên thế giới từ năm 1980 – 2014 .....................................................19 Hình 1.14. Sơ đồ quá trình khai thác uranium bằng công nghệ hòa tách tại chỗ (in situ leaching) ....................................................................................................20 Hình 1. 15. Bể khuấy tuyển quặng và hệ thống tuyển quặng theo công nghệ bể khuấy. ...............................................................................................................21 Hình 2.1. Vị trí đoạn 16S rDNA đƣợc sử dụng trong phân tích DGGE ở Lactobacillus plantarum...................................................................................29 Hình 2.2. Sơ đồ chậu thí nghiệm tuyển quặng sinh học ...........................................33 Hình 3.1. Làm giàu vi khuẩn FOB và phân lập FOB qua dãy pha loãng trên đĩa 96 giếng ...................................................................................................................................... 36 Hình 3. 2. Hình thái tế bào của hai chủng FOB1 và FOB2 ................................................ 37 Hình 3.3. Vị trí phân loại của hai chủng vi khuẩn FOB1 và FOB2 so với các loài vi khuẩn oxy hóa sắt đã công bố. ................................................................................................ 38 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của pH trong môi trƣờng tới hoạt tính oxy hóa Fe2+của hai chủng FOB mới phân lập....................................................................................39 Hình 3.5. Thay đổi pH và tổng lƣợng sắt hòa tách từ quặng trong thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite sử dụng các chủng vi khuẩn FOB1và FOB2 nhƣ nguồn vi sinh vật bổ sung ban đầu. ....... .......................................................................39 Hình 3.6. Ảnh chụp SEM của bề mặt quặng chalcopyrite sau thí nghiệm hòa tách cho thấy các hốc và các kênh ăn mòn do vi khuẩn FOB tạo ra. .........................41 Hình 3.7. Phân tích thành phần nguyên tố của các mẫu quặng chalcopyrite trong thí nghiệm hòa tách bằng công cụ EDX ..................................................................42 Hình 3.8. Hình ảnh FISH sử dụng đầu dò GAM42a trên mẫu quặng chalcopyrite từ thí nghiệm hòa tách có bổ sung chủng Acidithiobacillus sp. FOB1 làm giống khởi động. ...........................................................................................................43 Hình 3.9. Hình ảnh phân tích quần xã vi khuẩn trong các mẫu làm giâu (E1, E2) và mẫu thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite (LE) so sánh với các chủng thuần khiết FOB1, FOB2 đã phân lập. .........................................................................44 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................2 1.1. Lịch sử phát triển công nghệ ............................................................................2 1.2. Vi sinh vật tham gia và cơ chế sinh học của quá trình bioleaching .................4 1.2.1. Vi sinh vật tham gia quá trình bioleaching ................................................4 1.2.1.1. Vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit ƣa ấm (mesoacidophilic) .......................5 1.2.1.2. Vi sinh vật ƣa axit ƣa nhiệt (moderate thermoacidophilic) .................6 1.2.1.3. Vi sinh vật ƣa axit ƣa nhiệt cực trị (extreme thermoacidophilic) ........7 1.2.2. Cơ chế sinh học của quá trình bioleaching.................................................8 1.2.2.1. Cơ chế trực tiếp ....................................................................................8 1.2.2.2. Cơ chế gián tiếp ...................................................................................9 1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình hòa tách quặng sinh học .........................11 1.3.1. Thành phần dƣỡng chất ............................................................................11 1.3.2. Nhu cầu O2 và CO2 ...................................................................................11 1.3.3. pH .............................................................................................................12 1.3.4. Nhiệt độ ....................................................................................................13 1.3.5. Cấu trúc và kích thƣớc hạt quặng .............................................................13 1.3.6. Kim loại nặng ...........................................................................................14 1.3.7. Các chất có hoạt tính bề mặt và hợp chất hữu cơ .....................................15 1.4. Các dạng công nghệ tuyển khoáng theo nguyên lý bioleaching.....................16 1.4.1. Công nghệ hòa tách dạng đống ủ (heap/dump leaching) .........................17 1.4.2. Công nghệ hòa tách tại chỗ (in situ leaching) ..........................................19 1.4.3. Mô hình hòa tách trong bể khuấy (tank leaching)....................................21 1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng công nghệ bioleaching............................22 1.5.1. Trên thế giới .............................................................................................22 1.5.2. Ở Việt Nam ..............................................................................................24 Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .........................................................25 2.1. Nguyên vật liệu ...............................................................................................25 2.1.1. Nguồn mẫu phân lập và mẫu quặng thử nghiệm ......................................25 2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................25 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................25 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................26 2.2.1. Làm giàu và phân lập FOB ......................................................................26 2.2.2. Tách DNA tổng số....................................................................................27 2.2.2.1. Tách DNA từ dịch làm giàu và mẫu môi trƣờng ...............................27 2.2.2.2. Tách DNA từ các chủng thuần khiết..................................................28 2.2.3. Phƣơng pháp PCR – DGGE .....................................................................29 2.2.4. Giải trình tự 16S rDNA và dựng cây phân loại........................................30 2.2.5. Định lƣợng Fe(II) và Fe tổng số ...............................................................31 2.2.6. Phƣơng pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) ..........................................33 2.2.7. Thiết lập thí nghiệm tuyển quặng sinh học ..............................................33 2.2.8. Phƣơng pháp phân tích SEM và EDX......................................................34 2.3. Sơ đồ các bƣớc nghiên cứu .............................................................................35 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................36 3.1. Làm giàu và phân lập vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit........................................36 3.2. Xác định vị trí phân loại và định danh các chủng FOB mới phân lập............37 3.3. Nghiên cứu khả năng chịu pH của các chủng FOB phân lập .........................38 3.4. Nghiên cứu ứng dụng các chủng FOB mới phân lập trong thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite trong mô hình phòng thí nghiệm ....................................40 3.5. Phân tích nguyên tố trên bề mặt quặng chalcopyrite bằng công cụ EDX ......41 3.6. Nghiên cứu thành phần vi khuẩn phát triển trên bề mặt quặng chalcopyrite trong thí nghiệm bioleaching .................................................................................42 3.7. Nghiên cứu quần xã vi khuẩn trong mẫu làm giàu và mẫu thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite .................................................................................................43 Chƣơng 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................47 PHỤ LỤC ..................................................................................................................55 MỞ ĐẦU Bioleaching là việc ứng dụng vi sinh vật để hòa tách các kim loại ra khỏi quặng của chúng. Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới trong ngành công nghiệp khai thác khoáng sản nhờ hiệu quả kinh tế cao và tính thân thiện với môi trƣờng. Nhiều quốc gia có ngành công nghiệp khai thác khoáng sản phát triển nhƣ Nam Phi, Chile, Đức, Anh đã và đang áp dụng công nghệ tuyển khoáng sinh học để đảm bảo duy trì tính bền vững cho ngành công nghiệp này của nƣớc mình. Tuy nhiên, ở Việt Nam công nghệ này còn chƣa đƣợc quan tâm phát triển. Số lƣợng các nghiên cứu lý thuyết cũng nhƣ ứng dụng về lĩnh vực này trong nƣớc còn rất nhỏ. Ở Việt Nam, các mỏ có trữ lƣợng trung bình, hàm lƣợng quặng thƣờng không cao và phân bố thiếu tập trung khiến cho công nghệ hòa tách hóa học khó đạt hiệu quả cao. Do vậy bioleaching đƣợc nhìn nhận là một công nghệ hoàn toàn phù hợp với điều kiện mỏ trong thực tế. Để phát triển công nghệ bioleaching trong nƣớc, vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit bản địa cần đƣợc tìm kiếm và nghiên cứu về các đặc điểm sinh học có liên quan tới quá trình hòa tách kim loại. Trong khuôn khổ luận án thạc sỹ này, đề tài ―Phân lập vi khuẩn oxy hóa sắt ưa axit (FOB) phục vụ cho công nghệ tuyển khoáng sinh học‖ đƣợc thực hiện với các nội dung chính sau: - Phân lập tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng oxy hóa sắt ƣa axit từ môi trƣờng khai thác khoáng sản trong nƣớc. - Nghiên cứu sự sinh trƣởng trong môi trƣờng pH thấp của các chủng phân lập để đánh giá khả năng ứng dụng vào việc hòa tách quặng. - Thử nghiệm ứng dụng vi khuẩn để hòa tách kim loại từ quặng chalcopyrite (CuFeS2) trong mô hình phòng thí nghiệm. 1 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lịch sử phát triển công nghệ Bioleaching là quá trình hòa tách các kim loại từ quặng dƣới tác động của vi sinh vật thay vì sử dụng các phƣơng pháp hóa học truyền thống (Neale, 2006). Trong thực tế, con ngƣời đã sử dụng kỹ thuật bioleaching từ rất lâu một cách vô thức để tách kim loại (nhƣ đồng) từ quặng họ khai thác. Tuy nhiên, chỉ tới những năm đầu của thế kỷ 20, bản chất khoa học của công nghệ mới đƣợc sáng tỏ thông qua việc phát hiện ra chủng vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit đầu tiên, Acidithiobacillus ferrooxidans, cũng nhƣ những nghiên cứu, tìm ra vai trò của chúng trong việc hình thành nƣớc thải mỏ (Colmer và Hinkle, 1947). (A) (B) Hình 1.1. A - Số lƣợng vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit đƣợc công bố (HET – vi sinh vật dị dƣỡng; S OX – vi khuẩn oxy hóa lƣu huỳnh; Fe+S OX – vi khuẩn oxy hóa cả sắt và lƣu huỳnh; Fe OX – vi khuẩn oxy hóa sắt (Watling, 2016). B – hình ảnh tế bào Acidithiobacillus ferrooxidans trên bề mặt quặng đang bị tấn công (Fowler và Crundwell, 1999). Kể từ đó, nghiên cứu và ứng dụng phát triển công nghệ bioleaching đã đƣợc đẩy mạnh. Nhiều chủng vi sinh vật có khả năng ứng dụng trong các quá trình hòa tách kim loại đã đƣợc công bố (Hình 1.1A) và ứng dụng ở quy mô công nghiệp để thu hồi các kim loại từ quặng (Bảng 1.1). 2 Bảng 1. 1. Ứng dụng công nghệ bioleaching trên thế giới. Vi sinh vật sử dụng trong bioleaching Porphyridium cruentum, Loại quặng áp dụng Uraninite (UO2) Kim loại Quốc khai thác gia U TLTK Rumani Cecal và cs, 2000 Spirulina platensis, Nostoc linkia Aspergillus flavus, Chalcopyrite (CuFeS2) Cu, Fe Ấn Độ Rao và cs, 2002 Aspergillus niger At. ferrooxidans, Chalcopyrite (CuFeS2), L. ferriphilum, Bornite(Cu5FeS4), F. acidiphilum Pyrite (FeS2) At. ferrooxidans, Criddleite Sulfobacillus spp. Cu, Fe Chile (TlAg2Au3Sb10S10), Demergasso và cs, 2005 Au, Ag Mỹ Logan và cs, 2007 Liujiyinite (Ag3AuS2) Mg, Fe, Trung Qin và cs, Al Quốc 2009 At. thiooxidans Olivine (Mg, Fe)2SiO4), Chlorite (Fe,Mg,Al)6(Si,Al)4O10( OH)8, Antigorite (Mg3Si2O5(OH)4 At. ferrooxidans, Betafite U, Ti Ấn Độ, Abhilash và L. ferrooxidans (Ca,U)2(Ti,Nb,Ta)2O6OH, Tây Ba cs, 2011 Brannerite (UTi2O6) Nha At. ferrooxidans, L. ferrooxidans, At. ferrooxidans, Pentlandite (Fe,Ni)9S8, At. ferrivorans, Gersdorffite (NiAsS) Ni,As Phần Wakeman Lan và cs, 2011 At. caldus, Thiomonas cuprina Có thể thấy công nghệ bioleaching ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp khai khoáng trên toàn thế giới, đặc biệt ở các quốc gia phát triển và đang phát triển nhƣ Mỹ, Tây ban Nha, Trung Quốc, Chile….Việc phát triển và mở rộng các đối tƣợng khai thác cũng đã và đang đƣợc trú trọng nghiên cứu để ứng dụng trong thực tế (Bảng 1.1). Cho đến nay, các kim loại quý nhƣ Au, Ag, Ni, Co 3 đều đã đƣợc thu hồi thông qua việc sử dụng công nghệ bioleaching và đã mang lại những lợi ích lớn về kinh tế và môi trƣờng tại nhiều quốc gia (Willner và cs, 2015). Nhƣ vậy, bioleaching không còn là một công nghệ tiềm năng mà đã trở thành một công nghệ mới có thể thay thế công nghệ khai khoáng truyền thống và ngày càng khẳng định đƣợc vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp khai khoáng hiện nay. Thực tế, hơn 20% sản lƣợng đồng khai thác trên thế giới đƣợc thực hiện bằng công nghệ bioleaching (Watling, 2006). Theo nghiên của Morenci và Collahausi (2015), mặc dù có chi phí vận hành cao hơn một chút, nhƣng công nghệ bioleaching đạt hiệu suất hòa tách đồng tới 90 – 95% so với 60 – 65% của phƣơng pháp khai thác hóa học truyền thống (Hình 1.2). Hình 1. 2. Chi phí đầu tƣ cho hệ thống vận hành và lợi nhuận thu đƣợc từ quá trình khai khoáng theo công nghệ truyền thống và theo công nghệ bioleaching. 1.2. Vi sinh vật tham gia và cơ chế sinh học của quá trình bioleaching 1.2.1. Vi sinh vật tham gia quá trình bioleaching Vi sinh vật tham gia vào quá trình bioleaching rất đa dạng, từ các sinh vật nhân sơ nhƣ At. ferrooxidans và các loài cổ khuẩn nhƣ Ferroplasma acidiphilum, Sulfobacillus sp. đến các loài vi tảo và vi khuẩn lam (Spirulina platensis, Nostoc linkia, Porphyridium cruentum) hay vi nấm đều có thể tham gia quá trình 4 bioleaching để hòa tách kim loại (Bảng 1.1). Tuy nhiên, do đƣợc ứng dụng rộng rãi hơn cả, các loài sinh vật nhân sơ bao gồm vi khuẩn và cổ khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit cũng nhƣ vai trò của chúng trong công nghệ bioleaching là đối tƣợng đƣợc đề cập tới trong khuôn khổ bài luận văn này. 1.2.1.1. Vi khuẩn oxy hóa sắt ưa axit ưa ấm (mesoacidophilic) Các loài vi khuẩn trong nhóm này chủ yếu phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ từ 25ºC tới 35ºC. Đại diện điển hình và cũng là loài FOB đƣợc biết đến đầu tiên là At. Ferrooxidans (tên cũ là Thiobacillus ferrooxidans đƣợc thay đổi theo Kelly và Wood năm 2000) đƣợc phân lập từ hệ thống nƣớc thải mỏ axit (Colmer và Hinkle, 1947). Từ đó đến nay có nhiều loài vi khuẩn có khả năng oxy hóa sắt ƣa axit ƣa ấm khác đã đƣợc phát hiện nhƣ Leptospirillum ferrooxidans (Markosyan, 1972), Acidithiobacillus thiooxidans (Kelly và Wood, 2000). Về mặt sinh lý, At. ferrooxidans có nhiều điểm giống với At. thiooxidans, loại vi khuẩn thƣờng có mặt trong các loại nƣớc thải mỏ axit (Natarajan, 2008). Sự khác biệt cơ bản giữa hai loài này là việc At. thiooxidans không có khả năng oxy hóa Fe2+ (Rawlings, 2005). Trong nhóm này cũng cần kể đến hai loài At. prosperus và At. cuprinus (Huber và Stetter, 1990). At. prosperus đại diện cho một nhóm vi khuẩn oxy hóa kim loại chịu mặn, trong khi đó At. cuprinus đại diện cho nhóm vi khuẩn hóa tự dƣỡng vô cơ (chemolithoautotrophic), có thể oxy hóa các sulfide kim loại nhƣng lại không oxy hóa đƣợc Fe2+. Cả hai loài đƣợc xem là nguồn vi sinh vật quan trọng của quá trình hòa tách đồng từ quặng chalcopyrite (Huber và Stetter, 1990). Trong nhóm này thì các loài Leptospirillum phát triển chậm hơn so với các loài Acidithiobacillus trong môi trƣờng giàu ion Fe2+. Tuy nhiên, Leptospirillum spp. lại có khả năng oxy hóa sắt cao và thực sự ƣa axit, phát triển tốt ở điều kiện pH rất thấp (1 – 1.5) (Kinnunen và Puhakka, 2004). Gần đây các nhà khoa học mới phát hiện đƣợc đại diện chịu nhiệt thuộc chi Leptospirillum là L. ferriphilum, khác biệt với L. ferroxidans ở khả năng phát triển tốt ở nhiệt độ tới 45ºC (Coram và Rawling, 2002), mở ra hƣớng ứng dụng nhóm vi khuẩn này ở điều kiện nhiệt độ cao. 5 Hình 1. 3. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự 16S rDNA cho thấy các loài Acidithiobacillus thuộc các phân lớp α, β, γ – Proteobacteria, còn chi Leptospirilla thuộc nhóm nitrospira (Macalady và cs, 2013). 1.2.1.2. Vi sinh vật oxy hóa sắt ưa axit ưa nhiệt (moderate thermoacidophilic) Các loài trong nhóm này sinh trƣỏng tốt trong khoảng nhiệt độ 45 - 55ºC, gồm một số loài nhƣ Acidithiobacillus caldus, Leptospirillum ferriphilum và Acidimicrobium (Neale, 2006). Ngoài ra, trong nhóm này còn có các loài cổ khuẩn thuộc chi Sulfobacillus hay chi Ferroplasma (F. thermophilum) ít đƣợc sử dụng trong các hệ thống bioleaching công nghiệp (Neale, 2006). Tuy nhiên các loài cổ khuẩn này đóng vai trò quan trọng trong hệ vi sinh vật bioleaching ở các bể phản ứng ở điều kiện nhiệt độ cao trong giai đoạn đầu quá trình hòa tách khi pH chƣa đạt mức tối ƣu (Zhang và cs, 2014). Sinh trƣởng của các loài cổ khuẩn này ở giai đoạn sớm sẽ làm giảm pH, tạo điều kiện cho các loài vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa nhiệt khác nhƣ Acidithiobacillus caldus và Leptospirillum ferriphilum phát triển, trực tiếp tham gia vào quá trình hòa tách quặng (Zhang và cs, 2014). 6 1.2.1.3. Vi sinh vật oxy hóa sắt ưa axit ưa nhiệt cực trị (extreme thermoacidophilic) Các loài vi khuẩn ƣa nhiệt cực trị chủ yếu là các loài cổ khuẩn sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ trong khoảng 60 - 90ºC (Neale, 2006). Các đại diện trong nhóm bao gồm các loài thuộc chi Acidianus (nhƣ A.brierleyi), Sulfolobus (nhƣ S. thermosul fidooxidans) và Metallosphaera (Wheaton và cs, 2015; Segener và cs, 1986). Hiện nay, trong các quy trình hòa tách kim loại ở quy mô công nghiệp ngƣời ta đã ƣu tiên sử dụng các nhóm vi khuẩn này để nâng cao hiệu suất do tốc độ phản ứng tăng theo chiều tăng của nhiệt độ (Noris và cs., 1986; Brierley và cs, 1978; ). Bên cạnh đó, việc sử dụng các vi khuẩn ƣa nhiệt cao trong bioleaching sẽ tạo điều kiện để mở rộng ứng dụng công nghệ với các loại quặng kém hiệu quả khi đƣợc hòa tách ở nhiệt độ ấm nhƣ chalcopyrite, quặng vàng arsenopyrite (Rawling và cs, 2005). Hình 1. 4. Các mốc thời gian đánh dấu hoạt động về nghiên cứu và ứng dụng của nhóm vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit ƣa nhiệt độ cao (Wheaton và cs, 2015). 7 1.2.2. Cơ chế sinh học của quá trình bioleaching Sự hòa tách kim loại trong các quặng sulfide nhờ vi sinh vật đƣợc thực hiện theo hai cơ chế, trực tiếp và gián tiếp (Rawling và cs, 2005). 1.2.2.1. Cơ chế trực tiếp Khi tiếp xúc với quặng có chứa thành phần pyrite, vi sinh vật kết nối trực tiếp với các sulfide sắt trên bề mặt quặng (Hình 1.6) và thực hiện các phản ứng sinh hóa, tạo ra các sulfate sắt. Phƣơng trình phản ứng diễn ra nhƣ sau (Sand và cs, 2001): 4FeS2 + 14O2 + 4H2O  4FeSO4+ 4H2SO4 4FeSO4+ 2H2SO4 + O2  2Fe2(SO4)3 + 2H2O Phản ứng oxy hóa trực tiếp pyrite, có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sau: 4FeS2 + 2H2O + 15O2  2Fe2(SO4)3 + 2H2SO4 Các nghiên cứu cho thấy ngoài sulfide sắt, nhiều dạng sulfide kim loại khác cũng có thể đƣợc oxy hóa bởi At. ferrooxidans theo cách tƣơng tác trực tiếp nhƣ trên, ví dụ nhƣ covellite (CuS), chalcocite (Cu2S), sphalerite (ZnS), galena (PbS), molybdenite (MoS2), stibnite (Sb2S3), cobaltite (CoS), millerite (NiS) (Ehrlich, 1996). 8 Hình 1. 5. Vị trí phân bố của vi khuẩn (sơ đồ và hình ảnh SEM) trên bề mặt quặng pyrite (Bennett và Tributsch, 1978). a, b, c - các ổ vi khuẩn dạng đơn, đôi, xếp chuỗi; e (1, 2, 3) phát triển của các ổ vi khuẩn từ dạng chuỗi để tạo thành dạng kênh; f - chuỗi các ổ vi khuẩn xếp vuông góc; g, h - các cụm ổ vi khuẩn; i - các ổ nghiêng theo bề mặt tinh thể quặng; j - giao cắt của các chuỗi ổ vi khuẩn tại các điểm nứt nhỏ trên mạng tinh thể. 1.2.2.2. Cơ chế gián tiếp Trong cơ chế hòa tách gián tiếp, các vi khuẩn FOB tạo ra các sản phẩm có khả năng oxy hóa các sulfide kim loại theo con đƣờng hóa học, cụ thể là ion Fe3+ (Bosecker, 1997). Quá trình gián tiếp xảy ra theo phản ứng: MS + Fe2(SO4)3  MSO4 + 2FeSO4 + S Nhƣ vậy, theo cơ chế gián tiếp, vi khuẩn đóng vai trò cung cấp một cách liên tục chất oxy hóa, cụ thể ở đây là Fe2(SO4)3. Để giữ cho lƣợng sắt ở trong dung dịch luôn đủ thì quá trình oxy hóa học các sulfide kim loại phải xảy ra trong điều kiện môi trƣờng pH < 5.0. Các ions Fe2+ sinh ra theo phản ứng trên đƣợc tái oxy hóa thành Fe3+ bởi At. ferrooxidans và L. ferrooxidans (Bosecker, 1997). 9 Trong hòa tách gián tiếp, vi khuẩn không cần tiếp xúc với bề mặt quặng mà đảm nhiệm chức năng xúc tác nhờ đẩy nhanh quá trình tái oxy hóa ion Fe2+. Theo một số nghiên cứu, trong khoảng pH 2-3 thì quá trình oxy hóa Fe2+ nhờ vi sinh xảy ra nhanh gấp 105 – 106 lần so với oxy hóa hóa học (Yin, 2007; Peng, 2006; Zhang, 2006). Sulfur sinh ra trong phản ứng gián tiếp có thể đƣợc oxy hóa thành axit sulfuric bởi vi khuẩn At. thiooxidans. Quá trình này xảy ra theo phản ứng sau: 2S + 3O2 + 2H2O  2H2SO4 Thực tế, hai loài At. thiooxidans và At. ferrooxidans thƣờng đƣợc phát hiện cùng nhau trong nhiều loại dịch ngâm chiết quặng, chứng minh vai trò của At. thiooxidans trong quá trình hòa tách nhƣ một nhân tố duy trì điều kiện môi trƣờng axit cho sự phát triển FOB nhƣ At. ferrooxidans và L. ferrooxidans (Kiều Hữu Ảnh, 1999; Bosecker, 1997). Thực tế, quá trình bioleaching ở ngoài tự nhiên hay trong các hệ thống nhân tạo đều là sự kết hợp của cả hai cơ chế trực tiếp và gián tiếp (Hình 1.6) (Olson và cs, 2003; Bosecker 1997). Hình 1. 6. Sơ đồ mô tả cơ chế phản ứng xảy ra trong quá trình bioleaching (Kinnunen 2004). 10 1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình hòa tách quặng sinh học Hiệu suất hòa tách kim loại phụ thuộc rất nhiều vào mức độ hoạt động của vi sinh vật và cũng nhƣ bản chất hóa học và cấu trúc của quặng. Hiệu quả hòa tách có thể đạt đƣợc tối đa khi các điều kiện công nghệ phù hợp cho vi khuẩn FOB phát triển đƣợc thỏa mãn tối ƣu. 1.3.1. Thành phần dưỡng chất Vi khuẩn FOB thuộc vào nhóm hóa tự dƣỡng vô cơ, chỉ yêu cầu các hợp chất vô cơ cho quá trình sinh trƣởng nhƣ FeSO4.7H2O, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl và Ca(NO3)2. Ngoài các hợp chất cần thiết của sắt và lƣu huỳnh thì cần bổ sung thêm các muối ammonium, phosphate và magnesium để khuẩn có thể phát triển tốt nhất, đồng thời tạo pH tối ƣu bằng cách bổ sung một lƣợng nhỏ axit sulfuric vào môi trƣờng ở thời điểm khởi động (Bosecker, 1997). 1.3.2. Nhu cầu O2 và CO2 Vi khuẩn FOB thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nhu cầu oxy cho sự phát triển là rất cao. Theo nghiên cứu của Myerson (1981) At. ferrooxidans chỉ có thể sinh trƣởng đƣợc khi nồng độ oxy trong môi trƣờng  5% nồng độ oxy bão hòa. Bên cạnh đó, nhu cầu oxy còn phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ môi trƣờng, hay cụ thể hơn là điều kiện vận hành công nghệ (Bảng 1.2). Ở quy mô công nghiệp, cấp oxy là yêu tố quan trọng quyết định thời gian, hiệu suất và hiệu quả kinh tế của công nghệ. Bảng 1. 2. Nồng độ oxy tới hạn cho sự phát triển của At. ferrooxidans ở các nhiệt độ khác nhau (Myerson, 1981). Nhiệt độ (ºC) 25 Nông độ oxy tới hạn (mmol/liter)(× 10-2) 1.29 28 1.22 31 1.15 34 1.09 11