TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH- KTNN
===
===
TRẦN THỊ KIM THOA
NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI
THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG BACTERIAL
CELLULOSE LÊN MEN TỪ NƢỚC VO GẠO
ĐỊNH HƢỚNG SỬ DỤNG QUA DA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. LÊ NGỌC HOÀN
HÀ NỘI, 2016
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn trân thành và sâu sắc tới
thầy: TS. Lê Ngọc Hoàn, Trƣờng Đại học S ƣ phạm Hà Nội, ng ƣời đã tận
tình hƣớng dẫn, chỉ bảo cũng nhƣ giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa
luận vừa qua.
Tôi xin trân thành cảm ơn tập thể các thầy, cô giáo của Trung tâm Hỗ trợ
NCKH & CGCN và Bộ môn Sinh lý ngƣời và động vật và các chị là học viên
cao học đã cho tôi nhiều lời khuyên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn.
Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới toàn bộ các thầy, cô giáo và cán
bộ nhân viên Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2- những ng ƣời đã dạy bảo
và giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm học tại đây.
Cuối cùng, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, ng ƣời
thân, bạn bè, những ngƣời luôn bên tôi, chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi những
lúc gặp nhiều khó khăn nhất.
Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2016.
SINH VIÊN
Trần Thị Kim Thoa
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi, các số liệu,
kết quả trong khóa luận là trung thực, không trùng lặp với bất kì công trình
nghiên cứu nào khác.
Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2016.
SINH VIÊN
Trần Thị Kim Thoa
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
A. xylinum
BC
BH
C
E. coli
h
Tên đầy đủ
Acetobacter xylinum
Bacterial cellulose
Berberine hydrochloride
Nồng độ
Escherichia coli
Giờ
HIV
Virus suy giảm miễn dịch ở ngƣời
PC
Plant cellulose
OD
Optical Density
Et al
An other
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
1. Lí do chọn đề tài............................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu.....................................................................................3
3. Nội dung nghiên cứu..................................................................................... 3
4. Ý nghĩa của đề tài..........................................................................................3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................5
1.1. Giới thiệu cellulose vi khuẩn (Bacterial celluose-BC)...............................5
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra BC..........................................................................5
1.1.2. Đặc điểmvà ứng dụng của BC.................................................................6
1.1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của BC....................................................................6
1.1.2.2. Tính chất độc đáo của BC.................................................................... 6
1.1.2.3. Ứng dụng của BC.................................................................................7
1.2. Tình hình nghiên cứu về hƣớng nghiên cứu trong và ngoài nƣớc...........9
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới..........................................................9
1.2.2.Tình hình nghiên cứu trong nƣớc..........................................................10
1.3. Giới thiệu về thuốc Berberin....................................................................10
1.3.1. Cấu trúc................................................................................................. 10
1.3.2. Nguồn gốc............................................................................................. 11
1.3.3. Tính chất................................................................................................11
1.3.4. Tác dụng dƣợc lý..................................................................................12
1.4. Tình hình nghiên cứu về thuốc Berberin trong và ngoài nƣớc...............13
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới........................................................13
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam.........................................................13
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................15
2.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................. 15
2.1.1. Giống vi khuẩn......................................................................................15
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất........................................................................15
2.1.3.Thiết bị và dụng cụ.................................................................................15
2.1.4. Môi trƣờng tạo màng BC..................................................................... 15
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.........................................................................17
2.2.1. Phƣơngpháp lên men thu màng BC từ môi trƣờng nƣớc vo gạo.......17
2.2.2. Phƣơng pháp xử lý màng BC trƣớc khi hấp thụ thuốc.......................18
2.2.3. Phƣơng pháp xác định đƣờng chuẩn...................................................20
2.2.4. Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ qua màng BC......21
2.2.5. Phƣơng pháp pha môi trƣờng đệm PBS ( Phosphate buffered saline)PBS 1X............................................................................................................22
2.2.6. Phƣơngpháp xác định lƣợng thuốc giải phóng thông qua hệ thống
vận tải đƣợc thiết kế.......................................................................................23
2.2.7. Phƣơng pháp phân tích dƣợc động học giải phóng của BH................23
2.2.8. Phƣơng pháp xử lý thống kê................................................................ 24
2.3. Địa điểm tiến hành nghiên cứu.................................................................24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................25
3.1. Thu màng BC........................................................................................... 25
3.1.1. Màng BC thu đƣợc khi nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo.......25
3.1.2. Màng BC thu đƣợc sau khi nuôi cấy....................................................26
3.1.3. Màng BC tinh chế................................................................................. 26
3.2. Màng BC hấp thụ thuốc BH.....................................................................27
3.3. Xác định lƣợng thuốc BH giải phóng khỏi màng BC trong môi trƣờng
pH= 7,4............................................................................................................30
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................................37
1. Kết luận....................................................................................................... 37
2. Đề nghị........................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................38
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Ứng dụng của BC........................................................................... 7
Bảng 2.1: Môi trƣờng tạo màng BC.............................................................17
Bảng 2.2: Nồng độBH và giá trị OD345nm (n=3)...........................................20
Bảng 2.3: Môi trƣờng đệm PBS...................................................................22
Bảng 3.1: Giá trị trung bình OD của dung dịch BH 5% khi ngâm màng
BC (n=3)........................................................................................................29
Bảng 3.2: Lƣợng thuốc hấp thụ BH qua màng BC (n=3)............................ 29
Bảng 3.3: Giá trị OD345nm trung bình của BH giải phóng từ màng BC qua
các thời điểm khác nhau (n=3)......................................................................31
Bảng 3.4 : Tỉ lệ BH đƣợc giải phóng qua màng BC ở các khoảng thời gian
khác nhau (n=3).............................................................................................33
Bảng 3.5:Hệ số tƣơng quan (R), hằng số tốc độ giải phóng (k) và các giá
trị mũ số giải phóng (n) từ môi trƣờng pH= 7,4 và độ dày màng khác nhau
(n=3)..............................................................................................................35
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 1.1: công thức cấu tạo của BH............................................................... 11
Sơ đồ 2.1: Quy trình tạo màng BC thô............................................................18
Sơ đồ 2.2: Quy trìnhthu màng BC tinh chế.....................................................19
Hình 3.1: Màng BC nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo.......................25
Hình 3.2: Màng BC thô...................................................................................26
Hình 3.3: Màng BC sau khi tinh chế...............................................................27
Hình 3.4: Màng BC hấp thụ dung dịch thuốc BH 5%.................................... 28
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Berberine hydrochloride (BH) là một alkaloid thực vật nổi tiếng với
lịch sử lâu đời, đã đƣợc sử dụng ở cảViệt Nam và Trung Quốc trong y học cổ
truyền. Nó đƣợc sử dụng để điều trị tiêu chảy do kháng khuẩn của nó, chống
tăng và tính chất chống tiết. Gần đây, các nghiên cứu cũng đã chứng minh
rằng BH có thể có những tính chất dƣợc lý khác bao gồm chống ung th ƣ,
chống HIV, chống bệnh tiểu đƣờng, đau mắt hột, giải lo âu và thuốc giảm
đau, nấm da, trị bỏng, …
Tuy nhiên, BH có sinh khả dụng thấp, trong đó đã cản trở các ứng dụng
điều trị của nó trong một thời gian dài. Khả năng hòa tan n ƣớc kém của BH
là một nhƣợc điểm đã hạn chế sự phát triển và ứng dụng của BH nh ƣ là một
công thức dƣợc phẩm. Mặt khác, BH cũng có tác dụng phụ tiềm năng liên kết
với bắp của mình và tiêm tĩnh mạch, nhƣ sốc phản vệ và phát ban thuốc. Do
đó, cần thiết để thiết kế một loại màng vận chuyển và phân phối giúp thuốc
giải phóng một cách từ từ, tăng khả dụng sinh học và truyền thuốc tốt hơn do
đó có thể tăng khả năng điều trị bệnh của BH.
Việc đƣa thuốc vào cơ thể qua da là một trong những đƣờng phổ biến
và truyền thống để phân phối thuốc. So đƣờng uống thì hệ thống truyền thuốc
qua đƣờng da nó cũng có nhiều lợi thế nhƣ an toàn, đơn giản, giúp cho
những
đối tƣợng không uống đƣợc thuốc có thể điều trị đúng liều lƣợng, hạn chế
đƣợc một số tác dụng phụ của thuốc, …và tăng hiệu quả truyền thuốc.
Trong tự nhiên có một số vi khuẩn có khả năng sinh ra màng BC. Khi
nuôi cấy những vi khuẩn này trong môi trƣờng chứa glucose, glycerol hoặc
một số nguồn cacbon hữu cơ khác nhau chúng có khả năng hình thành trên bề
mặt một lớp màng cellulose sinh học thuần khiết và đƣợc gọi là màng sinh
học BC [11].
1
BC là sản phẩm của một loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng Acetobacter
xylinum. BC có cấu trúc và đặc tính rất giống với PC- cellulose của thực vật
(gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β- 1,4 glucorit),
cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất
cao phân tử nhƣ ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến do vậy chúng có một
số tính chất hóa lý đặc biệt nhƣ: Độ bền cơ học, khả năng thấm hút n ƣớc
cao,
đƣờng kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục
hồi độ ẩm ban đầu [4], .... Nhờ những đặc tính độc đáo trên nên màng BC
đƣợccoi là một nguồn polymer mới, là một giải pháp trên con đ ƣờng tìm
nguồn nguyên liệu mới hiện nay. Nó đã và đang thu hút đ ƣợc sự chú ý của
nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau thế kỉ XIX và hiện đ ƣợc ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ:Thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp
giấy, mỹ phẩm, y học, ... đáng chú ý nhất trong sự kiểm soát các hệ thống vận
chuyển thuốc. BC đã đƣợc sử dụng nhƣ trong một vài hệ thống để phân phối
thuốc. Amin et al. [18] đã báo cáo việc sử dụng màng BC làm màng bọc cho
paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy màng BC
giúp cho thuốc đƣợc giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng
của thuốc. Hay Almeida, IF., et al. [16] đã sử dụng màng BC nh ƣ hệ thống
phân phối thuốc. Gần đây hơn, Huang et al. [21] nghiên cứu việc sử dụng
màng BC cho việc kiểm soát in vitro của Berberine. Ngoài ra, màng BC còn
đƣợc dùng làm chất màng đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng l ƣợng
(Brown,1989), làm các sợi truyền quang, là môi tr ƣờng cơ chất trong sinh
học sử dụng để cố định protein hay cho sắc kí. Trong lĩnh vực mỹ phẩm màng
BC
đƣợc sử dụng làm mặt nạ dƣỡng da.
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC đã đƣợc quan tâm
và đã đạt đƣợc những thành tựu nhất định. Trƣờng Đại học Y d ƣợc TP. Hồ
Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng BC có tẩm dầu mù u làm màng trị
2
bỏng thử nghiệm trên thỏ. Kết quả cho thấy màng BC giúp vết th ƣơng mau
lành và ngăn không cho vết thƣơng nhiễm trùng [11]. Ngoài ra, sản phẩm BC
còn đƣợc ứng dụng trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [4, 19].
Với mục đích thiết kế một hệ thống vận tải và phân phối thuốc dựa trên
màng BC giúp BH có thể truyền tốt hơn qua da, làm thuốc đ ƣợc giải phóng
một cách kéo dài, qua đó có thể khắc phục tính tan ít trong n ƣớc đồng thời
làm tăng khả dụng sinh học của thuốc BH trong điều trị bệnh, tôi đã chọn đề
tài: “Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc Berberincủa màng
bacterial cellulose lên men từ nước vo gạo định hướng sử dụng qua da”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu,chế tạo màng BC từ vi khuẩn A. xylinum.
Thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc BH làm cho thuốc đ ƣợc
giải phóng một cách kéo dài, điều đó có thể khắc phục tính tan ít trong n ƣớc,
làm tăng khả dụng sinh học của thuốc BH trong điều trị bệnh ở ngƣời.
3. Nội dung nghiên cứu
Tạo đƣợc màng BC từ vi khuẩn A. xylinum.
Thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc qua màng BC.
Khảo sát đánh giá khả năng vận tải và phân phối thuốc BH thông qua hệ
thống vận tải đƣợc thiết kế.
4. Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học của đề tài:
Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc vận tải và phân
phối thuốc tại chỗ hoặc thẩm thấu qua da. Việc nghiên cứu ứng dụng màng
BC nhằm làm cho thuốc đƣợc giải phóng kéo dài, qua đó có thể khắc phục
hạn chế của thuốc BH dạng thƣơng mại sẽ mở ra một h ƣớng sản xuất thuốc
hiệu quả, mang lại lợi ích cho việc điều trị.
3
Đánh giá những ƣu nhƣợc điểm của màng BC nạp BH để từ đó đề xuất
hƣớng nghiên cứu trên các thuốc khác qua da.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
Tạo đƣợc màng BC từ vi khuẩn A. xylinum trong môi trƣờng nƣớc vo
gạo.
Từ màng BC đã đƣợc tạo ra đƣợc dùng làm hệ thống vận tải phân phối
thuốc nhằm làm cho thuốc đƣợc giải phóng một cách kéo dài, điều này có thể
khắc phục đƣợc tính tan ít trong nƣớc của BH để dùng trong việc tăng hiệu
quả điều trị của thuốc.
Từ kết quả nghiên cứu đƣợc có thể áp dụng vào thực tiễn.
4
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu cellulose vi khuẩn (Bacterial celluose - BC)
Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, là thành phần
chính của sinh khối thực vật cũng nhƣ đại diện cho các polymer ngoại bào
của vi sinh vật. Cellulose vi khuẩn (becterial cellulose - BC) là sản phẩm trao
đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ [9].
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra BC
Cho đến nay, A. xylinum đƣợc đánh giá là loài vi khuẩn có khả năng
sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên. Loài vi khuẩn gram âm sống hiếu
khí bắt buộc, không sinh bào tử và là một trong những loài tiến hóa nhất của
nhóm vi khuẩn tía. Mỗi tế bào A. xylinum có thể chuyển hóa tới 108 phân tử
glucose và phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả năng tổng hợp cellulose là
rất lớn [11].
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc
không và không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm nhƣng gram của
chúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi tr ƣờng nuôi
cấy. Tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn
hiếu khí bắt buộc vì thế chúng tăng trƣởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi
trƣờng lỏng và môi trƣờng khí và có khả năng tạo màng cellulose trên môi
trƣờng nuôi cấy [11].
Trên môi trƣờng rắn sau khoảng 3-7 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc A. xylinum
có dạng nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong nhƣng sau 1 tuần thì khuẩn lạc to,
đục, màu cà phê sữa, khô dần [11].
Trên môi trƣờng lỏng sau 24 giờ nuôi cấy thì xuất hiện một lớp màng
đục dày, sau 36-48 giờ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày.
5
1.1.2. Đặc điểm và ứng dụng của BC
1.1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của BC
Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc
glucopyranose nối với nhau bởi liên kết β-1,4- glucan. Các nghiên cứu cho
thấy BC có cấu trúc giống hệt PC (cellulose thực vật).Tuy nhiên, chúng khác
nhau về cấu trúc đại thể [19]. Chiều rộng của các sợi cellulose đ ƣợc tạo ra từ
gỗ thông là 30000 – 75000 nm trong khi những dải vi sợi celluose có chiều
dài từ 1 – 9 µm hình thành nên cấu trúc l ƣới dày đặc, đ ƣợc ổn định bởi các
nối hydrogen. BC khác với PC về chỉ số kết chặn, về mức độ polymer hóa.
1.1.2.2. Tính chất độc đáo của BC
Độ tinh khiết cao: BC là cellulose sinh học duy nhất đ ƣợc tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó BC có thể bị vi khuẩn phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh.
Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao,
trọng lƣợng nhẹ, độ bền đáng kể.
Khả năng hút nƣớc cực cao ở trạng thái ẩm: Khả năng giữ n ƣớc đáng
kể, lực ẩm cao. Màng cellulose vi khuẩn có khả năng giữ n ƣớc rất lớn, nó có
thể hút 60-700 lần trọng nƣớc của nó.
Màng cellulose đƣợc hình thành trực tiếp trong quá trình sinh tổng hợp
vì vậy việc sản xuất giấy, sợi không cần qua các bƣớc trung gian.
Màng cellulose đƣợc định hƣớng trong quá trình tổng hợp: Có khả năng
hình thành các sợi biến động, tạo các bền theo một trục. Theo Brown và
White (1989) [31] có thể hình thành một gang tay cellulose không cần khâu
bằng cách sử dụng một khối đất xốp mà không khí thấm qua đ ƣợc và dìm
xuống không khí bên trong môi trƣờng lỏng nuôi cấy A. xylinum, tế bào vi
6
khuẩn sẽ tập hợp xung quanh đất xốp và hình thành cellulose theo hình dạng
mong muốn.
Màng cellulose đƣợc biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: Khi
thêm chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp BC thì
có thể làm thay đổi những thuộc tính của BC. Nếu cho thuốc nhuộm vào môi
trƣờng nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lý của cellulose trong quá
trình tổng hợp.
Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động gen
liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng
cellulose, kiểm soát trọng lƣợng phân tử cellulose.
1.1.2.3. Ứng dụng của BC
Màng BC có nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣ: Độ tinh sạch, độ kết tinh, độ
bền sức căng, độ bền đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu,
khả năng giữ nƣớc và hút nƣớc cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ th ƣờng,
bề mặt dƣới của vi sợi dƣới 100 mm, bị phân hủy sinh học, có tính th ƣơng
tích sinh học, tính trơ chuyển hóa, không độc và không gây dị ứng [19].
Với những ƣu điểm nổi bật, BC ngày càng đ ƣợc nghiên cứu nhiều và
có nhiều ứng dụng rộng rãi [3, 8, 10, 11, 16, 18, 19, 20, 29] đ ƣợc thể hiện cụ
thể trong bảng 1.1.
Bảng 1.1: Ứng dụng của BC
Lĩnh vực ứng dụng
Sản phẩm
Thực phẩm
Tráng miệng
Ăn kiêng ( kem, salad)
Thịt nhân tạo
Vỏ bao xúc xích
- Xem thêm -