Tài liệu NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG KẾT HỢP ENZYME TRONG QUÁ TRÌNH TRIẾT TÁCH VÀ LÀM GIẦU MỘT SỐ SẢN PHẨM NGUỒN GỐC THIÊN NHIÊN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HOÀNG THỊ BÍCH Nghiªn cøu sö dông kÕt hîp enzyme trong chiÕt t¸ch vµ lµm giµu mét sè s¶n phÈm nguån gèc thiªn nhiªn Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất tự nhiên Mã số: 62.44.01.17 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC HÀ NỘI - 2017 Công trình được hoàn thành tại Học viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Lê Mai Hương 2. PGS. TS. Nguyễn Quyết Chiến Phản biện 1: ................................................................ ............................................................... Phản biện 2:................................................................. ................................................................ Phản biện 3:................................................................. ................................................................ Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Vào hồi...... giờ.....’, ngày..... tháng..... năm 201..... Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ô nhiễm môi trường cũng như sức khỏe người tiêu dùng đã dẫn đến nhu cầu cấp thiết là tìm ra các phương pháp thu nhận các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên theo hướng “Xanh” nhằm tăng năng suất, giảm thời gian, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu và giảm ô nhiễm môi trường. Nguồn tài nguyên thiên nhiên của Việt Nam vô cùng phong phú với hệ thực vật đặc trưng và nguồn sinh vật biển đa dạng, trong đó phải kể đến cây Quế (nguồn dược liệu) và cá ngừ (nguồn lợi thủy sản) là những mặt hàng có giá trị kinh tế, giá trị sử dụng và giá trị xuất khẩu đầy tiềm năng. Sản phẩm dầu từ quế và cá ngừ ngày càng được chú trọng bởi chúng có giá trị cao. Tuy nhiên trong công nghiệp, quá trình sản xuất hai loại dầu này vẫn sử dụng các phương pháp truyền thống (cất cuốn hơi nước, ép nhiệt) chưa phát huy được hết hiệu quả chiết xuất, gây lãng phí nguồn nguyên liệu. Ngày nay, những tiến bộ trong công nghệ sinh học, công nghệ enzyme có khả năng sản xuất một lượng lớn enzyme có hoạt lực cao, phổ cơ chất rộng... thì công nghệ “XANH” ứng dụng enzyme hỗ trợ quá trình chiết xuất các hợp chất thiên nhiên (enzyme assisted extract- EAE) nhằm tăng hiệu suất, thay thế dung môi hữu cơ là vấn đề cấp thiết. Nhằm mục đích phát triển hướng nghiên cứu mới- phân lập và làm giàu các HCTN bằng enzyme hỗ trợ, chúng tôi lựa chọn đề tài luận án: “Nghiên cứu sử dụng kết hợp hệ enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên”. 2 Mục đích Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme vào quá trình chiết xuất và làm giàu các sản phẩm tinh dầu (từ lá và cành quế, vỏ quế Cinnamomum cassia) và các axit béo n-3PUFA từ phụ phẩm đầu cá ngừ nhằm làm tăng hiệu quả và phát triển hướng nghiên cứu “XANH” trong khai thác các SPTN. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia: tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme được đánh giá qua hiệu suất, thời gian chưng cất, chất lượng sản phẩm tinh dầu (thành phần hóa học, hoạt tính sinh học). - Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp LaccaseHtec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna - Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares: tác động của enzyme lên quá trình được đánh giá qua thành phần axit béo n-3 PUFA Những đóng góp mới của luận án Lần đầu tiên, ứng dụng công nghệ enzyme hỗ trợ quá trình chưng cất tinh dầu từ cảnh lá quế, vỏ quế C. cassia và gỗ gió bầu A. crassna. Sự kết hợp enzyme laccase từ G. lucidum và enzyme Cellic Htec2 cho quá trình thủy phân hiệu quả hơn khi sử dụng riêng rẽ. Kết quả đã làm gia tăng hiệu suất, nâng cao chất lượng tinh dầu, giảm thời gian chưng cất. Lần đầu tiên, ứng dụng công nghệ hỗ trợ quá trình phân lập dầu và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ phụ phẩm đầu cá ngừ bằng 3 hệ enzyme kép Bromelain và Lipase CRL. Kết quả phân lập cho hiệu suất 70% so với phương án dung môi song quá trình đã tạo ra sản phẩm có giá trị gia tăng, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu đồng thời giảm thiểu dung môi hóa chất và ô nhiễm môi trường. Bố cục của luận văn: Luận án gồm có 153 trang (không kể phụ lục), gồm 55 hình, 32 bảng. Nội dung chính của luận án được trình bày gồm 4 chương chính (ngoài Mở đầu-2 trang, kết luận- 2 trang và kiến nghị-1 trang); các chương chính bao gồm: Tổng quan tài liệu -38 trang, Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu -11 trang, Thực nghiệm -11 trang và Kết quả và thảo luận -63 trang. PHẦN 1 - TỔNG QUAN Trong phần này, đã tổng hợp tài liệu, chia làm 5 mục. 1.1. Tổng quan giới thiệu về ứng dụng công nghệ enzyme giải pháp “hóa học xanh” trong chiết xuất và làm giàu các hợp chất thiên nhiên 1.2. Các enzyme sử dụng trong công nghệ EAE để trích ly dầu và làm giàu các axit béo n-3 PUFA 1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme trong chiết xuất và làm giàu các hợp chất thiên nhiên trong và ngoài nước. 1.4. Giới thiệu về nguyên liệu sản xuất tinh dầu quế 1.5. Giới thiệu về nguyên liệu phụ phẩm cá ngừ sản xuất n-3 PUFA 4 PHẦN 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu - Cành lá quế, vỏ quế Cinnamomum cassiathu tại xã Tân Đồng, huyện Trấn Yên, tỉnh Yên Bái. - Phụ phẩm đầu cá ngừ:08 mẫu đầu cá ngừ (đã bỏ mắt và mang) của 08 loài cá ngừ thu tại Nha Trang- Khánh Hòa và Tuy HòaPhú Yên - Enzyme sử dụng trong nghiên cứu + Enzyme Cellic Htec2 (Novozyme-Đan Mạch) là hỗn hợp đa enzyme bao gồm cellulase và xylanase. + Enzyme laccase là enzyme thô thu từ canh trường nuôi cấy nấm Ganoderma lucidum (được cung cấp bởi Viện Di truyền nông nghiệp). + Nhóm enzyme protease từ vi sinh vật sử dụng hai enzyme Protamex và Alcalase (Novozyme- Đan Mạch). + Nhóm enzyme Protease từ thực vật sử dụng hai enzyme Bromelain và Papain, là enzyme trong nước, cung cấp bởi công ty Biogreen. + Enzyme Lipase CRL (Novozyme- Đan Mạch) được sản xuất từ quá trình lên men của nấm men Candida rugosa. 2.3. Phương pháp nghiên cứu: trong phần này NCS trình bày các phương pháp xác định - Các phương pháp phân tích hóa sinh + Nguyên liệu thực vật: phân tích hàm ẩm, cellulose, hemicellulose, lignin, hàm lượng tinh dầu,... + Nguyên liệu sinh vật biển: xác định hàm lượng nước, hàm lượng protein, hàm lượng tro, hàm lượng lipid, chỉ số axit, chỉ số xà phòng hóa,... 5 - Phương pháp phân tích thành phần hợp chất bằng GC-MS. + Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng tinh dầu. + Phương pháp xác định thành phần, hàm lượng axit béo. - Phương pháp xác định sản phẩm quá trình thủy phân + Phương pháp định lượng đường khử bằng DNS (Miler, 1959). + Phương pháp định lượng protein- axitamin (Bradford, 1976). - Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme + Xác định hoạt độ enzyme Cellulase (Wood, 1987). + Xác định hoạt độ enzyme Xylanse (Bailey, 1992). + Xác định hoạt độ enzyme Laccase (Dinh, 2012). - Các phương pháp thủy phân + Phương pháp thủy phân với dung môi là nước (áp dụng cho enzyme cellulase, hemicellulase, protease...). + Phương pháp thủy phân trong hệ dung môi hai pha (áp dụng cho enzyme lipase) theo (Fernádez Lorente G. và cs.;2011). - Phương pháp xác định điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân + Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân. + Xử lý số liệu thực nghiệm bằng phương pháp bình phương tối thiểu. + Tối ưu hóa quá trình thủy phân bằng bằng phương pháp qui hoạch hóa thực nghiệm. - Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học + Phương pháp xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định (Vander Bergher & Vlietlinck, 1991). + Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity) (Likhitayawuid, 1991) đang triển khai tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia Mỹ (NCI). 6 + Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm: thông qua khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 (Lee et al., (2009)). + Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóatrên hệ DPPH theo phương pháp P. Yuvaraj et al., (2013). PHẦN 3 - THỰC NGHIỆM 3.1. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia 3.2. Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna 3.3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares PHẦN 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia 4.1.1. Kết quả phân tích chất nền và tinh dầu cành lá, vỏ quế C. cassia Hàm lượng các chất nền của cành lá và vỏ quế C. cassia Kết quả phân tích cho thấy mẫu cành, lá và mẫu vỏ quế mang đặc trưng của nhóm cây thân gỗ với thành phần chủ yếu là lignocellulose, chiếm hơn 60% khối lượng nguyên liệu. Hàm lượng các thành phần cấu trúc gồm cellulose, hemicellulose và lignin xác định được ở mẫu cành, lá có các giá trị tương ứng là 24,74%; 25,50% và 16,28%; ở mẫu vỏ quế là 20,36%, 14,02% và 25,78%. 7 Hàm lượng và thành phần hóa học của tinh dầu từ cành lá, vỏ quế C. cassia Hàm lượng tinh dầu cành lá quế, vỏ quế thu được bằng chưng cất hơi nước tương ứn là 0,69 ± 0,02%, 2,87 ± 0,04% tinh dầu (tính theo nguyên liệu khô gió). Thành phần hóa học của tinh dầu cành lá quế và vỏ quế xác định bằng GC-MS chỉ ra ở Bảng 4.2: Bảng 4.2. Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu cành lá và tinh dầu vỏ quế C. cassia Chất Nhóm các hidrocarbon Nhóm các HC chứa oxy Tổng Phenylpropannoid trans- Cinnamaldehyde Tổng Sesquiterpenoid Sesquiterpen hidrocarbon Sesquiterpen chứa oxy % trong TD cành, lá 3,87 95,54 88,73 67,74 2,42 1,99 0,43 % trong TD vỏ 38,26 60,85 58,83 53,99 40,38 35,87 4,51 Một số thành phần trong tinh dầu quế C. cassia thu thập ở Văn Yên, Yên Bái (hình 4.1a và 4.1b). Benzenepropanal (C9H10O) trans-Cinnamaldehyde (C9H8O) Cinnamyl alcohol (C9H10O) Coumarin (C9H6O2) cis-Cinnamaldehyde (C9H8O) o-Methoxy cinamaldehyde Hình 4.1a. Một số thành phần thuộc nhóm phenylpropanoid 8 Copaene (C15H24) Muurolene (C15H24) Calamenene (C15H22) Cadinene (C15H24) Caryophyllene oxide ( C15H24O) Bisabolol (C15H26O) Bisabolene ( C15H24) Nerolidol (C15H26O) Hình 4.1b. Một số thành phần sesquiterpen và sesquiterpenoid Kết quả GC- MS phân tích thành phần hóa học của tinh dầu cành lá quế và vỏ quế C. cassia cho thấy: - Khoảng 28 hợp chất được tìm thấy trong tinh dầu cành lá quế C. cassia, trong đó trans-cinnamaldehyde là hợp chất chính (69,74%), theo sau là Cinnamyl acetate (17,2%), Benzofuran (5,9%), Benzaldehyde (1,62%), Benzenepropanal (1,59%). Ngoài ra, một số các thành phần khác cũng được xác định với hàm lượng nhỏ hơn 1,00%. - Khoảng 38 hợp chất được phát hiện trong tinh dầu vỏ quế C. cassia, trong đó trans- cinnamaldehyde là hợp chất chính (53,99%), theo sau là Copaene (13,86%), Cadinene (7,69%), Benzenpropanal (2,39%). Ngoài ra, một số các thành phần khác cũng được xác định với hàm lượng nhỏ hơn 1,00%. - Phenylpropanoid là nhóm hợp chất chủ yếu trong tinh dầu cành lá quế và vỏ quế C. cassia thu từ Văn Yên, Yên Bái, trong đó trans-cinnamaldehyde là thành phần chính. Tổng của các hợp chất hydrocarbon, của các hợp chất chứa oxy, của các phenylpropanoid và của các sesquiterpenoid có sự khác nhau rõ rệt giữa nguyên liệu cành lá quế và vỏ quế. 9 4.1.2. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá trình chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hiệu suất thu hồi tinh dầu và mức độ thủy phân các chất nền của cành lá quế Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân và tỷ lệ gia tăng tinh dầu cành lá quế Sự gia tăng của hiệu suất tinh dầu có tương quan tỉ lệ thuận với sự gia tăng của hàm lượng đường khử (0-78,14 μg/ml) trong dung dịch phản ứng cũng như sự giảm thiểu của hàm lượng lignin trong nguyên liệu (17,43-13,01%).Kết quả cũng chỉ ra hệ enzyme Laccase thô và Htec2 cho hiệu quả cao hơn khi sử dụng riêng rẽ từng enzyme lên cành lá quế. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thời gian chưng cất tinh dầu cành lá quế Hình 4.3. Ảnh hưởng của thời gian cất đến hiệu suất thu tinh dầu lá quế 10 Quá trình xử lý cành lá quế bằng hỗn hợp enzyme Laccase và Htec2 đã làm giảm đáng kể thời gian cất tinh dầu so với đối chứng không sử dụng enzyme. Tại các thời điểm khác nhau của quá trình chưng cất: 2h, 3h, 4h... lượng tinh dầu thu từ mẫu cành lá quế xử lý bằng enzyme đều cao hơn so với không xử lý enzyme. Tinh dầu cất bằng EAD, sau 2 h đầu đã thu được hơn 50% lượng tinh dầu, sau 5 h lượng tinh dầu đạt đến cực đại (0,98%). Trong khi đó, đối với phương pháp không sử dụng enzyme sau 2h đầu mẫu đối chứng chỉ đạt 9 - 10%, sau 6 h lượng tinh dầu mới đạt đến cực đại (0,69%). Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thành phần hóa học của tinh dầu cành lá quế Thành phần hóa học tinh dầu cành lá quế C. cassia được phân tích bằng GC-MS, được tổng hợp ở bảng 4.5 Bảng 4.5. Thành phần hóa học của các tinh dầu cành lá quế thu nhận từ phương pháp enzyme kết hợp Không enzyme Laccase Htec2 Laccase +Htec2 Nhóm hidrocarbon 3,58 5,13 1,75 4,04 Nhóm HC chứa oxy 95,54 94,17 97,39 94,85 Nhóm Phenylpropanoid 88,73 88,38 94,03 91,25 trans-cinnamaldehyde 69,74 68,96 70,54 85,60 Nhóm Sesquiterpenoid 2,42 3,83 0,83 3,9 Sesquiterpen hidrocarbon 1,99 3,36 0,61 3,26 Sesquiterpen chứa oxy 0,43 0,47 0,22 0,64 Chất 11 So sánh kết quả phân tích GC-MS của cả 4 phương án xử lý cho thấy, quá trình tiền xử lý cành lá quế bằng enzyme đã không làm thay đổi bản chất của tinh dầu vỏ quế, các mẫu tinh dầu đều có thành phần chính là cinnamaldehyde và có cùng số lượng các thành phần quan trọng khác. Nhóm phenylpropanoid (C6- C3) vẫn là nhóm chất chính trong cả 4 phương án xử lý, trong đó trans-cinnamaldehyde là thành phần chính có hàm lượng đạt từ 68,49% đến 86,83%. Tinh dầu thu được bằng cách xử lý nguyên liệu với các enzyme Laccase và HTec2 riêng rẽ không gây ra biến động lớn về thành phần hóa học, nhưng việc xử lý nguyên liệu với hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 đã làm thay đổi rõ rệt nhất thành phần % của một số chất quan trọng trong tinh dầu. Cụ thể như sau: - Làm giàu một số chất mong muốn trong tinh dầu quế C. cassia như: hàm lượngcinnamaldehyde tăng từ 69,74% lên 85,60%, o-methoxy-cinnamaldehyde từ 0% lên 0,23%. - Làm giảm hàm lượng một số chất khác, đặc biệt cinnamyl acetat giảm từ 17,2% xuống 1,34%, cinnamyl alcohol giảm từ 0,57% xuống 0,29%. Sự tăng và giảm của cinnamaldehyde và cinnamyl acetat có thể có mối liên hệ mật thiết với nhau. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hoạt tính sinh học của tinh dầu cành lá quế - Kết quả xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Mẫu tinh dầu có sử dụng enzyme hỗ trợ (Tinh dầu EAD) không có sự sai khác về hoạt tính kháng khuẩn so với mẫu chiết thông thường. Các mẫu tinh dầu quế đều không có hoạt tính kháng P.aeruginosa và F. oxysporum., có hoạt tính kháng S. aureus với 12 MIC = 100 μg/ml, A. niger với MIC = 200 μg/ml trong khi E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, C. albicans là MIC = 400 μg/ml. Trong số các vi sinh vật kiểm định, tinh dầu có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối với S. aureus với MIC 100 µg/ml. - Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào Hai mẫu tinh dầuđều có hoạt tính gây độc tế bào với nồng độ thử nghiệm ban đầu (40 g/ml). Ở các nồng độ thử nghiệm tiếp theo, tinh dầu HD biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào với 02 dòng tế bào ung thư gan và ung thư biểu mô liên kết (Hep-G2 và RD) với giá trị IC50 lần lượt là 29,25 và 6,01 g/ml, trong khi tinh dầu EAD biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với 3 dòng tế bào ung thư (Hep-G2, LU-1 và RD) với giá trị IC50 lần lượt là 12,89, 25,95 và 2,34 g/ml. Đặc biệt, EAD có hoạt tính khá mạnh trên dòng ung thư biểu mô phổi với giá trị IC50 2,34(g/ml). - Kết quả xác định hoạt tính kháng viêm Cả hai mẫu tinh dầu đều thể hiện hoạt tính ức chế đại thực bào sản sinh NO ở các khoảng nồng độ từ 6,25 đến 100 μg/ml (P < 0.05 với LPS đối chứng âm), tinh dầu EAD có biểu hiện hoạt tính kháng viêm mạnh hơn tinh dầu HD. - Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa Hai mẫu tinh dầu thử nghiệm chưa thể hiện khả năng trung hòa gốc tự do của DPPH ở nồng độ nghiên cứu. 4.1.3. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá trình chưng cất tinh dầu từ vỏ quế C. cassia Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hiệu suất thu hồi tinh dầu và mức độ thủy phân các chất nền của vỏ quế 13 Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân và tỷ lệ gia tăng tinh dầu vỏ quế Kết quả cho thấy mối tương quan rõ rệt giữa mức độ thủy phân thành tế bào và tỷ lệ gia tăng tinh dầu vỏ quế C. cassia. Lần lượt từ phương án 01 đến 04, hàm lượng đường khử gia tăng từ 0 lên đến 38,34 µg/ml, còn hàm lượng lignin giảm từ 25,78 xuống còn 20,34%. Phương án 04, kết hợp 2 enzyme Laccase và Htec2 cho hiệu quả thủy phân cao nhất với hàm lượng đường khử là 38,34 µg/ml và tỷ lệ gia tăng hiệu suất tinh dầu đạt 14,57%. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thời gian chưng cất tinh dầu vỏ quế Hình 4.6. Ảnh hưởng của thời gian cất đến hiệu suất thu tinh dầu vỏ quế 14 Cũng tương tự như cành lá quế, kết quả khảo sát trên vỏ quế cho thấy hệ enzyme Laccase + Htec2 có vai trò tích cực trong việc giảm thời gian chưng cất tinh dầu quế. Tại các thời điểm khác nhau của quá trình chưng cất: 2h, 3h, 4h... lượng tinh dầu thu từ mẫu vỏ quế xử lý bằng enzyme đều cao hơn so với không xử lý enzyme. Sau 6h chưng cất, lượng tinh dầu đạt cực đại (3,28%) trong khi đó sau 8h mẫu không xử lý enzyme mới đạt cực đại (2,87%). Kết quả đánh giá tác động của các hệ enzyme lên thành phần hóa học tinh dầu vỏ quế Bảng 4.9. Thành phần hóa học của các tinh dầu vỏ quế thu được từ các nguyên liệu được xử lý với các hệ enzyme khác nhau Không enzyme Laccase Htec2 Laccase +Htec2 Nhóm hidrocarbon 38,26 26,52 26,29 27,26 Nhóm HC chứa oxy 60,85 71,47 70,35 72,02 Tổng Phenyl propanoid 58,83 65,97 65,73 70,98 trans-cinnamaldehyde 53,99 59,22 58,36 67,6 Tổng sesquiterpen 39,29 30,98 29,85 27,44 Sesquiterpen hidrocarbon 35,87 24,64 24,28 25,08 Sesquiterpen chứa oxy 3,42 6,34 5,57 2,36 Chất So sánh thành phần GC-MS của cả 4 phương án xử lý cho thấy quá trình tiền xử lý vỏ quế bằng enzyme đã không làm thay đổi bản chất của tinh dầu quế, các mẫu nghiên cứu đều có thành phần chính là cinnamic aldehyde và có cùng số lượng các thành phần quan trọng khác, ít có sự biến động về tỷ lệ nhóm các hidrocarbon và các hợp chất chứa oxy, tỷ lệ phenylpropanoid và sesquiterpen. Đặc biệt, quá trình (Laccase + Htec2)- EAD có sự gia tăng của hàm lượng chất chínhcinnamic aldehyde tăng từ 54,63% % lên 68,37%. 15 4.1.4. Kết quả tìm điều kiện tối ưu cho quá trình ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ cành lá quế Qua phân tích các yếu tố ảnh hưởng, chọn 5 yếu tố ảnh hưởng gồm: pH, nhiệt độ T, thời gian t, tỷ lệ enzyme laccase/cơ chất, tỷ lệ enzyme Htec2/cơ chất. Sử dụng phần mềm Design Expert 7.0 để xử lý số liệu ta nhận được kết quả phương trình hồi qui: = 79,73 + 0,48 x1 + 0,56x2 + 1,66 x3 + 2,19 x4 + 0,44 x1x5 0,44 x2x3 - 0,44 x2x4 - 0,69 x3x4 - 1,98 x12 - 1,84 x22 - 1,83 x32 - 1,26 x42 -1,29 x52 Bằng phần mềm trên đã tiến hành xem xét mô tả ảnh hưởng của từng cặp tương tác, đều được mô tả dạng paraboloid tức có điểm cực trị. Hình 4.9. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của từng cặp yếu tố Như vậy, điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân cành lá quế bằng hệ enzyme Laccase + Htec2 là pH 5,2, nhiệt độ 440C, Laccases/S = 0,42ml/g, Htec2/S= 1,15%, thời gian 5h30 phút Đề xuất quy trình công nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia (hình 4.10) 16 Cành lá quế Xay, nghiền Tiền xử lý H2O/24h Ủ Laccase/S 0,42 ml/g, Htec2/S 1,15%, nhiệt độ 440C, pH 5.2, thời gian 5h30’, tốc độ 200 rpm, Thủy phân Chưng cất tinh dầu Tinh dầu+ Nước Bã nguyên liệu Na2SO4 Tinh dầu Cassia Phân bón Hình 4.10. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec trong chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia 4.2. Kết quả thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna Kết quả phân tích thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu A. crassna Kết quả xác định các thành phần kiến tạo nên khung cấu trúc của gỗ gió bầu cho thấy gỗ gió bầu mang các đặc trưng của nguyên liệu chứa lignocellulose bao gồm cellulose 34,75%, hemicellulose 15,27% và lignin 29,10%. 17 Kết quả thăm dò tác động hệ enzyme Laccase - Htec2 lên hàm lượng và thành phần tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna Dựa trên các kết quả thu được khi nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chưng cất tinh dầu quế, chúng tôi đã chọn hệ enzyme LaccaseHtec2 để áp dụng cho việc chưng cất tinh dầu trầm hương. Kết quả sau 3 ngày chưng cất, mẫu đối chứng (mẫu không có enzyme) cho 0,024% tinh dầu (tính theo khối lượng mẫu khô gió), mẫu nghiên cứu (mẫu có enzyme) cho 0,032% tinh dầu, tỷ lệ gia tăng tinh dầu Thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu được xác định bằng phương pháp GC-MS. Một số thành phần đặc trưng của tinh dầu trầm hương. Hình 4.11. Một số thành phần đặc trưng của tinh dầu trầm hương - Hàm lượng của các thành phần có giá trị, mang mùi trầm hương đặc trưng (Hình 4.11b) cũng tăng lên rõ rệt, cụ thể cisdihydroagarofuran (0,11%, đối chứng 0%), α-agarofuran (0,17%, đối chứng 0%), agarospirol (0,72%, đối chứng 0,23%), hinesol (0,56%, đối chứng 0,16%), valerianol (2,59%, đối chứng 0,89%), neopetasone (0,76%, đối chứng 0,11%), tổng các terpen hydrocarbon (3,70%, đối chứng 0%), tổng các terpen chứa oxy (24,76%, đối chứng 8,78%). 18 - Các axit béo và dẫn xuất của chúng là các thành phần không mong muốn trong tinh dầu trầm hương. Trong mẫu nghiên cứu, hàm lượng của chúng chỉ còn 22,89%, ít hơn hẳn so với đối chứng là 59,85%. - Tổng số các chất chưa được xác định (unknown) trong kết quả phân tích tinh dầu trầm hương là rất cao, vì thế cần có các nghiên cứu hóa học tiếp theo để làm rõ. 4.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares 4.3.1. Kết quả nghiên cứu các chất nền và thành phần axit béo của một số loại đầu cá ngừ của Việt Nam Kết quả nghiên cứu các chất nền Hàm lượng protein của các mẫu đầu cá ngừ dao động trong khoảng 17 - 20%, tương ứng với 40 - 50% protein tính theo lượng chất khô. Hàm lượng lipid của các mẫu dao động trong khoảng 4,5 14,8%, cao nhất là nhóm cá ngừ đại dương có kích thước lớn (500 2.000 mm) như cá ngừ vây vàng (14,8%), cá ngừ mắt to (14,2%). Kết quả phân tích thành phần axit béo Bảng 4.13. Thành phần axit béo trong các mẫu lipid thu được từ đầu một số loài cá ngừ của Việt Nam Ngừ ồ Ngừ chù Ngừ chấm Ngừ vằn Ngừ bò Sọc dưa Vây vàng Mắt to Tổng SFA 33,44 39,59 39,04 33,76 35,45 38,59 22,74 37,43 Tổng MUFA 35,05 24,78 25,97 29,65 24,21 22,63 28,86 19,33 Tổng PUFA 31,49 35,63 34,77 36,34 39,94 38,28 48,36 40,5 n-3PUFA 25,35 26,86 24,28 29,4 32,89 30,18 37,82 34,84 EPA+DHA+DPA 25,35 26,55 24,28 28,27 31,79 29,83 39,15 34,84 Hệ số đánh giá 114,08 136,99 133,54 217,30 343,98 263,12 559,74 494,73 Axit béo (% / lipid tổng) * Qua hệ số đánh giá cho thấy 03 loài cá ngừ có triển vọng trong việc sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất dầu cá chất lượng cao giàu n-3