Tài liệu Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc berberin của màng bacterial cellulose lên men từ nước vo gạo định hướng sử dụng qua đường uống

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ™˜ === === PHẠM THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE LÊN MEN TỪ NƯỚC VO GẠO ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG QUA ĐƯỜNG UỐNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật Người hướng dẫn khoa học TS. NGUYỄN XUÂN THÀNH HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Xuân đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, khoa Sinh - KTNN, Trung tâm Hỗ trợ NCKH & CGCN Trường ĐHSP Hà Nội 2, phòng thí nghiệm Sinh lý người và động vật, cùng các thầy cô trong tổ bộ môn Động vật, ban bảo vệ đã tạo điều kiện giúp đỡ em. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quan tâm động viên của bạn bè, gia đình trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Phạm Thị Hiền LỜI CAM ĐOAN Để đảm bảo tính trung thực của đề tài, tôi xin cam đoan: 1. Đề tài của tôi không sao chép bất cứ tài liệu nào có sẵn. 2. Đề tài của tôi không trùng lặp với một đề tài nào khác. 3. Kết quả thu được trong đề tài do tự bản thân tôi nghiên cứu thực tiễn đảm bảo tính chính xác và trung thực. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Phạm Thị Hiền DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A. xylinum: Acetobacter xylinum BC: Bacterial cellulose BH: Berberine hydrochloride OD: Optical density UV - vis: Ultraviolet visible DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Kết quả nhuộm Gram âm của A. xylinum......................................... 7 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của BH Sơ đồ 2.1. Quy trình nuôi cấy thu nhận BC....................................................15 Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn BH.................................................. 16 Hình 3.1. Màng BC trong môi trường nuôi cấy..............................................21 Hình 3.2. Màng BC đang xử lý trong nước.....................................................22 Hình 3.3. Màng BC tinh chế........................................................................... 23 Hình 3.4. a,b Màng BC tinh chế ở các độ dày khác nhau.............................. 24 Hình 3.5. Màng BC đang nạp thuốc............................................................... 25 Hình 3.6. Thời gian và giá trị OD345nm của thuốc BH giải phóng qua BC trong các môi trường pH và độ dày màng khác nhau..............................................28 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Thành phần và khối lượng các chất trong môi trường nuôi cấy màng BC..........................................................................................................13 Bảng 2.2. Bảng nồng độ BH và giá trị OD345nm.............................................15 Bảng 2.3. Dung dịch đệm đa năng Britton và Robinson.................................17 Bảng 3.1. Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng BC........................................ 25 Bảng 3.2. Tỷ lệ thuốc hấp thụ vào màng BC...................................................27 Bảng 3.3. Khối lượng thuốc giải phóng qua màng BC...................................29 Bảng 3.4. Tỷ lệ thuốc giải phóng qua màng BC.............................................30 Bảng 3.5. Hệ số tương quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và các giá trị mũ số giải phóng (n) từ các môi trường pH và độ dày màng khác nhau........32 MỤC LỤC MỞ ĐẦU...........................................................................................................1 1. Lí do chọn đề tài............................................................................................1 2. Mục đích nghiên cứu.....................................................................................3 3. Nội dung nghiên cứu.....................................................................................3 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài......................................... 4 4.1. Ý nghĩa khoa học....................................................................................... 4 4.2. Ý nghĩa thực tiễn........................................................................................4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................5 1.1. Đại cương về vi khuẩn A. xylinum và màng BC........................................5 1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. xylinum 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A. xylinum 1.1.3. Màng BC của vi khuẩn A. xylinum 1.2. Thuốc BH...................................................................................................7 1.2.1. Cấu trúc...................................................................................................7 1.2.2. Nguồn gốc...............................................................................................8 1.2.3. Tính chất vật lý........................................................................................8 1.2.4. Tính chất hóa học....................................................................................8 1.2.5. Tác dụng dược lý và ứng dụng................................................................9 1.2.6. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc BH 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam...................................10 1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc.................................................................. 10 1.3.1.1. Trên thế giới 1.3.1.2. Ở Việt Nam 1.3.2. Tình hình nghiên cứu màng BC.................Error! Bookmark not defined. 1.3.2.1. Trên thế giới 1.3.2.2. Ở Việt Nam CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............12 2.1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................. 12 2.1.1 Giống vi khuẩn.......................................................................................12 2.1.2. Thuốc BH có xuất sứ từ Sigma - Mỹ.................................................... 12 2.1.3. Nguyên liệu - hóa chất.......................................................................... 12 2.1.4. Thiết bị và dụng cụ................................................................................12 2.2. Địa điểm nghiên cứu................................................................................13 2.3. Phạm vi nghiên cứu..................................................................................13 2.4. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................13 2.4.1. Phương pháp lên men thu màng BC..................................................... 13 2.4.2. Phương pháp xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc......................... 14 2.4.3. Phương pháp xác định khối lượng BC tạo thành.................................. 15 2.4.4. Phương pháp sử dụng đường chuẩn xác định khối lượng thuốc hấp thụ qua màng BC...................................................................................................15 2.4.5. Phương pháp sử dụng đường chuẩn xác định khối lượng thuốc giải phóng qua màng BC........................................................................................17 2.4.6. Phương pháp xử lý thống kê.................................................................18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.......................................................20 3.1. Kết quả đạt được......................................................Error! Bookmark not defined. 3.1.1. Tạo được màng BC tinh khiết...............................................................20 3.1.2. Khảo sát khối lượng thuốc hấp thụ vào màng.......................................24 3.1.3. Khảo sát khối lượng thuốc giải phóng qua màng................................. 28 3.2. Kiến nghị......................................................................Error! Bookmark not defined. KẾT LUẬN.....................................................................................................33 TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................35 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Berberine hydrochloride (BH) đã được biết đến như một chất kháng khuẩn tự nhiên trong việc điều trị các bệnh lý như tiêu chảy, viêm đường tiêu hóa do vi khuẩn tả, E. coli, amip đường ruột 23, 31 . Theo một vài nghiên cứu gần đây, BH còn có tác dụng tốt trong việc điều trị một số bệnh mãn tính như tiểu đường, viêm khớp, hạ lipid, cholesterol máu, đặc biệt là bệnh viêm đại tràng. BH sở hữu tính chất dược khác nhau bao gồm cả tác dụng chống ung thư 23 . Tuy nhiên sinh khả dụng đường uống của nó thấp và có khả năng gây tác dụng phụ cho vận chuyển thuốc ngoài đường tiêu hóa 23 .Trong quá trình sử dụng có thể bị các tác nhân khác gây ảnh hưởng làm giảm hiệu quả hấp thụ 23 . Bacterial cellulose (BC) là sản phẩm của một loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng Acetorbacter xylinum (A. xylinum) 2, 5 . BC có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β - 1, 4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bề dày của vi sợi lớn hơn 100 nm, bị phân hủy sinh học, có tính tương thích sinh học, tính trơ chuyển hóa, không độc và không gây dị ứng 2, 5 . Trên thế giới màng BC đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt 1 trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, thiết kế hệ thống vận tải phân phối thuốc và rất nhiều ứng dụng khác 19 . Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người 9, 19 . Amin et al. 18 đã báo cáo việc sử dụng màng BC làm màng bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy màng BC có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc. Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC mới được quan tâm gần đây và đã đạt được kết quả bước đầu. Đề tài của Nguyễn Văn Thanh 5 – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh 2006 đã “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”. Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp 5 . Về mặt tính chất BC có độ tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn 5 . Ngoài ra BC còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, khả năng thấm hút lớn, đường kính sợi nhỏ, chứa nhiều dưỡng chất. Đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của UV, ổn định về kích thước và hướng, màng BC còn có ý nghĩa giữ thuốc và giải phóng thuốc từ từ 17, 24 . Bên cạnh đó, các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trường axít. Do đó, cần thiết kế một loại thuốc uống vận tải phân phối thuốc để làm tăng độ hòa tan và khả dụng sinh học của BC 23 . Uống là một trong những đường ưa thích nhất và truyền thống để phân phối thuốc. So với đường tiêm hệ thống phân phối thuốc, lợi thế chính của nó 2 vĩ đại nhất là an toàn, đơn giản, tiện lợi và tuân thủ của bệnh nhân, trong đó tăng hiệu quả điều trị thuốc uống 23 . Nó cũng ngăn chặn nguy cơ lây truyền bệnh, làm giảm chi phí và cho phép linh hoạt hơn hoặc kiểm soát liều lượng 23 . Nhờ những đặc tính độc đáo trên của BC nhằm duy trì hiệu quả thời gian chữa bệnh tăng khả năng phân phối thuốc có kiểm soát , tăng thời gian cư trú của thuốc trong đường ruột đạt hiệu quả cao. Cách tiếp cận này có thể được sử dụng để tăng cường khả dụng sinh học đường uống của thuốc. Với mục đích thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc dựa trên màng BC để khảo sát khả năng hấp thụ và giải phóng qua màng BC của thuốc BH, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc Berberin của màng Bacterial cellulose lên men từ nước vo gạo định hướng sử dụng qua đường uống”. 2. Mục đích nghiên cứu Tạo được màng BC từ chủng A. xylinum. Thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc qua màng BC định sử dụng qua đường uống để tăng cường sự giải phóng kéo dài của thuốc, tăng hàm lượng thuốc được hấp thụ. Khảo sát khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc BH thông qua hệ thống vận tải được thiết kế. Đánh giá khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc BH thông qua hệ thống vận tải được thiết kế. Sử dụng màng để bảo vệ thuốc BH tránh tác nhân gây ảnh hưởng tới thuốc trong quá trình sử dụng. 3. Nội dung nghiên cứu Tạo màng BC từ chủng A. xylinum. 3 Thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc qua màng BC định hướng sử dụng qua đường uống. Xây dựng được đồ thị đường chuẩn BH từ đó xác định khối lượng thuốc được hấp thụ và giải phóng qua màng BC. Khảo sát, đánh giá khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc BH thông qua hệ thống vận tải đã thiết kế. 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng BC (dựa vào màng BC để thiết kế hệ thống vận tải phân phối thuốc). 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Từ màng BC đã được tạo ra được dùng làm hệ thống vận tải phân phối thuốc nhằm khảo sát được lượng thuốc BH hấp thụ và giải phóng qua màng BC. Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn. 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về vi khuẩn A. xylinum và màng BC 1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. xylinum Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey 20 thì A. xylinum thuộc giống Acetorbacter, họ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một số tác giả coi A. xylinum như một loài phụ của Acetobacter Acei 20 . A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bảo tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram như hình 1.1. có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi 20 . Hình 1.1. Kết quả nhuộm Gram của A. xylinum Khuẩn lạc của A. xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt 2 - 5 mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn 28 . 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A. xylinum 5 Vi khuẩn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 35 C, pH = 4 - 6. Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 37 C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả ở trong môi trường tối ưu 8 . A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ 8 . Các đặc điểm sinh hóa dùng định danh của A. xylinum bao gồm: oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O, phản ứng catalase dương tính, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer. Chuyển hóa glucose thành acid, chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton, không sinh sắc tố nâu, tổng hợp cellulose 8. 1.1.3. Màng BC của vi khuẩn A. xylinum Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A. xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng BC 28 . * Cấu trúc của màng BC Cellulose vi khuẩn tạo bởi những chuỗi polimer β - 1, 4 glucopyranose không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của BC giống cellulose của thực vật (plant cellulose – PC), tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể 5, 19 . Theo AJ. Brown (1886) 18 , BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1.5 nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 – 8 nm 2, 19 . Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0.01 – 0.5 nm. Sản phẩm này có những tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh 6 và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn 5 . Với các tính chất này BC được ứng dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học 17 Almeida, IF. et al 18 màng BC như hệ thống phân phối thuốc. Trường Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng BC có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng ở thỏ 3 . Kết quả cho thấy màng BC giúp vết thương mau lành và ngăn không cho vết thương nhiễm trùng 5 . Ngoài ra, sản phẩm BC còn được ứng dụng trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan 2, 23 . 1.2. Thuốc BH 1.2.1. Cấu trúc BH là một alkaloid thực vật thuộc nhóm isoquinol có khung protoberberin 1 . Isoquinolin còn được gọi là benzo pyridin hay 2 - benzamin là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic 33 . Công thức cấu tạo Hình 1.2. Công thức cấu tạo của BH 7