Tài liệu Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn geobacillus stearothermophilus để phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------- VƢƠNG THANH HƢƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Geobacillus stearothermophilus ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH TRONG SỮA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------- VƢƠNG THANH HƢƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Geobacillus stearothermophilus ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH TRONG SỮA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. MAI THỊ ĐÀM LINH Hà Nội - Năm 2017 Luận văn thạc sỹ MỞ ĐẦU Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1928 bởi Alexander Flemming, chất kháng sinh được coi là công cụ hữu hiệu trong việc điều trị bệnh cho người và động vật. Chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp như chăn nuôi, trồng trọt, nuôi truồng thủy hải sản, … có tác dụng rất lớn là giúp cho vật nuôi trồng chống lại bệnh tật. Việc sử dụng chất kháng sinh trong chăn nuôi đã được chứng minh là làm tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng, khả năng thu nhận thức ăn của vật nuôi đề kháng lại các bệnh tật. Do hiệu quả nhanh và mạnh, chất kháng sinh hiện nay được sử dụng tràn lan và phổ biến trong chăn nuôi mà không được kiểm soát. Điều này dẫn đến một thực trạng là hiện tượng tồn dư chất kháng sinh trong vật nuôi gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm. Tại Việt Nam, trong chăn nuôi gia súc, gia cầm hiện nay người dân sử dụng rất tùy tiện các loại thức ăn có chứa chất tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa, trị bệnh cho vật nuôi và giúp vật nuôi mau ăn chóng lớn. Hậu quả là dư lượng chất kích thích và thuốc kháng sinh trong thực phẩm từ vật nuôi này vượt ngưỡng cho phép gấp nhiều lần. Trong ngành sản xuất sữa hiện nay, việc sử dụng thuốc kháng sinh để phòng và chữa bệnh cho bò (phổ biến là bệnh viêm vú bò) là nguyên nhân gây ra sự tồn dư thuốc kháng sinh trong mô và trong sữa của bò. Kháng sinh tồn dư trong sữa bò, dê, cừu gây ức chế vi khuẩn được dùng trong quá trình chế biến sữa, đặc biệt là quá trình chế biến phomat, sữa chua khi phải dùng vi khuẩn để lên men. Đồng thời sự tồn dư lượng kháng sinh trong sữa gây nguy hiểm cho trẻ em và người già, là những đối tượng dùng sữa nhiều. Các nước Châu Âu đã ngừng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi từ năm 2006. Mỹ và Thái Lan sẽ ngừng sử dụng trong năm 2017. Quốc tế đã có rào cản của riêng mình để nói không với thực phẩm chứa kháng sinh. Ở Việt Nam, vấn đề kiểm tra và kiểm soát dư lượng kháng sinh trong sữa đang được quan tâm. Trước đòi hỏi ngày càng cao về chất lượng và độ an toàn của các sản phẩm có nguồn gốc từ đồng Hv: Vương Thanh Hương 1 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ vật của con người, ngoài việc tăng cường quản lý các công đoạn sản xuất thì việc xác định nhanh hàm lượng kháng sinh tồn dư trong thực phẩm là điều rất cần thiết. Có rất nhiều phương pháp phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa như phương pháp sắc ký, phương pháp sắc ký miễn dịch, phương pháp ELISA,... Các phương pháp này hầu hết có độ nhạy cao, kết quả khá chính xác. Tuy nhiên quy trình thường phức tạp, cần có trang thiết bị đi kèm và cần kỹ thuật viên chuyên nghiệp cao. Hơn nữa quá trình kiểm nghiệm đều phải lấy mẫu ngay và thực hiện trong phòng thí nghiệm. Hiện nay, các phương pháp phân tích bằng vi sinh vật được sử dụng phổ biến để xác định dư lượng kháng sinh vì tính đơn giản, tiện lợi của nó. Có nhiều test vi sinh vật đã được nghiên cứu và ứng dụng để xác định kháng sinh trong nhiều loại sản phẩm. Geobacillus stearothermophilus là chủng vi sinh vật ưa nhiệt, rất nhạy cảm với kháng sinh, được sử dụng phổ biến trong các test của nước ngoài. Tuy nhiên các test này có giá thành rất cao, thủ tục nhập khẩu đòi hỏi thời gian, gây trở ngại cho việc áp dụng rộng rãi ở Việt Nam. Để chủ động trong nghiên cứu cũng như đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus để phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa”. Mục tiêu của đề tài Xây dựng được quy trình chế tạo test thử từ bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus để phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa tươi nguyên liệu. Hv: Vương Thanh Hương 2 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tình hình sản xuất sữa tƣơi ở Việt Nam: Là quốc gia đông dân với mức tăng trưởng dân số cao, khoảng 1,2%/năm, Việt Nam được đánh giá là thị trường tiềm năng cho các hãng sản xuất sữa. Với tỷ lệ tăng trưởng GDP 6-8%/năm, thu nhập bình quân đầu người tăng 14,2%/năm cùng với xu hướng cải thiện sức khỏe và tầm vóc của người Việt khiến nhu cầu sử dụng các loại sữa và các sản phẩm từ sữa luôn ở mức cao. Theo dự báo của Hiệp hội Sữa Việt Nam (VDA), lượng sữa tiêu thụ bình quân đầu người tại Việt Nam vào năm 2010 đạt 15 lít/năm và sẽ tăng gần gấp đôi, lên mức 28 lít/năm vào năm 2020 [15]. Tăng trưởng doanh thu ngành sữa chủ yếu là sữa bột và sữa nước, chiếm 74% tổng giá trị thị trường. Tuy nhiên, năng lực sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa trong nước được dự báo sẽ không theo kịp nhu cầu tiêu thụ, đặc biệt là trong lĩnh vực sản xuất sữa tươi. Lượng sữa tươi nguyên liệu trong nước chỉ đáp ứng được 30% nhu cầu sử dụng [15]. Trong khi đó, chất lượng sữa thấp, không ổn định do nguồn cung cấp chủ yếu từ các hộ chăn nuôi nhỏ, năng suất thấp. Nắm bắt được tiềm năng tăng trưởng của thị trường, ngày càng có nhiều doanh nghiệp tham gia vao ngành chế biến sữa Việt Nam. Đặc biệt, đa phần các doanh nghiệp hiện đang tập trung đầu tư phát triển vùng nguyên liệu của riêng mình dưới nhiều hình thức nhằm giải quyết được nhược điểm lớn nhất của ngành sữa Việt Nam là thiếu hụt nguyên liệu. Một trong những doanh nghiệp sữa thành công nhất với việc tạo lập vùng nguyên liệu để phát triển sản phẩm là Công ty Cổ phần sữa TH (nhãn hiệu sữa TH true milk). Các doanh nghiệp khác cũng không đứng ngoài cuộc đua phát triển vùng nguyên liệu như Công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk, Công ty cổ phần Thực phẩm dinh dưỡng NutiFood Việt Nam, … Sức hấp dẫn của thị trường sữa Việt Nam không chỉ kích thích các doanh nghiệp nội địa mở rộng sản xuất mà còn thu hút nhiều nhà đầu tư nước ngoài bỏ vốn vào ngành. Ví dụ, doanh nghiệp sữa Friesland Campina Việt Nam (nhãn hiệu sữa Cô gái Hà Lan) đang xúc tiến đẩy mạnh phát triển vùng nguyên liệu tại tỉnh Hà Nam theo hình thức hợp tác Hv: Vương Thanh Hương 3 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ với các hộ nông dân, hình thành các trang trại chăn nuôi bò sữa quy mô gia đình (50 - 80 bò sữa/trại) khác với mô hình trại lớn 500 - 1000 bò sữa/trại của các doanh nghiệp khác. [15] Có rất nhiều doanh nghiệp tham gia vào ngành chế biến sữa do họ nắm bắt được tiềm năng tăng trưởng của thị trường. Điều này dẫn đến sự cạnh tranh gay gắt của các hãng sữa trong việc đưa ra sự lựa chọn sản phẩm sữa tốt nhất cho người tiêu dùng. Vấn đề chất lượng và an toàn vệ sinh thực phẩm của các sản phẩm này được đặt lên hàng đầu. Một vấn đề đang được quan tâm hiện nay là xuất hiện sự tồn dư của chất kháng sinh trong các sản phẩm sữa. Nguyên nhân là do người dân sử dụng kháng sinh bừa bãi trong chăn nuôi, quy trình sử dụng không được kiểm soát. Do đó việc kiểm soát chất lượng sữa, đặc biệt là dư lượng kháng sinh trong sữa ngay tại nguồn là vấn đề đang được quan tâm và đẩy mạnh. Hình 1.1. Quy trình kiểm soát chất lượng sữa đầu vào trước khi xử lý Hv: Vương Thanh Hương 4 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ 1.2. Tình hình sử dụng chất kháng sinh trong chăn nuôi: 1.2.1. Trên thế giới: Kháng sinh đã và đang đóng vai trò quan trọng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản, không chỉ để phòng và trị bệnh mà còn được dùng như một chất kích thích sinh trưởng ở liều thấp (2,5 - 50 ppm) [8,52]. Nhu cầu về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi động vật nói chung và nuôi bò sữa nói riêng là rất lớn. Việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi được đánh dấu bằng một thí nghiệm của Stokstad và Juke năm 1949 [65] khi cho gia cầm ăn thức ăn có bổ sung Chlortetracycline, nhận thấy tốc độ sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của gia cầm tăng rõ rệt. Vì thế, người ta đã đưa vào thức ăn của gia súc, gia cầm nhiều loại thuốc kháng sinh như Oxytetracycline, Aureomycine, Penicillin, Streptomycine. Mỹ là nước đầu tiên phát hiện ra hiệu quả sử dụng kháng sinh làm chất kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi. Ở Mỹ hàng năm có khoảng 6 triệu pao (xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh được dùng trong chăn nuôi. Theo thống kê, xấp xỉ 80% số gia cầm, 70% lợn, 70% bò sữa và 60% bò thịt được nuôi dưỡng bằng thức ăn có bổ sung kháng sinh. Ước tính cứ mỗi USD chi phí cho kháng sinh dùng trong thức ăn, người chăn nuôi thu được lợi tức 2-4 USD [33]. Cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm (FDA) Mỹ đã ban hành các quy định về việc cho phép sử dụng kháng sinh để kích thích tăng trọng từ năm 1951. Theo Hội đồng nghiên cứu Quốc Gia Hoa Kỳ (NRC), 1998, Mỹ và Canada đã cho phép sử dụng 17 loại kháng sinh vào thức ăn cho lợn, trong đó có 8 loại phải ngừng sử dụng trước khi giết mổ từ 570 ngày. Liều lượng bổ sung thường rất thấp tùy theo loại kháng sinh, nhưng nếu sử dụng Chlotetracycline hay Zinbacitracilin thì hàm lượng đó là 30 đến 40 ppm. [33] Ở Anh và Pháp, trung bình một năm có khoảng 75% số động vật được dùng kháng sinh để điều trị và gần 60% động vật được dùng kháng sinh để phòng bệnh. Ở Anh, Tetracycline là nhóm kháng sinh được sử dụng nhiều nhất để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, chiếm hơn 50% tổng số kháng sinh [52]. Theo số liệu của Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong dân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10500 tấn (quy theo mức 100% tinh khiết của các thành Hv: Vương Thanh Hương 5 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong dân y, 33% trong điều trị thú y và 15% như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi. Trong đó, tỷ lệ các loại kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi: Penicillin 9%; Tetracycline 66%; Macrolide 12%; Aminoglycoside 4%; Fluoroquinolone 1%; Trimethomprimsulfamid 2% và các kháng sinh khác 6% [10]. Việc bổ sung kháng sinh với liều lượng thấp được xác nhận là cải thiện về trọng lượng vật nuôi, giảm lượng thức ăn cho vật nuôi, giúp vật nuôi chống lại bệnh tật. Tuy nhiên, việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp hoặc sử dụng sai nguyên tắc thuốc thú y nói chung và kháng sinh nói riêng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản đã gây hiện tượng kháng thuốc hoặc tồn dư thuốc trong sản phẩm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng, môi trường cũng như hiệu quả điều trị bệnh [20,23]. Chính vì vậy, để tăng cường kiểm soát dư lượng thuốc, các nước phát triển đã có những qui định rất chặt chẽ và kiểm soát nghiêm ngặt. Ngày 22/12/2009 EU đã ban hành quyết định số 37/2010 thay cho quyết định số 2377/90 EC quy định giới hạn tồn dư thuốc thú y cho phép trong sản phẩm động vật [34]. Hoa Kỳ và Liên minh Châu Âu cho phép dư lượng tối đa của kháng sinh trong thịt và phủ tạng động vật là 100 µg/kg, trong khi đó, Nhật Bản chỉ cho phép 20 µg/kg và Hàn Quốc là 10 µg/kg [17,22,28]. Do phát hiện ra những độc tính của Chloramphenicol (CAP) lên cơ quan tạo máu (có thể gây thiếu máu không tái tạo, không phục hồi do suy tủy, gây tử vong) nên từ năm 1990 Ủy ban Châu Âu đã cấm sử dụng CAP trong thú y. [3] 1.2.2. Tại Việt Nam: Ở Việt Nam kháng sinh được sử dụng tràn lan để phòng bệnh và trị bệnh nên tình trạng tồn dư kháng sinh trong thịt và sữa là rất phổ biến. Có tới 60-70% tổng các thuốc đang dùng để phòng trị bệnh cho vật nuôi là thuốc hóa học trị liệu trong đó chủ yếu là thuốc kháng sinh [16]. Theo Lã Văn Kính và cộng sự (2007), tỷ lệ sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi ở nước ta là rất cao: 100% các cơ sở chăn nuôi có sử dụng Oxytetracycline, 67% các cơ sở chăn nuôi có sử dụng Chloramphenicol Hv: Vương Thanh Hương 6 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ (mặc dù thuốc này đã bị cấm không được dùng để điều trị), 30% có sử dụng Olaquindox, 77% các cơ sở chăn nuôi có sử dụng Dexamethasol [12,13]. Công bố nghiên cứu của khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh có 628 hộ chăn nuôi lợn, gà cho thấy đa số người chăn nuôi sử dụng kháng sinh không hợp lý như liều cao, sử dụng liên tục để phòng ngừa bệnh cho gia súc cho đến khi nào bán được. Kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà trên địa bàn tỉnh Bình Dương cho thấy có 26 loại kháng sinh đã được sử dụng. Trong đó, loại được sử dụng nhiều nhất là Chloramphenicol (chiếm 15,35%), Tylosin (15%), Colistin (13,24%), Norfloxacin (10%), Gentamycin (8,35%), nhóm Tetracycline (7,95%), Ampicillin (7,24%), các cơ sở sử dụng kháng sinh không hợp lý chiếm 17,22%, chủ yếu là sai về liều lượng (12,57%) và liệu trình điều trị (3,09%) đồng thời số cơ sở không tuân thủ các quy định về thời gian ngưng thuốc trước khi giết mổ chiếm tới 40,13% [14,18]. Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở các hộ chăn nuôi trên địa bàn Hà Nội, kết quả nghiên cứu của Lê Thị Ngọc Diệp cho thấy kháng sinh thuộc hai nhóm Quinolones và Macrolides được sử dụng nhiều nhất với tỷ lệ tương ứng là 78,14% và 86,89%. Các nhóm kháng sinh khác là Polipeptides (54,92%), Aminoglycosides (50,96%), β-lactams (4,58%) và Tetracycline (46,58%) [5]. Từ năm 2003 - 2006, kết quả phân tích lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng trong 150 mẫu thịt và gan của gia cầm, gia súc thu thập tại Hà Nội của Khoa Thực phẩm và vệ sinh an toàn thực phẩm, Viện dinh dưỡng Quốc gia cho thấy: đã phát hiện tồn dư thuốc kháng sinh nhóm Tetracycline trong 18 mẫu, chiếm tỷ lệ 12%. Có 5,5% số mẫu trong 290 mẫu thịt lợn trên thị trường Hà Nội có tồn dư kháng sinh Tetracycline. Tại các khu vực chăn nuôi ở miền nam cũng nhận thấy có 4 cơ sở chiếm 22,2% các mẫu thịt gà có tồn dư các loại kháng sinh Tetracycline, Amoxyline, Erofloxacine với hàm lượng cao gấp từ 1,4 – 30,9 lần so với ngưỡng cho phép [14]. Hv: Vương Thanh Hương 7 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ Các bệnh của bò thường được điều trị bằng kháng sinh như bệnh nhiễm khuẩn nặng, viêm vú, viêm tử cung, viêm phổi, viêm móng, khớp, tiêu chảy,… Kết quả nghiên cứu của Sa Đình Chiến và Cộng sự [4] cho thấy bệnh viêm vú đang gây thiệt hại đáng kể cho người chăn nuôi. Tỷ lệ viêm vú lâm sàng của bò sữa mới nhập vào địa bàn Mai Sơn, Sơn La là 27,46 %, viêm vú phi lâm sàng là 48,16 %. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến phát sinh phát triển bệnh viêm vú. Kháng sinh được sử dụng để điều trị bệnh viêm vú bò sữa là: Amoxilin, Lincomycin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, Cefazolin, Neomycin, Tetracyclin, Gentamycin. Hình 1.2. Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi trên địa bàn tỉnh Bình Dương [18] 1.3. Tồn dƣ chất kháng sinh trong thực phẩm: Theo tiêu chuẩn Việt Nam số 7405:2004 [1] về sữa tươi nguyên liệu - yêu cầu kỹ thuật cho phép giới hạn tối đa dư lượng thuốc thú y như sau: Hv: Vương Thanh Hương 8 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ Bảng 1.1. Giới hạn tối đa dư lượng kháng sinh cho phép trong sữa Tên chất - Chloraphenicol Mức tối đa (g/kg) 0 - Coumaphos 0 - Penicillin 4 - Ampicillin 4 - Amoxicillin 4 - Oxacillin 30 - Cloxacillin 30 - Dicloxacillin 30 - Cephalexine 100 - Ceftiofur 100 - Gentamicin 100 - Tetracylin 100 - Oxytetracyllin 100 - Chlortetracyllin 100 - Sulfonamin 100 1.3.1. Nguyên nhân: Dư lượng kháng sinh là tình trạng tồn tại của chất kháng sinh trong thực phẩm (thịt, cá, trứng, sữa,...) ở dạng nguyên chất hay đã bị chuyển hóa mà việc sử dụng những loại thực phẩm này có thể gây ra những tác hại không ngờ đối với người tiêu dùng. Có hiện tượng dư lượng kháng sinh là do việc không tuân thủ quy định về sử dụng kháng sinh trong thực phẩm, chăn nuôi, thuốc bảo vệ thực vật; sử dụng các chất kích thích sinh trưởng, thuốc thú y trong chăn nuôi và thuốc bảo vệ thực vật ngoài danh mục cho phép; sử dụng kháng sinh để bảo quản thực phẩm. Dư lượng kháng sinh là một trong những nguyên nhân của tình trạng mất an toàn vệ sinh thực phẩm. Kháng sinh đã và đang đóng vai trò quan trọng trong chăn nuôi, không chỉ để đề phòng và trị bệnh mà còn được dùng ở liều thấp như một chất kích thích sinh trưởng [6,30,52]. Việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp hoặc sử dụng sai nguyên tắc Hv: Vương Thanh Hương 9 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ các chất kháng sinh trong chăn nuôi đã gây hiện tượng kháng thuốc hoặc tồn dư thuốc trong sản phẩm thực phẩm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng cũng như hiệu quả điều trị bệnh [20,23]. Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh chính: - Kháng sinh có thể nhiễm vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh. - Kháng sinh có thể tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi do sử dụng thường xuyên trong thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trọng cho gia súc (liều thấp) hoặc cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh (liều trung bình). - Kháng sinh có thể cho thẳng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật, để bảo quản thực phẩm. - Kháng sinh sử dụng để chữa bệnh cho gia súc (liều cao). 1.3.2. Tác hại: 1.3.2.1. Nguy cơ đối với sức khỏe cộng đồng: - Gây dị ứng, phản ứng quá mẫn: Theo các báo cáo về y tế, Penicillin là kháng sinh thường gây dị ứng nhất. Kết quả nghiên cứu của Jones đã chỉ ra rằng có khoảng 5-10% dân số mẫn cảm đối với Penicillin hoặc kháng sinh khác với biểu hiện dị ứng da, mệt mỏi, nôn, thậm trí sốc ngay ở nồng độ thấp (1ppb) [48]. Đã có trường hợp người bị nổi mẫn da trầm trọng vì uống sữa có dư lượng Penicillin (<1 IU/ngày tương đượng 0,003 IU/ml). Một số trường hợp khác gây ngứa da tay, da mặt sau khi ăn thịt bò có tồn dư Penicillin hoặc thịt heo từ thú mới điều trị bằng Penicillin cách đó 3 ngày. Gây sốc quá mẫn dẫn đến chết người ở người có cơ địa dị ứng với kháng sinh. - Gây ngộ độc: Cloramphenicol là loại kháng sinh cấm sử dụng trên thế giới do gây thiếu máu suy tủy (phụ thuộc liều), đôi khi gây thiếu máu bất sản (không phụ thuộc liều) ở những cá thể đặc ứng do di truyền có thể dẫn đến tử vong. Một số thuốc như Nitrofurans, Quinoxalinedinoxides và Nitroimidazoles cần có sự kiểm soát nghiêm ngặt vì sự tích lũy thuốc do dùng lâu ngày có thể gây suy gan, suy thận Hv: Vương Thanh Hương 10 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ thậm chí gây ung thư, đột biến gen (do các loại kháng sinh chủ yếu tồn dư tại gan thận là cơ quan lọc thải trừ phân giải chất dinh dưỡng). - Chất kháng sinh còn gây ra những mối nguy hiểm tiềm tàng cho các thế hệ sau. Nếu sử dụng kháng sinh Nitrofurane trong thời gian mang thai có thể gây quái thai, dị dạng. - Tạo dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh: Đề kháng kháng sinh hiện nay đang là vấn đề toàn cầu bởi trong vòng 15 - 20 năm trở lại đây chưa có một kháng sinh kiểu mới nào được phát hiện trong khi không có kháng sinh nào là không bị kháng do sử dụng các sản phẩm động vật có tồn dư kháng sinh. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy ở bệnh viện Bạch Mai, tỷ lệ E.coli kháng kháng sinh tăng từ 18% năm 2005 lên 42% năm 2008: cho thấy mức độ kháng kháng sinh Tetracycline là 88,6%, Ciprofloxacine là 82,3% [12]. 1.3.2.2. Nguy cơ đối với môi trường: Những chất kháng sinh không rõ nguồn gốc được tổng hợp bằng các loại phụ gia gây ô nhiễm môi trường nặng nề không kém rác thải công nghiệp. Chất kháng sinh vào cơ thể vật nuôi thông qua thức ăn hoặc bằng các con đường khác đều được thải ra môi trường. Ảnh hưởng của việc thải chất kháng sinh đến môi trường được thể hiện ở các khía cạnh sau: + Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật đất: chất kháng sinh dù bằng con đường nào được thải ra môi trường đều phá vỡ sự cân bừng sinh thái hệ vi sinh vật và ảnh hưởng đến độ phì của đất, tăng ô nhiễm môi trường. + Sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường: chất thải của vật nuôi khi điều trị hoặc nuôi dưỡng bằng các loại thức ăn có kháng sinh, không chỉ gồm các cặn bã của quá trình tiêu hóa hấp thu mà còn chứa rất nhiều loại vi sinh vật kháng thuốc, nhất là các chủng vi khuẩn đa kháng. Chúng là vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh trong môi trường. 1.3.2.3. Nguy cơ đối với công nghệ chế biến bảo quản thực phẩm: Chất kháng sinh có thể gây trì hoãn sự khởi đầu tích cực của các vi sinh vật có lợi trong sản xuất bơ, phomat, sữa chua chỉ với nồng độ 1ppb. Kháng sinh còn Hv: Vương Thanh Hương 11 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ làm giảm bớt mùi, vị và độ axit trong các sản phẩm, làm giảm quá trình đông tụ của sữa, đồng thời nó cũng là nguyên nhân không thể chấp nhận được với sự chín muồi của phomat [48]. Sự có mặt của kháng sinh trong thịt gây nên những tác dụng ngoài mong muốn trong sản xuất xúc xích và các sản phẩm lên men thịt khác. Người tiêu dùng khó nhận biết được những sản phẩm có tồn dư kháng sinh nếu không có chuyên môn. Vấn đề này cần phải được bắt đầu giải quyết từ quy trình nuôi gia súc, gia cầm. Khi đó sẽ cải thiện được chất lượng của thực phẩm chế biến từ động vật cũng như tránh được tình trạng kháng kháng sinh cho người. Do đó cần phải biết được phương pháp xác định dư lượng thuốc kháng sinh trong thực phẩm để hạn chế được những tác dụng nguy hại từ những thực phẩm chứa dư lượng thuốc kháng sinh quá tiêu chuẩn cho phép. 1.4. Các phƣơng pháp phát hiện dƣ lƣợng kháng sinh trong sữa: Hiện nay, việc phân tích nhóm kháng sinh trong các nền mẫu sinh học (có nguồn gốc từ động vật) rất đa dạng, trong đó tập trung vào các phương pháp chính như: Xác định định tính nhờ vi sinh vật [6,24,58], xác định bán định lượng bằng phương pháp ELISA, định lượng kháng sinh bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử [25], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [9,21,62],… 1.4.1. Phương pháp khẳng định (lý hoá) Phương pháp này cho phép có thể nhận diện chất kháng sinh tồn dư, định lượng chính xác và đối chiếu MRL (dư lượng tối đa cho phép). 1.4.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Sắc ký lỏng hiệu năng cao (còn được gọi là Sắc ký lỏng áp suất cao) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Hiện nay, HPLC đang ngày càng phát triển và được ứng dụng rất nhiều trong các ngành phân tích định tính và định lượng đặc biệt được ứng dụng trong phân tích dư lượng kháng sinh sữa, phân tích các hợp chấ t thuốc trừ sâu , các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường… Khả năng phát hiện dư lượng kháng sinh: HPLC có khả năng phát hiện tất cả các kháng sinh có mặt trong thực phẩm, các kháng sinh thuộc nhóm Betalactams, Hv: Vương Thanh Hương 12 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ Tetracyclines, Sulphonamides, Macrolides, Chloramphenicol,… William và cộng sự đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng kháng sinh tetracycline trong các mẫu thịt và sữa bò với ngưỡng phát hiện là 20-50 ppb trong mẫu thịt và 4-8 ppb trong các mẫu sữa [68], xác định được dư lượng kháng sinh Sulfamethazine ở 3 trong 4 mẫu sữa bò đã phân tích với hàm lượng 12,2 μg/kg cao hơn rất nhiều so với giới hạn cho phép [26]. Sử dụng phương pháp HPLC để xác định các dư lượng kháng sinh Cefotaxime và Cephalexine trong sữa, với giới hạn xác định tương ứng là 0,1 và 0,3 ng/ml [64]. Tác giả W. Hela và cộng sự [41] đã phát triển phương pháp HPLC với detector DAD để xác định 12 kháng sinh thuộc nhóm Sulfonamid (SAs) trong thịt, gan, thận động vật (lợn, bò, gà). Tại Việt Nam, TCVN 8345- 2010 [2] qui định phương pháp xác định 10 SAs trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Phương pháp này cũng được áp dụng để xác định dư lượng các thuốc thú y có chứa Cephalexine. Phương pháp HPLC có thể kết hợp với các phương pháp sắc ký khác như sắc ký khí, khối phổ cho phép xác định chính xác các dư lượng kháng sinh trong các mẫu phân tích. HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu, pháp lý và y dược [40]. Hình 1.3. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Hv: Vương Thanh Hương 13 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ 1.4.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS): Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography - HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry - MS). Phương pháp này đã được nghiên cứu để phát hiện đồng thời tồn dư nhóm Phenicol gồm Chloramphenicol (CAP), Thiamphenicol (TAP) và Florfenicol (FF) trong một số sản phẩm có nguồn gốc động vật. Trên thế giới, nhiều tác giả đã nghiên cứu thành công phương pháp xác định dư lượng CAP (Chloramphenicol) trong sữa bằng kỹ thuật sắc ký khác nhau. Gần đây với sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật sắc ký, áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ để phân tích CAP có nhiều ưu điểm nổi trội. Nhóm tác giả Yanbin Lu, Quing Shen [69] đã xác định được 13 SAs chỉ trong 7 phút với độ nhạy cao, LOQ từ 2-10 ppb bằng sự tương tác trực tiếp chiết pha rắn phân tán cột C18-Silica với sắc ký lỏng khối phổ chế độ bẫy tứ cực. Tác giả George Stubbings và cộng sự [39] đã ứng dụng kỹ thuật QuEChERS và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phát triển và thẩm định phương pháp phân tích dư lượng 30 thuốc thú y trong thịt gia súc, gia cầm. Ở trong nước, việc áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ để phát hiện dư lượng kháng sinh trong thực phẩm đã được triển khai. Kết quả nghiên cứu của Vũ Thị Trang [19] về việc xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) đã chỉ ra rằng phương pháp phân tích LC-MS/MS có độ nhạy cao, phân tích nhanh và chính xác, có thể áp dụng phân tích dư lượng 10 SAs với độ tin cậy cao. Hv: Vương Thanh Hương 14 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ Hình 1.4. Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS 1.4.1.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các bản kính hoặc bản kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Các mẫu được áp dụng chủ yếu là dược phẩm và một số loại thực phẩm như sữa, mật ong, thịt, cá, … Phương pháp này chủ yếu cho phép định tính sự hiện diện của các kháng sinh trong mẫu phân tích nhưng đôi khi cũng có thể xác định được lượng kháng sinh trong khoảng 0,4-0,6 μg/kg đối với Streptomycin, Kanamycin, Gentamycin [53], khi sử dụng các hệ dung môi thích hợp, ví dụ Acetone-MethanolAmmonia, 5:4,5:0,5 trong phân tích Streptomycin, Chloroform-MethanolAmmonia, 1:1:1 trong phân tích Tetracycline. Hv: Vương Thanh Hương 15 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ Ưu điểm của phương pháp khẳng định lý hóa: Nhận diện rõ ràng, khả năng định lượng tốt, có độ nhạy cao, thích hợp cho việc khẳng định các chất cấm, các chất có dư lượng tối đa cho phép. Nhược điểm của phương pháp khẳng định lý hóa: Qui trình rất phức tạp (chuẩn bị, tách chiết, làm sạch), đòi hỏi thiết bị đắt tiền, cần kỹ thuật viên chuyên nghiệp cao, một số kháng sinh không có qui trình phân tích bằng phương pháp này. Do vậy phương pháp này không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm quy mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương. 1.4.2. Phương pháp sử dụng kỹ thuật nano Công nghệ nano đã tạo ra các loại vật liệu thế hệ mới có nhiều đặc tính siêu việt. Ưu điểm nổi bật đối với việc sử dụng các cấu trúc nano trong tạo các cảm biến sinh học cho độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Hiện nay, việc ứng dụng các aptamer (là các oligonucleotide ssDNA, RNA hoặc các peptid có khả năng liên kết đặc hiệu với các phân tử đích) trong tạo cảm biến sinh học đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Lã Thị Huyền và cộng sự [11] đã công bố các kết quả cho thấy có thể sử dụng kỹ thuật nano để xác định sự có mặt của chất kháng sinh trong các mẫu nghiên cứu, cụ thể như: - Tạo được thư viện các aptamer (có bản chất ADN) có độ đa dạng cao để làm nguồn sàng lọc, thu nhận aptamer có khả năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với từng kháng sinh trong số 4 kháng sinh thường sử dụng trong chăn nuôi: Penicillin, Streptomycin, Neomycin và Tetracycline. - Thu nhận và gắn kết aptamer với các hạt nano (hạt nano vàng hoặc sillica phát quang) để tạo phức hệ DNA-Au/DNA-sillica có khả năng gắn kết đặc hiệu với từng kháng sinh: Penicillin, Streptomycin, Neomycin và Tetracycline. - Sử dụng phức hệ DNA-Au/DNA-sillica để tạo được KIT xác định nhanh, chính xác dư lượng kháng sinh Penicillin, Streptomycin, Neomycin và Tetracycline trong sữa với thời gian 1,5-2 giờ và độ nhạy > 99%, độ đặc hiệu > 98%. Ưu điểm: xác định chính xác dư lượng kháng sinh trong sữa với thời gian ngắn, độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hv: Vương Thanh Hương 16 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ Nhược điểm: Cần có trang thiết bị đắt tiền và đội ngũ cán bộ thực hiện được đào tạo chuyên sâu. 1.4.3. Phương pháp sàng lọc (screening method) Đây là phương pháp được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của một hoặc một nhóm chất ở một nồng độ quan tâm hay để phân biệt giữa các mẫu đạt và mẫu không đạt yêu cầu vệ sinh. Phương pháp này thường được thiết kế để tránh tối đa kết quả âm tính giả. Trong chiến lược phân tích tồn dư, phương pháp sàng lọc thường được tiến hành trước khi định danh và định lượng chính xác. 1.4.3.1. Phương pháp sắc ký miễn dịch Hiện nay các test nhanh trên cơ sở sắc ký miễn dịch được sử dụng để phát hiện nhanh và tương đối chính xác các loại kháng sinh trong sữa ngay tại địa điểm thu mua, cho kết quả trong thời gian ngắn (khoảng 1-2 phút). Test thường ở dạng que thử, được sử dụng phổ biến, rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Que thử dạng sắc kí miễn dịch dựa trên cơ sở phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại test thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch như: - Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa thuộc nhóm -lactam của hãng Ar Brown - Nhật Bản cho kết quả sau 5 phút với độ nhạy từ 3-20 ppb tùy từng loại kháng sinh như với Penicillin 3 ppb, Ceftiofur 5ppb, Cloxacillin 4ppb,... - Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa thuộc các nhóm lactam, Tetracycline, Streptomycin, Chloramphenicol của hãng Ballya - Trung Quốc cho kết quả chỉ sau 3-5 phút với độ nhạy từ 0,3-100 ppb tùy từng loại kháng sinh như Penicillin G 1,5-2ppb, Tetracycline 10 ppb, Streptomycin 100 ppb, Chloramphenicol 03 ppb,… - Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh thuộc nhóm Sulfonamides trong sữa của hãng Nankai Biotech - Trung Quốc cho kết quả sau 10 phút với độ nhạy từ 3-30 ppb tùy từng loại kháng sinh, nhóm Beta-lactams từ 2-4 ppb trong 5 phút, … Hv: Vương Thanh Hương 17 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ Ưu điểm: Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao; phát hiện được nhiều nhóm kháng sinh trong sữa, cho kết quả nhanh, có thể sử dụng các mẫu khác nhau, bán định lượng; thích hợp dùng để kiểm soát nguyên liệu đầu vào. Nhược điểm: Giá thành nguyên liệu cao, có thể phản ứng chéo. Hình 1.5. Một số loại que thử sắc ký miễn dịch 1.4.3.2. Phương pháp ELISA: Vài năm gần đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên - kháng thể đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên - kháng thể trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Phương pháp ELISA có khả năng phát hiện hầu hết những chất kháng sinh thường có mặt trong thực phẩm như nhóm Beta-lactams, nhóm Chloramphenicol, nhóm Macrolides, nhóm Tetracyclines, nhóm Aminoglycosides, nhóm Sulphonamides. Hv: Vương Thanh Hương 18 Lớp: K23-QH2014