Tài liệu Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắc xin cúm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----o0o----- NGUYỄN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đỗ Tuấn Đạt PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến: - TS. Đỗ Tuấn Đạt, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 - PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Là những ngƣời Thầy đã tận tình quan tâm dạy bảo cùng những kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, đã giảng dạy và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ để tôi có đủ nghị lực hoàn thành nhiệm vụ học tập của mình. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày 18 tháng 11 năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Kim Dung MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Đặc điểm chung của vi rút cúm ....................................................................... 3 1.2. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm ................................................................ 3 1.3. Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa .......................................... 8 1.4. Quá trình nhân lên của vi rút cúm ................................................................. 12 1.5. Sự phát triển của vi rút cúm trên tế bào......................................................... 15 1.6. Kỹ thuật di truyền ngƣợc ............................................................................... 15 1.7. Dịch tễ học bệnh cúm .................................................................................. 187 1.8. Sinh bệnh học .............................................. Error! Bookmark not defined.2 1.9. Vắcxin cúm .................................................................................................. 232 1.10. Một số quy trình sản xuất vắcxin cúm ........................................................ 26 1.11. Các phƣơng pháp kiểm tra chất lƣợng kháng nguyên vắcxin cúm ............. 27 Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP......................................................... 29 2.1. VẬT LIỆU ..................................................................................................... 29 2.1.1. Tế bào ..................................................................................................... 29 2.1.2. Mẫu thử nghiệm ..................................................................................... 29 2.1.3. Môi trƣờng và hóa chất .......................................................................... 29 2.1.4. Trang thiết bị và dụng cụ ...................................................................... 321 2.2. PHƢƠNG PHÁP ......................................................................................... 332 2.2.1. Phƣơng pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) ............................................................................................. 332 2.2.2. Phƣơng pháp chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu .................................................................................................... 365 2.2.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kháng nguyên HA bằng SRID ........ 35 2.2.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein tổng số ................................. 38 2.2.5. Phƣơng pháp điện di trên gel SDS-PAGE ........................................... 410 2.2.6. Phƣơng pháp kính hiển vi điện tử ........................................................ 421 2.2.7. Phân tích xu hƣớng ............................................................................... 421 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 443 3.1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng kháng nguyên vắcxin trong quy trình sản xuất vắcxin cúm ............................... 443 3.1.1. Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 ........................................................................................................................ 443 3.1.2. Kết quả kiểm tra chất lƣợng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm........................................................................................................ 49 3.2. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lƣợng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm. ................................................................................................... 53 3.2.1. Tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất vắcxin cúm .... 54 3.2.2. Tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm .......................................................... 55 3.2.3. Tiêu chuẩn hàm lƣợng kháng nguyên HA bằng SRID........................... 58 3.2.4. Tiêu chuẩn hàm lƣợng protein tổng số ................................................. 621 3.2.5. Tiêu chuẩn điện di trên gel SDS-PAGE………………………………..62 3.2.6. Tiêu chuẩn kính hiển vi điện tử…………………………………………62 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 65 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN của vi rút cúm và chức năng .................................... 8 Bảng 1.2. Các ca nhiễm cúm A (A/H5N1) đƣợc xác định ở các nƣớc 2003-2015 [53].......................................................................................................................... 210 Bảng 1.3. Báo cáo tổng kết giám sát cúm mùa năm 2014 [3] ................................ 221 Bảng 2.1. Công thức pha môi trƣờng MEM ........................................................... 332 Bảng 2.2. Công thức pha môi trƣờng DMEM ........................................................ 332 Bảng 2.3. Công thức pha môi trƣờng LH3E ........................................................... 343 Bảng 2.4. Pha loãng mẫu thử nghiệm và kháng nguyên chuẩn................................ 37 Bảng 3.1. Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghiệm khác nhau (lần 1) ............................................................................................................... 47 Bảng 3.2. Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghịêm khác nhau (lần 2) ............................................................................................................... 47 Bảng 3.3. Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghiệm khác nhau (lần 3) ............................................................................................................... 47 Bảng 3.4. Kết quả kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 .... 49 Bảng 3.5. Kết quả kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 .. 510 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hạt vi rút cúm ............................................................................... 4 Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm B ................................................................................ 6 Hình 1.3. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 ..................................................................... 6 Hình 1.4. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 ..................................................................... 7 Hình 1.5. Hình ảnh vi rút cúm A/H5N1 ..................................................................... 7 Hình 1.6. Vi rút cúm A/H5N1 và quy trình vi rút cúm xâm nhập vào tế bào, nhân lên thành vi rút mới. ................................................................................................. 15 Hình 1.7. Lƣu hành của cúm A, cập nhật đến 17/9/2015 (thông qua các mẫu hô hấp đƣợc xác định dƣơng tính với cúm A) ........................................................ 198 Hình 3.1. Tế bào MDCK kín một lớp sau 2 ngày nuôi cấy.................................... 443 Hình 3.2. Tế bào MDCK chứng và đã đƣợc gây nhiễm vi rút cúm nồng độ 10-1 sau 2 ngày, nuôi ở nhiệt độ 320C và 370C bằng môi trƣơng MEM. ............................. 454 Hình 3.3. Tế bào MDCK chứng và đã đƣợc gây nhiễm vi rút cúm nồng độ 10-1, 10-6, 10-8 sau 3 ngày, nuôi ở nhiệt độ 320C và 370C bằng môi trƣờng MEM. ............... 465 Hình 3.4. Tế bào MDCK chứng và đã đƣợc gây nhiễm vi rút cúm nồng độ 10-1, 10-6, 10-8 sau 4 ngày, nuôi ở nhiệt độ 320C và 370C bằng môi trƣơng MEM .................. 46 Hình 3.5. So sánh chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm 3 loại môi trƣờng MEM, DMEM, LH3E tại 320C sau 3 ngày, 4 ngày và 5 ngày (Trung bình 3 lần thử nghiệm) .......... 48 Hình 3.6. Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE…………………………………….51 Hình 3.7. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 sau 48 giờ gây nhiễm trên tế bào MDCK ................................................................................................................................ 532 Hình 3.8. Kết quả kính hiển vi điện tử mẫu sau tinh chế vắcxin cúm.................... 543 Hình 3.9. Đồ thị phân tích xu hƣớng hiệu giá vi rút cúm 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 .................................................................................................................... 54 Hình 3.10. Đồ thị phân tích xu hƣớng hiệu giá vi rút cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 .................................................................................................................... 55 Hình 3.11. Hình ảnh phản ứng ngƣng kết hồng cầu (HA) ....................................... 56 Hình 3.12. Đồ thị phân tích xu hƣớng hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 .................................................................................................................... 57 Hình 3.13. Đồ thị phân tích xu hƣớng hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1............................................................................................................. 57 Hình 3.14. Xác định hàm lƣợng kháng nguyên HA (SRID) qua phản ứng ngƣng kết miễn dịch khuyếch tán đơn. ...................................................................................... 58 Hình 3.15. Đồ thị phân tích xu hƣớng hàm lƣợng kháng nguyên HA bằng SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1. .......... 610 Hình 3.16. Đồ thị phân tích xu hƣớng hàm lƣợng kháng nguyên HA bằng SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1. ........ 610 Hình 3.17. Đồ thị hàm lƣợng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 ...................................................................... 621 Hình 3.18. Đồ thị hàm lƣợng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 .................................................................... 632 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh/ nghĩa tiếng Việt APS Ammonium persulfate ARN Axit ribonucleic BTP Bán thành phẩm vắcxin cARN Complementary axit ribonucleic CCID50 Cell Culture Injectious Dose 50 (Liều gây nhiễm gây hủy hoại 50% tế bào) CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và dự phòng Mỹ) cDNA Complementary deoxyribonucleic acid DMEM Dulbecco’s Modififed Eagle FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh bê bào thai) HA Haemagglutinin (Ngƣng kết hồng cầu) HAU HA unit (Đơn vị HA) HEF Haemaglutinin- esteraza HI Haemagglutination inhibitor (Ức chế ngƣng kết hồng cầu) LH3E Lactalbumine Hydrolysate Eagle MDCK Madin-Darby Canine Kidney (Tế bào thận chó thƣờng trực) MEM Minimum Essential Medium MRC-5 Medical Reseach Council (Tế bào lƣỡng bội phổi ngƣời) NA Neuraminidase NEP Nuclear export protein NP Nucleoprotein NS Non-structure PB polymerase basic PBS Phosphate-buffered saline PFU Plaque Forming Unit (Đơn vị tạo đám hoại tử) PMKC Primary monkey kidney cell (Tế bào thận khỉ tiên phát) PTA Photphotungstic acid RNP Ribonucleoprotein SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (Điện di tren gel polyacrylamit) SRID Single Radial Immuno Diffusion (Khuyếch tán miễn dịch vòng tròn đơn) SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) VABIOTECH Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 vRNP Virut ribonucleoprotein TCA Tricloacetic acid TCYTTG Tổ chức y tế Thế giới TEMED Tetramethylenediamine TPCK Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone WHO World Health Organization MỞ ĐẦU Bệnh cúm đã và đang đe dọa toàn cầu. Trong ba thế kỷ qua, cứ khoảng 10 đến 40 năm, thế giới lại chứng kiến một đại dịch cúm. Trƣớc khi có vắcxin, mỗi đợt dịch có hàng triệu ngƣời chết. Năm 1918 chứng kiến đại dịch cúm nghiêm trọng nhất lịch sử thế giới, thậm chí còn đƣợc cho là đại dịch kinh hoàng nhất trong các loại bệnh dịch. Tác nhân gây dịch là vi rút cúm A/H1N1 đã gây tổn thất chƣa từng thấy. Dịch cúm gia cầm A/H5N1 xuất hiện từ giữa tháng 12/2003 tại Hàn Quốc, sau đó lan rộng ra một số nƣớc châu Á trong đó có Việt Nam. Từ đầu tháng 4/2009, Mexico đã thông báo trƣờng hợp nhiễm cúm A/H1N1. Vi rút này nhanh chóng lan ra rất nhiều quốc gia trên thế giới và đã có thời điểm Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) phải đƣa ra các cảnh báo coi đây nhƣ là một đại dịch cúm mới. Gần đây nhất, vào năm 2013, trƣờng hợp nhiễm cúm A/H7N9 đầu tiên đƣợc thông báo ở Trung Quốc và đang tiếp tục dấy lên một mối lo ngại cho châu Á nói riêng cũng nhƣ toàn Thế giới nói chung về một căn nguyên cúm mới nguy hiểm đối với sức khoẻ con ngƣời. Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đƣờng hô hấp tạo nên gánh nặng lớn đối với sức khỏe của cộng đồng, TCYTTG và hơn 40% quốc gia trên Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phòng vi rút cúm. Do vậy, phát triển các vắcxin cúm cho ngƣời đang đặt ra nhƣ là một yêu cầu rất cấp bách hiện nay. Là một cơ sở nghiên cứu và sản xuất vắcxin cho ngƣời ở Việt Nam, Công ty TNHH MTV Vắcxin và sinh phẩm số 1 đã tiến hành xây dựng các quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1, cúm A/H1N1 và tiến tới là vắcxin cúm A/H7N9 trên nuôi cấy tế bào. Một trong những thông số rất quan trọng để đánh giá chất lƣợng vắcxin trong phòng thí nghiệm đó là đặc tính của kháng nguyên vi rút cúm có mặt trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắcxin. Xây dựng các phƣơng pháp để đánh giá, từ đó đƣa ra các 1 tiêu chuẩn về chất lƣợng kháng nguyên là một việc làm hết sức cần thiết. Điều này giúp cho việc đánh giá đƣợc chất lƣợng vắcxin và kiểm tra độ ổn định của quy trình sản xuất. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm” trên sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 và cúm A/H1N1, với 2 mục tiêu : 1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm 2. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lƣợng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm. 2 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm chung của vi rút cúm Vi rút cúm thuộc họ Othomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài, genom là ARN đơn, (-), phân đoạn, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Trong đó, vi rút cúm A lƣu hành phổ biến trên gia cầm, ngƣời và động vật khác nhƣ lợn, ngựa…là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B và C chỉ lƣu hành ở ngƣời và thƣờng chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ. Các vi rút cúm A, B và C rất giống nhau về cấu trúc. Thể vi rút có chiều ngang từ 80-120 nm, và thƣờng có hình gần nhƣ tròn, ngoài ra vi rút cũng có thể hiện diện một số dƣới dạng hình sợi. Thể vi rút cúm đƣợc cấu tạo từ một vỏ vi rút bao gồm 2 loại glycoprotein, quấn quanh một phần nhân trung tâm. Phần nhân trung tâm chứa bộ gene RNA và các protein khác có chức năng đóng gói và bảo vệ thể RNA này. Đối với 1 vi rút, thông thƣờng bộ gene không chỉ có 1 mảnh nucleic acid; thay vào đấy, sẽ chứa 7 hoặc 8 mảnh RNA có chiều âm và phân đoạn. Vi rút cúm A có bộ gene mã hoá cho 11 protein trên 8 đoạn RNA: hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), nucleoprotein (NP), M1, M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 và PB2. 1.2. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm Hạt vi rút cúm có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi có hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đƣờng kính trung bình từ 80-120 nm. Các hạt virion của vi rút A và B có vỏ bao bọc. Vỏ vi rút có bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein đƣợc glycosyl hóa và một số protein dạng trần không đƣợc glycosyl hóa. Vi rút cúm có genom nhiều đoạn, ở typ A và B có 8 đoạn ARN(-) với tổng khối lƣợng 5x106, còn ở typ C có 7 đoạn. Trong virion có chứa enzyme ARN- polymeraza phụ thuộc ARN, enzyme này cần cho quá trình phiên mã vì genom ARN chuỗi (-). Protein capsit kết hợp với ARN tạo nucleocapsit đối xứng xoắn. 3 Hình 1.1. Cấu trúc hạt vi rút cúm [10] Nucleocapsit đƣợc bao bọc bởi màng protein nền M1 (M: matrix), phía ngoài màng đƣợc bao bọc bởi vỏ ngoài là lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ. Protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành các kênh ion, làm cho pH của endosom thay đổi. Bề mặt vi rút có hai loại gai mọc nhô ra: hemaglutinin (H) và neuraminidaza (N). Gọi là hemaglutinin vì vi rút gây ngƣng kết hồng cầu ở một số loài. Gai H dài 10 nm gồm 3 tiểu đơn vị glycoprotein giống nhau gộp lại (trimer). Mỗi tiểu đơn vị cấu tạo gồm 2 chuỗi polypeptit kí hiệu là HA1 và HA2, gắn với nhau bởi cầu nối disunphua. Trong hạt vi rút, phân tử hemaglutinin gắn vào màng lipit của vỏ ngoài ở vùng kỵ nƣớc, phía đầu –COOH của HA2. Epitop của kháng nguyên hemaglutinin rất dễ bi biến đổi do luôn có sự biến đổi trong ARN genom, làm thay thế axit amin tại một số vị trí trên phân tử HA1. Sự thay đổi này nằm ở vị trí gắn hemaglutinin vào thụ thể của tế bào. HA chứa peptit dung hợp, khi ở pH trung tính vùi vào trong gai, nhƣng ở pH thấp thì peptit lại nhô ra ngoài. Các peptit 4 dung hợp tạo lỗ, lồng vào lớp lipit kép của màng tế bào chủ làm cho màng tế bào chủ và vỏ ngoài của vi rút dung hợp với nhau. Xen giữa các gai H là các N hình nấm. Đầu gai có cấu trúc hình hộp do 4 tiểu đơn vị có dạng hình nhƣ cầu giáp nối với nhau mà thành. Đầu đƣợc nối với cuống chứa vùng kỵ nƣớc, nhờ thế mà gai N cắm sâu vào vỏ ngoài của vi rút. Thụ thể của tế bào dành cho hemaglutinin có cấu tạo từ axit sialic (còn gọi là neuraminic) liên kết với gốc đƣờng trong glycol protein bằng dây nối glycozit. Enzym neuraminic (silidaza) phân giải thụ thể ở màng nhầy đƣờng hô hấp bằng cách cắt liên kết glycozit, giải phóng axit neuraminic. Động tác này cho phép vi rút đi qua màng nhầy và thoát khỏi các chất ức chế “không đặc hiệu”. Neuraminidaza phá hủy thụ thể của hemaglutinin trên bề mặt hồng cầu mặc dù tế bào này không phải là đối tƣợng gây nhiễm. Neuraminidaza cũng tham gia vào giải phóng vi rút ra khỏi tế bào. Vi rút typ A có 16 loại gai H và hầu hết các loại gai này có ở vi rút gây nhiễm ở động vật (chim, gà, vịt, ngỗng, gà tây, lợn ngựa và một số loại động vật có vú khác). Ba loại gai H quan trọng có ở vi rút gây bệnh cho ngƣời là H1, H2 và H3. Trƣớc đây có H0 và HW (H lợn), nhƣng về sau 2 gai này đƣợc coi là H1. Có 9 loại gai N, trong đó N1 và N2 là quan trọng nhất vì gây bệnh cho ngƣời. 5 Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm B [1]. Vi rút cúm B với virion dạng hình cầu điển hình với đƣờng kính hạt vi rút thay đổi từ 80- 120nm. Bên ngoài vỏ bao ngoài hạt vi rút là các gai ngắn dài khoảng 12nm rõ nét bám xung quanh. Nhuộm PTA 0,25% (thƣớc đo 100nm). Hình 1.3. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 [1]. 6 Hình 1.4. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 [1]. Vi rút cúm A/H1N1 đa dạng về hình thái (hình cầu- 1.3.; hình que- 1.4.) và kích thƣớc thay đổi, đƣờng kính hạt vi rút từ 80-120nm, dài đến 1μm. Trên bề mặt hạt vi rút là các gai ngắn xếp đều đặn. Nhuộm PTA 0,25% (thƣớc đo 100nm). Hình 1.5. Hình ảnh vi rút cúm A/H5N1 [1] 7 Vi rút cúm A/H5N1 với hình dạng và kích thƣớc thay đổi: hình cầu, hình que, đƣờng kính hạt vi rút khoảng 100nm, dài đến 1μm. Các gai ngắn sắp xếp đều trên bề mặt hạt vi rút với chiều dài của gai khoảng 17nm. Nhuộm PTA 0,25% (thƣớc đo 100nm). 1.3. Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa Hệ gen của vi rút cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi vi rút cúm C có 7 đoạn gen ( không có gen NA). Cấu trúc hệ gen của vi rút cúm đã đƣợc tìm hiểu nhờ kỹ thuật phân tích điện di virion ARN vi rút trên gen polyacrylamit. Cấu trúc gen của vi rút cúm nhƣ sau: Đọan gen 1 mã hóa cho PB2, đoạn gen 2 mã hóa cho PB1, đoạn gen 3 mã hóa cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5 cho NP, đoạn 6 cho NA, đoạn 7 cho M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2. Trình tự nucleotit của ARN vi rút cúm PR8/34 và rất nhiều phân typ khác đƣợc công bố từ năm 1982 [28]. Vi rút R8/34 có 13.588 nucleotit. Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN của vi rút cúm và chức năng [26] Phân đoạn ARN Protein TLPT (kDa) Kích thƣớc (bp) Chiều dài chuỗi polypeptit (axit amin) Số phân tử trên 1 virion 1 PB2 85 700 2341 759 30-60 2 PB1 86 500 2341 757 30-60 8 Chức năng Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARNtt. Đóng vai trò làm enzyme phiên mã: gắn kết, kéo dài, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp vi rút thế hệ mới trong tế bào chủ. 3 4 5 6 PA HA NP NA M1 84 200 61 468 56 101 50 087 2233 1778 1565 1413 27 801 7 30-60 454 Là thành phần protein chủ yếu của phức hợp RNP, chứa một trong các khàng nguyên đặc hiệu typ, phân biệt 3 typ cúm A,B,C. 100 498 Phân tử có cấu trúc trimer, cắt bởi enzyme thủy phân thành HA1 và HA2, là cơ sở cho khả năng nhiễm trùng. HA gắn với tế bào túc chủ, dung hợp giải phóng phức hợp RNP, mở đầu cho quá trình nhân lên của vi rút. 1000 566 Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN virion (vARN) 500 716 Phân tử có cấu trúc tetramer, thủy phân bằng protease, cho phép vi rút tiến qua lớp niêm mạc tới các tế bào của đƣờng hô hấp trong quá trình nhiễm trùng. Loại bỏ phân tử axit sialic của phân tử HA từ các virion mới đƣợc tổng hợp, làm lộ HA ra ngoài, tăng khả năng nhiễm trùng. 252 3000 1027 M2 11 010 97 20-60 NS1 26 815 230 20-60 121 130200 8 890 NS2 14 216 9 M1: là kháng nguyên đặc hiệu typ, có chức năng ổn định vrrus, điều khiển hoạt tính ARNprotease và tham gia vào quá trình lắp rắp vi rút (70%). M2: kênh ion. Là protein không cấu trúc, kết thúc quá trình tổng hợp protein của tế bào túc chủ, chỉ có trong tế bào nhiễm vi rút.